Biology

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

Published: November 1, 2012 doi: 10.3791/4198

Ki Ho Park¹, Leticia Brotto², Oanh Lehoang¹, Marco Brotto², Jianjie Ma¹, Xiaoli Zhao^1,3

¹Department of Physiology and Biophysics, UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, ²Muscle Biology Research Group, University of Missouri-Kansas City, ³Pharmacology division, College of Pharmacy, DHLRI, Ohio State University

Summary

وصفنا طريقة لقياس قوة العضلات مباشرة، القوة العضلية، وتعب حركية مقلص من العضلات الهيكلية معزولة في

Abstract

الموصوفة هنا هو وسيلة لقياس انقباض عضلات الهيكل العظمي معزولة. ويمكن الحصول على المعلمات مثل قوة العضلات، قوة العضلات، وحركية مقلص، تعب، والانتعاش بعد التعب لتقييم جوانب محددة من اقتران الاستثارة و التقلص (ECC) عملية مثل استثارة، والآلات ومقلص كا ^{2 +} قدرة المناولة. هذا الأسلوب يزيل أعصاب والدم، ويركز على العضلات والهيكل العظمي عزلت نفسها. ونحن نستخدم هذه الطريقة بشكل روتيني لتحديد المكونات الجينية التي تغير الخاصية مقلص من الهيكل العظمي والعضلات على الرغم من تحوير مسارات الكالسيوم ^{+ 2} الإشارة. هنا، نحن تصف والتي تم تشخيصها حديثا النمط الظاهري العضلات والهيكل العظمي، أي تناوب ميكانيكي، كمثال على المعلومات المختلفة والغنية التي يمكن الحصول عليها باستخدام مقايسة في العضلات المختبر انقباض. مزيج من هذا الاختبار مع المقايسات خلية واحدة، والنهج الوراثية وbiochemiيمكن المقايسات stry تقدم معلومات هامة في آليات ECC في الهيكل العظمي والعضلات.

Introduction

عضلات الهيكل العظمي نعلق على عظام الهيكل العظمي وتوليد القوى مقلص تحت سيطرة الجهاز العصبي المركزي. تقارن الاستثارة و التقلص (ECC) يشير إلى عملية تحويل حافزا الكهربائية إلى ميكانيكية استجابة. كاليفورنيا ^{2 +} إشارات يعتبر عنصرا أساسيا من وظيفة العضلات والهيكل العظمي في مقلص. كا ^{2 +} فعالة من تعبئة شبكية الهيولى العضلية (SR) هو عنصر هام لECC في خلايا العضلات ^{1، 2،} والتغيرات في الخلايا الكالسيوم ^{2 +} إشارات تكمن وراء ضعف المقابل تقلص في عدد من أمراض العضلات ^3-5. التقييم السليم لانقباض العضلات والضروري مجانية إلى كا ^{2 +} التصوير وغيرها من المقايسات للحصول على أفكار في وظيفة العضلات والهيكل العظمي، وليس فقط على مستوى مقلص، ولكن أيضا على المستوى الحركي. ويمكن أيضا قوة وسرعة الحصول عليها إبلاغ خاصية هامة منالقوة العضلية ووضع عملية ECC تحت مختلف الظروف الفسيولوجية المرضية في جسم المريض و.

