Инструментарий, позволяющий конверсии углеводородов в водной среде
Summary
Устойчивое авто регулирующих бактериальные системы для восстановления нефтяных загрязнений была разработана с использованием стандартных взаимозаменяемых частей ДНК (BioBricks). Инженерии<em> E. палочки</em> Штамма был использован для ухудшают алканов с помощью β-окисления токсичных водной среде. Соответствующих ферментов из различных видов показало, алканов деятельности деградации. Кроме того, повышение толерантности к<em> П</em>-Гексан было достигнуто путем введения генов от алкан-толерантный бактерий.
Abstract
Эта работа выдвигает набор инструментов, который позволяет превращения алканов кишечной палочки и представляет собой доказательство принципа его применимости. Оно состоит из нескольких стандартных взаимозаменяемых частей (BioBricks) 9 адресации преобразования алканов, регуляции экспрессии генов и выживания в токсичные богатой углеводородами окружающей среды.
Трехступенчатый путь к деградации алкана был реализован в E. палочки для того, чтобы преобразования средне-и долгосрочной цепи алканов в соответствующие спирты, alkanals и в конечном итоге алкановых кислот. Последние были усвоены через родной β-окисления пути. Для облегчения окисления средней цепи алканов (C5-C13) и циклоалканов (С5-С8), четыре гена (alkB2, rubA3, rubA4 и Rubb) из алкана системы гидроксилазы от Гордония зр. TF6 8,21 были преобразованы в E. палочки. Для преобразованиядлинной цепи алканов (С15-С36), ген ЛАДА Geobacillus thermodenitrificans был реализован. Для необходимые дальнейшие шаги процесса деградации, АДГ и ALDH (исходящие из G. thermodenitrificans) были введены 10,11. Деятельность измеряли отдыха анализов клеток. Для каждого окислительного шаг, активность фермента не наблюдалось.
Для оптимизации эффективности процесса, выражение было только индуцированных в условиях низкой глюкозы: субстрат-регулируемого промотора, pCaiF, был использован. pCaiF присутствует в E. палочки K12 и регулирует экспрессию генов, участвующих в деградации неглюкозными источников углерода.
В последней части инструментария – таргетинг выживания – был реализован с использованием растворителя генов толерантности, PhPFDα и β, как с Pyrococcus horikoshii OT3. Органические растворители могут вызывать клеточный стресс и снижение живучести отрицательно affectinг сворачивания белка. В качестве сопровождающих, PhPFDα и β улучшения сворачивания белка, например, процесс в рамках присутствии алканов. Экспрессии этих генов привела к улучшению толерантности углеводородного показали повышение темпов роста (до 50%) в присутствиях 10% н-гексана в культуральной среде не наблюдается.
Подводя итоги, результаты показывают, что инструментарий позволяет E. палочки для преобразования и терпеть углеводородов в водной среде. Как таковая, она представляет собой первый шаг на пути устойчивого решения для нефти реабилитации с использованием синтетического подхода биологии.
Introduction
Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities 3. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil 1. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving 3.
To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged 1. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule 7, 21. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids 8. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.
The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C5-C13 alkanes along with that of C5-C8 cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) 8, 21. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C15 up to C36) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway 7, 21. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD+ as a cofactor 10. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD+-dependent final step in the medium-chain oxidation 11.
In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels 6. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components 6, 14.
Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems 12. Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance 17.
The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts 9. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Принцип BioBrick используется для создания шасси для деградации алканов и доказательство принципа для отдельных компонентов набора инструментальных средств было получено. Несколько анализов предлагается измерять в естественных условиях и в пробирке деятельности алкана ферме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
В экспериментах, проведенных в этом видео-статьи были разработаны для международного генно-инженерных машин конкуренции 9. Авторы хотели бы поблагодарить членов ИГЕМ команды Лука Bergwerff, Питер ван TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Куэто Рохас и Рамон ван дер Валк для помощь в исследованиях. Мы благодарим Хан-де-Winde, Стефан де-Кок и Эсенгул Йылдырым за полезные обсуждения и проведения этого исследования. Эта работа была поддержана TU Delft University Отдел биотехнологии, биоинформатика Delft лаборатории, TU Delft департамента Bionanoscience, Oil Sands лидерство Initiative (OSLI), Стад studentenuitzendbureau, Нидерланды Genomics инициативы, Kluyver центр, Biotechnologische Nederlandse Vereniging (Stichting биотехнологии Nederland) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One и Genencor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| E. coli K12 | New England Biolabs | C2523H | |
| Octane | Fluka | 74822 | |
| Hexadecane | Fluka | 52209 | |
| octanol-1 | Fluka | 95446 | |
| dodecanol-1 | Sigma-Aldrich | 126799 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| FMN | Sigma | F2253 | |
| MgSO4 | J.T. Baker Casno | 7487 889 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Gas chromatograph | |||
| Cell disrupter | LA Biosystems | CD-019 | |
| Spectrophotometer | Amersham pharmacia | spec 2000 | |
| Plate reader | Tecan | Magellan v7.0 | |
| Incubator | Innova, 44 | ||
| BioBrick K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4– BBa_J61100-rubB |
Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398014 | Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398027 | ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398018 | ADH generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398030 | ALDH generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398326: pCaiF | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398326 | pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401 | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398331 | pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398406 | Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol |
References
- Allen, E. W. Process water treatment in Canada’s oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
- Alon, U. . An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , (2007).
- Center, O. P. . Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
- Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
- Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
- Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
- Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
- Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
- Kieboom, J., De Bont, J. a. M. . Bacterial Stress Responses. , (2000).
- Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355 (2010).
- Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
- Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
- Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
- Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
- Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
- Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
- Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
- Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).
