مجموعة أدوات لتمكين تحويل المواد الهيدروكربونية في البيئات المائية
Summary
تم تصميم نظام السيارات المستدامة تنظم البكتيرية لعلاج التلوث النفطي باستخدام معيار أجزاء DNA للتبادل (BioBricks). وهندسيا<em> E. القولونية</emوقد استخدم> للحط من سلالة الألكانات عبر الأكسدة β في البيئات المائية السامة. أظهرت الإنزيمات منها من الأنواع المختلفة ألكان النشاط التدهور. بالإضافة إلى ذلك، لزيادة التسامح<em> ن</emوقد تحقق-> الهكسان عن طريق إدخال جينات من البكتيريا التي تتحمل ألكان.
Abstract
هذا العمل يطرح مجموعة أدوات التي تمكن من تحويل الألكانات من الإشريكية القولونية، ويقدم دليلا على مبدأ إمكانية تطبيقه. مجموعة الأدوات يتكون من أجزاء متعددة قابلة للتبديل القياسية (BioBricks) 9 التصدي لتحويل الألكانات، وتنظيم التعبير الجيني والبقاء على قيد الحياة في البيئات الغنية الهيدروكربونية السامة.
تم تنفيذ مسار ثلاث خطوات لتدهور ألكان في E. الإشريكية لتمكين تحويل الألكانات متوسطة وطويلة السلسلة إلى alkanols كل منها، والأحماض alkanals alkanoic-في نهاية المطاف. ويستقلب هذا الأخير عبر مسار β للأكسدة الأصلية. لتسهيل أكسدة المتوسطة سلسلة الألكانات (C5-C13) وcycloalkanes (C5-C8)، وأربعة جينات (alkB2، rubA3، rubA4 والمطاطية) من نظام هيدروكسيلاز ألكان من Gordonia SP. تحولت TF6 8،21 في E. القولونية. لتحويلسلسلة طويلة الألكانات (C15-C36)، تم تنفيذ هذا الجين لادا من thermodenitrificans Geobacillus. لمزيد من الخطوات المطلوبة لعملية التدهور، وأدخلت ADH وALDH (القادمة من thermodenitrificans G.) 10،11. تم قياس النشاط المقايسات الخلية الراحة. لكل خطوة الأكسدة، لوحظ نشاط انزيم.
لتحسين كفاءة عملية، وكان المستحث فقط التعبير في ظل ظروف انخفاض الجلوكوز: تم استخدام الركيزة المروج التنظيم، pCaiF. pCaiF موجود في E. K12 القولونية وينظم التعبير عن الجينات المسؤولة عن تدهور مصادر الكربون غير الجلوكوز.
ونفذ باستخدام الجينات التسامح المذيبات، وPhPFDα β، وكلاهما من Pyrococcus horikoshii OT3 – الجزء الأخير من مجموعة الأدوات – استهداف البقاء. يمكن المذيبات العضوية لحث على الإجهاد وانخفاض الخلايا البقاء على قيد الحياة من قبل affectin سلباغرام من البروتين للطي. كما المحرمين، وPhPFDα β تحسين عملية مثل البروتين للطي في ظل وجود من الألكانات. وقد لوحظت التعبير عن هذه الجينات أدى إلى التسامح الذي أبداه الهيدروكربونية تحسين معدل زيادة النمو (إلى 50٪) في الوجود من 10٪ N-الهكسان في ثقافة المتوسط.
تلخيص، فإن النتائج تشير إلى أن مجموعة أدوات تمكن E. الإشريكية لتحويل وتحمل النفط والغاز في البيئات المائية. على هذا النحو، فإنه يمثل خطوة أولية نحو إيجاد حل مستدام لإصلاح النفطية باستخدام نهج البيولوجيا التركيبية.
Introduction
Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities 3. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil 1. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving 3.
To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged 1. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule 7, 21. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids 8. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.
The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C5-C13 alkanes along with that of C5-C8 cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) 8, 21. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C15 up to C36) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway 7, 21. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD+ as a cofactor 10. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD+-dependent final step in the medium-chain oxidation 11.
In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels 6. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components 6, 14.
Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems 12. Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance 17.
The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts 9. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستخدم مبدأ BioBrick لبناء هيكل للتدهور الألكانات وتم الحصول على دليل على مبدأ واحد للمكونات مجموعة الأدوات. ويقترح عدة فحوصات لقياس في الجسم الحي والنشاط في المختبر من الانزيمات ألكان مسار المهينة. العمل المقدم يوضح بنجاح عددا من الأساليب التي يمكن استخدامه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد وضعت التجارب التي أجريت في هذه المادة عن طريق الفيديو للمسابقة الدولية آلة المعدلة وراثيا 9. والكتاب أود أن أشكر أعضاء الفريق لوقا iGEM Bergwerff، بيتر فان TM Boheemen، Cnossen Jelmer، هوغو F. روخاس كويتو ورامون فان دير فالك ل المساعدة في البحث. نشكر هان دي Winde، ستيفان دي كوك ويلدرم Esengül للمناقشات مفيدة واستضافة هذا البحث. وأيد هذا العمل من قبل وزارة TU جامعة دلفت للتكنولوجيا الحيوية، والمعلوماتية الحيوية مختبر دلفت، TU دلفت إدارة Bionanoscience، زيت ساندز القيادة مبادرة (OSLI)، studentenuitzendbureau مسمار، هولندا مبادرة الجينوم، مركز Kluyver، Nederlandse Vereniging Biotechnologische (مؤسسة Stichting التكنولوجيا الحيوية هولندا) ، DSM، Geneart، غرينر الحيوي واحدة وGenencor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| E. coli K12 | New England Biolabs | C2523H | |
| Octane | Fluka | 74822 | |
| Hexadecane | Fluka | 52209 | |
| octanol-1 | Fluka | 95446 | |
| dodecanol-1 | Sigma-Aldrich | 126799 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| FMN | Sigma | F2253 | |
| MgSO4 | J.T. Baker Casno | 7487 889 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Gas chromatograph | |||
| Cell disrupter | LA Biosystems | CD-019 | |
| Spectrophotometer | Amersham pharmacia | spec 2000 | |
| Plate reader | Tecan | Magellan v7.0 | |
| Incubator | Innova, 44 | ||
| BioBrick K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4– BBa_J61100-rubB |
Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398014 | Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398027 | ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398018 | ADH generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398030 | ALDH generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398326: pCaiF | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398326 | pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401 | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398331 | pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398406 | Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol |
References
- Allen, E. W. Process water treatment in Canada’s oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
- Alon, U. . An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , (2007).
- Center, O. P. . Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
- Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
- Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
- Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
- Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
- Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
- Kieboom, J., De Bont, J. a. M. . Bacterial Stress Responses. , (2000).
- Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355 (2010).
- Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
- Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
- Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
- Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
- Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
- Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
- Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
- Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).