هذا المجال خصب للبحث لديها تاريخ غني للغاية والعديد من النظريات من خلال تقلص العضلات ظهرت ألفي ^6. البحث الحديثة العضلات يبدأ على الأرجح في 1674-1682 مع ملاحظة مجهرية عبر التصدعات و myofibrils في الألياف العضلية قبل يوينهويك ^6. ما يقرب من قرن في وقت لاحق، لاحظ لويجي جالفاني أن العقود العضلات الضفدع بقوة عندما لمس العصب مع مشرط خلال تصريف شرارة كهربائية من آلة بعيدة ^7-9. ويمكن أيضا أن تنتج الانكماش من خلال ربط العصب إلى العضلات في الساق خلال موصل معدني. صيغت في نهاية المطاف تفاصيل آلية معقدة الإشارات الكهربائية التي ينادي بها جالفاني من هودجكين، وهكسلي كاتز في معادلة الشهير ^{10 و 11} التي أصبحت أساس الكهربية. الملاحظات ملحوظا من رينGER عن آثار الكالسيوم خارج الخلية ^{2 +} على انقباض القلب والعضلات الهيكلية الضفدع ^12-15 بمثابة الخطوة الرئيسية الأولى في الاعتراف كا ^{2 +} كمنظم رئيسي من انقباض العضلات ^{16 و 17.} من عام 1980 وحتى يومنا هذا قد تحقق وابلا من الاكتشافات في مجال انقباض العضلات بسبب انقباض إدخال العضلات وتعب البروتوكولات في عضلات الهيكل العظمي الفئران ^18. وكانت جونز وادواردز أول من يشير إلى أن التعب متقطعة التردد المنخفض (ممارسة النشاط انخفاض في القوة) كان مرتبطا ¹⁹ مع تغييرات في آلية ECC وليس جهاز مقلص. في أواخر عام 1980 وأوائل عام 1990، وKolkeck وآخرون ^20، Kolbeck وNosek ^21، وريد ²² باستخدام العضلات الحجاب الحاجز من نماذج القوارض لدراسة آثار theophyllines، cortiosterone، والجذور الحرة على انقباض العضلات والهيكل العظمي، في حين بروكس وFaulknوكانت أول من إيه تقرير عن قياسات القوة والقياسات المتكررة السلطة في العضلات سريعة وبطيئة من الفئران ^22. وبالإضافة إلى ذلك، كانت Lannegren، Westerblad، الحمل، وWesterblad أول من ربط مباشرة مع فيفو السابقين انقباض الخلايا كا ^{2 +} التنظيم والتي تشكك في دور الحماض في العضلات والارهاق ^{23 و 24.}

وقد ساهمت مختبراتنا بشكل ملحوظ منذ عام 2000 في وقت مبكر نحو فهم جينات جديدة مع تغييري والأدوار التنظيمية على ECC العضلات مع أدوارا حاسمة في انقباض العضلات، تعب، والشيخوخة باستخدام مزيج من سليمة الدراسات الماوس انقباض العضلات، وداخل الخلايا الكالسيوم الرصد ^{+ 2} في ألياف العضلات سليمة والبشرة والتلاعب الجزيئية الجينية ^{3-5، 25-29.}

نحن هنا بالتفصيل بروتوكول تجريبي لقياس انقباض النعلية المعزولة الفئران والباسطة لأصابع الطويلة (EDL) العضلات، والتي تتوافق في الغالب إلى بطء الأكسدة (I نوع الألياف العضلية وIIA) والعضلات في الغالب سريع glyocolytic (نوع بنك الاستثمار الدولي ومنظمة شات ألياف العضلات) مع خصائص متميزة مقلص. في هذا البروتوكول، تم عزل العضلات سليمة ووتر المجمعات استحم في نظام PowerLab ADI غرفة Radnotti المتوفرة مع الأكسجين النقي أو أي مزيج من الأكسجين (95٪) وCO ₂ (5٪). تم إنشاؤها بواسطة قوات مقلص التحفيز الكهربائي من العشب مشجعا والكشف باستخدام محول القوة التي تم دمجها مع نظام PowerLab/400 ADI، مما يسمح التخصيص من إجراءات الماكرو للسيطرة على اقتناء وجمع ورقمنة، وتخزين البيانات. يمكن قياس قوة هذا الإعداد العضلات، القوة العضلية، فضلا عن قوة العلاقة مقابل التردد، والتعب في العضلات، والتعب التعافي من العضلات والسرعة والخصائص الحركية العامة لتقلص العضلات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن رصد آثار المخدرات على تقلص العضلات من خلال هذه التجارب. وضع مزايا هذه الطريقة في إزالة مكونات الخلايا العصبية والأوعية الدموية بعيدا عن الهيكل العظمي والعضلات، والسماح التقييم المباشر من الخصائص الجوهرية للإصابة العضلات. وبالإضافة إلى ذلك، بحكم المقايسات انقباض الجسم الحي تسمح التلاعب في الوسط خارج الخلية المحيطة العضلات المعزولة، والتي تمكن من استخدام التلاعب الدوائية من مختلف القنوات وتخلل أيون نقل من أجل تحديد أدوارها الفسيولوجية لوظيفة العضلات والهيكل العظمي.

