Een duurzame auto regelen van bacterieel systeem voor de sanering van olieverontreinigingen werd ontworpen met behulp van standaard verwisselbare DNA delen (BioBricks). Een aangelegde<em> E. coli</em> Stam werd gebruikt om alkanen via β-oxidatie afgebroken in toxische waterige omgevingen. De respectieve enzymen van verschillende soorten toonde alkaan degradatie activiteit. Daarnaast werd een verhoogde tolerantie voor<em> N</em>-Hexaan werd bereikt door genen van alkaan-tolerante bacteriën.
Dit werk voert een toolkit die de omzetting van alkanen in staat stelt door Escherichia coli en presenteert een proof of principle van de toepasbaarheid. De toolkit bestaat uit meerdere standaard verwisselbare onderdelen (BioBricks) 9 aanpakken van de omzetting van alkanen, regulatie van genexpressie en overleving in toxische koolwaterstof-rijke omgevingen.
Een drie-stap route voor alkaan afbraak werd in E. coli de omzetting van middellange-en lange-keten alkanen hun respectieve alkanolen, alkanalen en uiteindelijk alkaanzuren-zuren toestaat. Zij werden omgezet via het natieve β-oxidatie pathway. De oxidatie van middellange-keten alkanen (C5-C13) en cycloalkanen (C5-C8), vier genen (alkB2, rubA3, rubA4 en Rubb) van het alkaan hydroxylase systeem Gordonia sp vergemakkelijken. TF6 8,21 werden getransformeerd in E. coli. Voor de omzetting vanlangketenige alkanen (C15-C36), werd het gen van Lada Geobacillus thermodenitrificans uitgevoerd. Voor de vereiste verdere stappen van het afbraakproces, werden ADH en ALDH (afkomstig van G. thermodenitrificans) geïntroduceerd 10,11. De activiteit werd gemeten door rustende cel assays. Voor elke oxidatieve stap, werd de enzymactiviteit waargenomen.
Om het proces te optimaliseren, werd de expressie geïnduceerd onder enige laag glucose omstandigheden: een substraat gereguleerde promoter, pCaiF, gebruikt. pCaiF aanwezig in E. coli K12 en de expressie van de genen betrokken bij de afbraak van niet-glucose koolstofbronnen.
Het laatste deel van de toolkit – targeting overleving – werd uitgevoerd met behulp van oplosmiddel tolerantie genen, PhPFDα en β, beiden uit Pyrococcus horikoshii OT3. Organische oplosmiddelen kunnen induceren cel stress en verminderde overlevingskansen door negatief affecting eiwit vouwen. Zoals chaperones, PhPFDα en β verbeteren eiwit vouwproces bijvoorbeeld in de aanwezigheid van alkanen. De expressie van deze genen geleid tot een verbeterde koolwaterstof tolerantie aangetoond door een verhoogde groeisnelheid (tot 50%) in de aanwezigheid van 10% n-hexaan in het kweekmedium waargenomen.
Samenvattend, de resultaten aan dat de E. toolkit kan coli te zetten en koolwaterstoffen tolereren in waterige omgevingen. Als zodanig is het is een eerste stap op weg naar een duurzame oplossing voor de olie-sanering met behulp van een synthetische biologie aanpak.
Oil pollution is among the most serious causes of environmental contamination, and greatly affects ecosystems, businesses and communities 3. Solutions are for example required to battle the continuous oil pollution originating from the oil sands tailing waters in Alberta, Canada. During the process of oil extraction from oil sands, bitumen, a semi-solid oxidized form of oil, is removed using thermal recovery techniques that consume about 3.1 barrels of water per single barrel of oil 1. Oil contaminated process water, mainly originating from a local river, is stored in tailing ponds after bitumen extraction. A more effective recycling of process water in order to reduce the need for freshwater uptake is needed. To facilitate the bitumen extraction and to ensure that downstream sites meet water quality guidelines for the protection of aquatic ecosystems, process water treatments are rapidly evolving 3.
To treat pollution of organic compounds, bioremediation technologies employing microorganisms are presently encouraged 1. Alkanes are the most abundant family of hydrocarbons in crude oil, containing 5 to 40 carbon atoms per molecule 7, 21. Many bacteria are known to degrade alkanes of various lengths via sequential oxidation of the terminal methyl group forming first alcohols, then aldehydes and finally fatty acids 8. Within this iGEM project several enzymes from different organisms were expressed and characterized, and made available via the BioBrick standard and Registry of Standard Biological Parts.
