Une boîte à outils pour permettre la conversion d'hydrocarbures en milieu aqueux
Summary
Un système de régulation automatique durable bactérienne pour l'assainissement des pollutions pétrolières a été conçu en utilisant des pièces interchangeables (ADN BioBricks). Une ingénierie<em> E. coli</em> Les contraintes a été utilisée pour dégrader les alcanes par β-oxydation dans des milieux aqueux toxiques. Les enzymes respectives de différentes espèces ont montré une activité dégradation alcane. En outre, une tolérance accrue à<em> N</em>-Hexane a été réalisée par l'introduction de gènes de bactéries résistantes alcane.
Abstract
Ce travail met en avant un ensemble d'outils qui permet la conversion d'alcanes par Escherichia coli et présente une preuve de principe de son applicabilité. La boîte à outils se compose de plusieurs éléments standards interchangeables (BioBricks) 9 portant sur la conversion d'alcanes, la régulation de l'expression génique et la survie des toxiques riches en hydrocarbures environnements.
Un parcours en trois étapes pour la dégradation de l'alcane a été mis en œuvre dans E. coli afin de permettre la conversion d'alcanes à moyen et à longue chaîne à leurs alcanols, alcanals respectives et, finalement, des acides alcanoïque. Ces derniers ont été métabolisé par le natif de β-oxydation voie. Pour faciliter l'oxydation des alcanes à chaîne moyenne (C5-C13) et de cycloalcanes (C5-C8), quatre gènes (alkB2, rubA3, rubA4 et Rubb) du système alcane hydroxylase de Gordonia sp. TF6 8,21 ont été transformés en E. coli. Pour la conversion desalcanes à longue chaîne (C15-C36), le gène de Lada thermodenitrificans Geobacillus a été mis en œuvre. Pour les autres étapes nécessaires du processus de dégradation, l'ADH et l'ALDH (provenant de thermodenitrificans G.) ont été introduites 10,11. L'activité a été mesurée par des dosages de cellules au repos. Pour chaque étape d'oxydation, l'activité enzymatique a été observée.
Afin d'optimiser l'efficacité des processus, l'expression n'a été induite dans des conditions hypoglycémie: un promoteur régulé substrat, pCaiF, a été utilisé. pCaiF est présent dans E. coli K12 et régule l'expression des gènes impliqués dans la dégradation de la source de carbone non-glucose.
La dernière partie de la trousse à outils – le ciblage de survie – a été mis en œuvre en utilisant des gènes de tolérance solvants, PhPFDα et β, deux de Pyrococcus horikoshii OT3. Les solvants organiques peuvent induire un stress cellulaire et une diminution de la survie par négativement affectinrepliement des protéines g. Comme chaperons, PhPFDα et β améliorer le processus de repliement des protéines, par exemple en présence d'alcanes. L'expression de ces gènes conduit à une tolérance améliorée d'hydrocarbures montré un taux de croissance élevé (jusqu'à 50%) dans les présences de 10% de n-hexane dans le milieu de culture ont été observés.
En résumé, les résultats indiquent que la boîte à outils permet E. coli à convertir et à tolérer les hydrocarbures dans les milieux aqueux. En tant que tel, il constitue une première étape vers une solution durable pour le pétrole-remédiation en utilisant une approche de biologie synthétique.
Introduction
Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities 3. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil 1. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving 3.
To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged 1. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule 7, 21. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids 8. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.
The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C5-C13 alkanes along with that of C5-C8 cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) 8, 21. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C15 up to C36) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway 7, 21. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD+ as a cofactor 10. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD+-dependent final step in the medium-chain oxidation 11.
In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels 6. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components 6, 14.
Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems 12. Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance 17.
The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts 9. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le principe BioBrick est utilisé pour construire un châssis pour la dégradation des alcanes et une preuve de principe pour les composants individuels de la boîte à outils a été obtenu. Plusieurs dosages sont proposés pour mesurer l'in vivo et in vitro l'activité des enzymes de la voie d'alcanes dégradantes. Le travail présenté démontre avec succès un certain nombre de méthodes qui peuvent être utilisées pour déterminer l'activité des enzymes et de l'expression dan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les expériences réalisées dans cette vidéo-article ont été développés pour la compétition machine génétiquement internationale 9. Les auteurs tiennent à remercier les membres de l'équipe iGEM Luc Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Rojas et Ramon Cueto van der Valk pour l'aide à la recherche. Nous remercions Han de Winde, Stefan de Kok et Esengül Yıldırım pour des discussions utiles et d'hébergement de cette recherche. Ce travail a été soutenu par le ministère de la TU Delft University of Biotechnology, Delft Le laboratoire de bioinformatique, TU Delft Département de Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), Stud studentenuitzendbureau, Pays-Bas Initiative en génomique, Kluyver Centre, Nederlandse Vereniging Biotechnologische (Stichting Nederland Biotechnologie) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One et Genencor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| E. coli K12 | New England Biolabs | C2523H | |
| Octane | Fluka | 74822 | |
| Hexadecane | Fluka | 52209 | |
| octanol-1 | Fluka | 95446 | |
| dodecanol-1 | Sigma-Aldrich | 126799 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| FMN | Sigma | F2253 | |
| MgSO4 | J.T. Baker Casno | 7487 889 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Gas chromatograph | |||
| Cell disrupter | LA Biosystems | CD-019 | |
| Spectrophotometer | Amersham pharmacia | spec 2000 | |
| Plate reader | Tecan | Magellan v7.0 | |
| Incubator | Innova, 44 | ||
| BioBrick K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4– BBa_J61100-rubB |
Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398014 | Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398027 | ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398018 | ADH generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398030 | ALDH generator Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398326: pCaiF | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398326 | pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401 | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398331 | pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol |
| BioBrick K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398406 | Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol |
References
- Allen, E. W. Process water treatment in Canada’s oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
- Alon, U. . An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , (2007).
- Center, O. P. . Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
- Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
- Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
- Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
- Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
- Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
- Kieboom, J., De Bont, J. a. M. . Bacterial Stress Responses. , (2000).
- Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355 (2010).
- Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
- Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
- Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
- Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
- Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
- Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
- Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
- Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).