وقد سمح هذا النظام فيفو السابقين لنا لاكتشاف السلوك مؤخرا alternan متميزة في بعض الاستعدادات العضلات متحولة، والتي كانت مرتبطة الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} تغيير خصائص التعامل مع ^4. كما تم تعريفها تناوب حلقات انفجار المتقلبة للقوة مقلص خلال مرحلة تراجع الملف الشخصي مجهد. خلال هذه الأحداث قوات مقلص زيادة حظات فوق مستواه السابق من القوة دخلال شهر التحفيز مجهد، ربما لأكثر إما كا ^{2 +} هو أن يطلق سراحه أو آلية مقلص أصبحت أكثر حساسية لCA ^{2 + 30.} يمكن علاج حمض cyclopiazonic (CPA)، وهو مانع للعكس من الهيولى العضلية، الشبكة الهيولية الباطنة أتباز الكالسيوم (SERCA)، والكافيين، وناهض من قناة ryanodine (RyR) وكرر مجهد التحفيز لحث جميع تناوب الميكانيكية ^4، مما يوحي بأن ترتبط مباشرة إلى تناوب التشكيل من عملية توصيل EC. مظاهرة للأسلوب للحث على تسجيل وتناوب ميكانيكي في الإعداد انقباض في المختبر يخدم كمثال لإظهار المعلمات التجريبية المتنوعة التي يمكن الحصول عليها مع هذا النظام أو تلك مماثلة، على أساس الاهتمامات البحثية الفردية.

هذه الطريقة قد تكون ذات فائدة للباحثين الذين يدرسون علم وظائف الأعضاء العضلات. ويمكن أيضا أن تستخدم الإعداد مماثلة لمجمعات معزولة عن غيرها من الهيكل العظمي muscle-tendon/ligamentالتشريحية المواقع، فضلا عن الألياف واحد وشرائط العضلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

حل التركيب:

2.5 ملم CA ^{2 +} حل Tyrode: 140 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، HEPES 10 مم، 2.5 مم CaCl _{2، 2} ملم MgCl ₂ و 10 ملي الجلوكوز

0 ملي CA ^{2 +} حل Tyrode: 140 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، HEPES ملي 10، 2 ملم MgCl _2، 0.1 ملي جلايكول الإثيلين tetraacetic حمض (EGTA) و 10 ملي الجلوكوز

ملاحظة: يجب أن تكون مشبعة حل الاستحمام مع O 100٪ ₂ إذا باستخدام الحل أعلاه، ولكن مع 95٪ O ₂ CO مع 5٪ ₂ إذا باستخدام بيكربونات المستندة إلى مخازن للحفاظ على درجة الحموضة المستمرة. 2.5 ملم كا ^{2 +} يضاف إلى المخزن المؤقت الاستحمام لألخص مستوى الكالسيوم ^{2 +} العثور عليها في الفضاء خارج الخلية و 10 ملي الجلوكوز المهم منذ الميتوكوندريا هي لا تزال تعمل في هذه العضلات بشكل مستمر لإنتاج ATP في وجود الجلوكوز.