The well-studied alkane hydroxylase system of Gordonia sp. TF6 facilitates the initial oxidation step of C5-C13 alkanes along with that of C5-C8 cycloalkanes using a minimum of four components: alkB2 (alkane 1-monooxygenase), rubA3, rubA4 (two rubredoxins) and RubB (rubredoxin reductase) 8, 21. Oxidation of long-chain alkanes (ranging from C15 up to C36) is reported to be performed by ladA, a flavoprotein alkane monooxygenase from Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA forms a catalytic complex with flavin mononucleotide (FMN) that utilizes atomic oxygen for oxidation. This results in the conversion of alkanes into the corresponding primary alkanol. The alcohols are further oxidized by alcohol and aldehyde dehydrogenases to fatty acids, which readily enter the β-oxidation pathway 7, 21. A zinc-independent alcohol dehydrogenase from the thermophillic bacterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidizes medium-chain alkanols into their respective alkanals, using NAD+ as a cofactor 10. Aldehyde dehydrogenase from the same bacterium is able to catalyze the NAD+-dependent final step in the medium-chain oxidation 11.
In order to reduce induction costs and to maintain optimal proliferation of the bacterial system, the promoter pCaiF from E.coli was characterized. This promoter can regulate expression of the hydrocarbon degradation pathway components, and is regulated by cAMP-Crp levels, which in turn depend on glucose levels 6. At high extracellular glucose concentrations in the environment the cellular cAMP (cyclic Adenosine Mononucleotide Phosphate) level was low through the inhibition of adenylyl cyclase as a side effect of PTS mediated glucose transport. Conversely, during limitation (low glucose concentrations) the cAMP level increased and Crp bound to cAMP forming the complex, cAMP-Crp, which bound pCaiF and activated transcription of the downstream components 6, 14.
Wildtype E. coli can only tolerate moderate concentrations of hydrocarbons. To complete the toolkit, tolerance to hydrocarbons had to be addressed. Several organic solvent-tolerant bacteria are known to survive in water-solvent two-phase systems 12. Molecular components known to increase tolerance are chaperones that facilitate the correct folding of proteins. The prefoldin system from Pyrococcus horikoshii OT3, consisting of the proteins phPFDα and phPFDβ, was shown to increase hydrocarbon-tolerance 17.
The alkane conversion toolkit was constructed following the BioBrick principle, which is documented at the Registry of Standard Biological Parts 9. BioBricks are plasmids containing a specific functional insert that is flanked by 4 predefined restriction sites. The BioBrick inserts can be extended flexibly, allowing the construction of biological systems with new functions.
De BioBrick principe wordt gebruikt om een chassis voor de afbraak van alkanen bouwen en een bewijs van principe voor de afzonderlijke componenten van de toolkit verkregen. Verschillende assays voorgesteld om de in vivo en in vitro activiteit van alkaan afbrekende enzymen route. De gepresenteerde werk toont succes een aantal methoden die kunnen worden gebruikt om enzymactiviteiten en expressie in het gastheerorganisme E. bepalen coli na implementatie van geschikte BioBricks. Ver…
The authors have nothing to disclose.
De experimenten uitgevoerd in deze video-artikel zijn ontwikkeld voor de international Genetically Engineered Machine competitie 9. De auteurs danken iGEM teamleden Lucas Bergwerff, Pieter TM van Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Cueto Rojas en Ramon van der Valk voor de hulp bij het onderzoek. Wij danken Han de Winde, Stefan de Kok en Esengül Yıldırım voor nuttige discussies en het plaatsen van dit onderzoek. Dit werk werd ondersteund door de TU Delft Universiteit afdeling Biotechnologie, De Delftse Bioinformatics lab, TU Delft afdeling Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), StuD studentenuitzendbureau, Nederland Genomics Initiative, Kluyver Centre, Nederlandse Biotechnologische Vereniging (Stichting Biotechnologie Nederland) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One en Genencor.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
E. coli K12 | New England Biolabs | C2523H | |
Octane | Fluka | 74822 | |
Hexadecane | Fluka | 52209 | |
octanol-1 | Fluka | 95446 | |
dodecanol-1 | Sigma-Aldrich | 126799 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
NADH | Sigma | N4505 | |
FMN | Sigma | F2253 | |
MgSO4 | J.T. Baker Casno | 7487 889 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
T4 ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Gas chromatograph | |||
Cell disrupter | LA Biosystems | CD-019 | |
Spectrophotometer | Amersham pharmacia | spec 2000 | |
Plate reader | Tecan | Magellan v7.0 | |
Incubator | Innova, 44 | ||
BioBrick K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4– BBa_J61100-rubB |
Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398014 | Alkane Hydroxylase System Resistance: Chloramphenicol |
BioBrick K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398027 | ladA Protein Generator Resistance: Chloramphenicol |
BioBrick K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398018 | ADH generator Resistance: Chloramphenicol |
BioBrick K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398030 | ALDH generator Resistance: Chloramphenicol |
BioBrick K398326: pCaiF | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398326 | pCaiF promoter Resistance: Chloramphenicol |
BioBrick K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401 | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398331 | pCaiF measurement device Resistance: Chloramphenicol |
BioBrick K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- | Delft University of Technology at the department of Biotechnology or Registry of Standard Biological Parts | BBa_K398406 | Solvent tolerance cluster Resistance: Chloramphenicol |