1. وضع ما يصل إلى انقباض فيفو السابقين التجربة باستخدامنظام ADI PowerLab

ويرد الرسم التخطيطي للنظام السابق 4-قناة فيفو انقباض في الشكل 1. A الكمبيوتر يسيطر على محفز لتوليد موجة مربع البقول، والتي يتم تصفيتها من قبل وحدة العزلة للتوصل إلى زوج من الأسلاك المعزولة البلاتين المحيطة بكل وتر العضلات المعقدة. ويسمى أيضا هذا التحفيز المجال. وقد لمست تقلص العضلات استجابة لتحفيز من قبل محول القوة، وإشارة الناتج من تضخيم الذي وتصفيتها وتحويلها مرة أخرى إلى جهاز الكمبيوتر عن طريق محول A / D (إشارة تكييف). ورقمية ثم إشارة ويمكن حفظ لتحاليل في وقت لاحق.
للتحضير لتجربة فيفو السابقين انقباض، اول منعطف على تحفيز الميدان، وتحويل A / D (في هذه الحالة ADI الطاقة مختبر) أو برامج مماثلة (مثل ابفيف)، تليها الكمبيوتر.
فتح Chart4 البرمجيات (أو غيرها من البرامج التي نسخة متوافقة مع نظام) وinitiat4-EA قناة المهمة؛ يشار التواصل السليم من البرامج والأجهزة من خلال البدء في تكوين الأجهزة، والزر START على البرنامج يصبح التشغيلية (حي)، وظيفة 4-قناة في وقت واحد يتيح قياس من زوج من العضلات من نوع البرية وفئرانا معدلة وراثيا، أو 2 و 2 EDL العضلات النعلية من الماوس نفسه، ويمكن استخدامه للعضلات أخرى مثل الحجاب الحاجز (الحجاب الحاجز كله، هيمي الحجاب الحاجز، أو شرائط العضلات الحجاب الحاجز) والظنبوبي الأمامي؛ ويمكن أيضا أن تستخدم لتحضير عضلة القلب والعضلات للحزم من، لا سيما إذا واحد هو استخدام عضلات الفئران. في هذه الحالة قد يكون حجم العضلات لحد من انتشار الأكسجين لذلك حزم العضلات بالتالي فهي الخيار الأفضل. ومع ذلك، هناك حاجة لتقنيات تشريح الخبراء الاستعدادات حزمة العضلات.
معايرة محول القوة: هذا هو لضمان إمكانية المقارنة بين مجموعة البيانات الناتجة في قنوات مختلفة في وقت وآخر. أول تسجيل بداية، sequentiaشنق LLY ل1-G، 2 G-5-الأوزان وز على عينة من بستان محول القوة، إيقاف التسجيل، حساب التغيرات المناظرة في بالسيارات المعروضة في كل قناة من Chart4 البرامج ورسم ΔmV ووزن للتحقق الخطي و تحديد معامل التحويل بين متوسط وغرام القوة. نوصي تنفيذ هذه المعايرة إما في بداية أو في نهاية كل تجربة للتأكد من أن يتم الحصول على المعايرة المحددة لكل تجربة محددة.
التحقق من اتصال السليم للأنبوب تفلون، واستنزاف أي السائل الحالية في النسيج أنابيب حمام، غرف غسل ثلاث مرات أو أكثر مع DDH ₂ O وملء مع 20 ~ 25 مل 2.5 ملم CA ^{2 +} حل Tyrode. كاليفورنيا ^{2 +} ويتم توفير الغلوكوز في حل الاستحمام للمساعدة في الحفاظ على سلامة الغشاء، تحميل الأمثل ⁺ كا ² من SR، ومصدرا للطاقة متوفرة بسهولة لتوليد ATP من قبل العضلات نفسها، منذ الميتوكوندريا لا تزال تعمل بكامل طاقتها في هذه الاستعدادات.
التحقق من اتصال السليم للامدادات الاوكسجين، افتح خزان الأكسجين، وضبط تدفق الأكسجين لتوفير محتدما ناشر ومتجانسة للغرفة. يمكنك بسهولة أن تحدد مستويات الأوكسجين بوصفها وظيفة من قوة مقلص مقابل الوقت. ويمكن أيضا أن يتم تثبيت تدفق متر، وخاصة إذا مهتما الباحثون في دراسة آثار نقص الأكسجين أو فرط التأكسج. إذا أصبحت ميتة العضلات، القوة يقلل بشكل طبيعي. في حين يمكن أن تلحق الضرر أيضا فرط التأكسج العضلات ولكن آثاره قد يكون من الصعب أن يتم الكشف عن ليتم تنفيذ معظم التجارب في ظل ظروف اصطناعية مفرط التأكسج للتعويض عن عدم وجود إمدادات الدم إلى العضلات العادية. في معظم أنظمة تقنية المعلومات من الممكن أن فقاعة غرف مختلفة مع نفس الكمية من الأكسجين ببساطة عن طريق التحكم في تدفق الأكسجين إلى كل غرفة ثابتة.
ضبط حساسية كل القنوات لضمان سريان القرار القصوى دون تشبع القناة. يمكن حساسية قناة تختلف اختلافا كبيرا عن وظيفةد عمر الحيوان، ودرجة الحرارة التجريبية، التلاعب الجيني، وحجم العضلات، وإجهاد الماوس، وقدرة المجرب لتشريح العضلات بشكل صحيح خالية من الأضرار. في تجربتنا، عند قياس قوة مقلص النعلية، وحساسية يختلف 0،5 حتي 10 فولت / سم، بينما في حالة EDL، يمكن أن تختلف حساسية 1-20 بالسيارات / سم.
بروتوكول لتحفيز مجهد لابد من تحديده. يمكن في البرنامج Chart4 أن تستخدم ماكرو. لبرمجة ماكرو جديد: في البرنامج Chart4، انقر فوق بدء القياس، انقر فوق ماكرو، ماكرو الأوامر، بدء التسجيل، تبدأ تكرار، اختر التردد المرغوب التحفيز، ثم كرر نهاية. لبروتوكول موازنة، يتم تكرار التحفيز كل دقيقة لمدة 30 دقيقة ومجهد للبروتوكول، ويتكرر كل 2 ثانية التحفيز لمدة 5 دقائق. هذه التغيرات في وتيرة انعقاد التحفيز، تؤثر بشكل مباشر على دورة العمل، الذي هو أيضا وظيفة من مدة التحفيز. يمكن أن تختلف هذه المعايير لاختبار مختلف اسبيسنت من انقباض وتعب.

2. إعداد حزم العضلات السليمة

تشريح EDL: وضحى الماوس بعد NIH المبادئ التوجيهية والبروتوكولات IACUC الحيوان المؤسسية. وضحى الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. ثم يتم ترتيب الماوس في الوضع الأفقي. EDL العضلات عبارة عن عضلة سريعة حال السكر مع اللون الوردي والأبيض الشاحب. فهو يقع في حوالي 10-13 مم ويزن 8-11 ملغ في النوع البري C57BL / الماوس 6. ومؤسسة كهرباء لبنان لديها وظائف تمتد أصابع 2-5، وظهراني الثناء القدم في الكاحل. ومعصب من قبل العصب الشظوي. لتشريح EDL، وجعل شق الجلد السطحية وخفض فتح اللفافة بين الظنبوبي الأمامي والخلفي للمجموعة العضلات، وتوطين أصل (القريبة) حيث يتم توصيل الرباط الجانبي إلى اللقمة من الساق ومتفوقة 3/4 من الجزء الأمامي سطح الشظية (هامش بين العظام). قطع في الرباط مع مقص العيون حساسة وبشكل أقصى قدر ممكن من العضلات، وهذا الاجراءه إصدارات الأصل القريب من العضلات EDL. عقد في الرباط مع ملقط حادة وسحب ببطء لتحرير EDL. قد يكون من الضروري لخفض بعض perimysium المحيطة العضلات وغيرها من مؤسسة كهرباء لبنان حول EDL، وهي خطوة حاسمة منذ ضرر يمكن أن يحدث لعضلة EDL خلال هذه الخطوة الحساسة. المقبل، انتقل إلى المنطقة الإدراج حيث الأوتار 4 البعيدة تضاف الى الكتائب المتوسطة والبعيدة من 2-5 أرقام. قطع الأوتار قدر الإمكان من العضلات.
نقل العضلات المعزولة EDL في طبق تشريح تحتوي على حل متساوي التوتر Tyrode. بعض النماذج الحيوانية متحولة، المعدلة وراثيا، وخروج المغلوب لها عضلات هشة للغاية واستخدام الكالسيوم ^{2 +} خالية من حل Tyrode ضروري لمنع كا ^{2 +} الضرر الناجم عن انقباض العضلات قبل القياسات. بعد ذلك، استخدم عقدة جراحية لربط بإحكام في كلا طرفي عضلة EDL بشكل أقصى اعتبارا من العضلات قدر الإمكان. A حسن التدبير هو ربط أعلى قليلا من منتصف عoint طوليا في الرباط أو في وتر. استخدام 6-0 خياطة حجم لهذا الإجراء، ونقل العضلات EDL إلى _2-O المشبعة الأنسجة غرفة حمام، تحميل العضلات على الأخدود عينة من محول القوة وربط القرطاسية على الجزء السفلي من الغرفة حمام، كرر عملية الساق الأخرى. بدأنا أيضا في الاستفادة من طريقة جديدة التي تحمل العضلات مع المشابك بدلا من الغرز. إذا كان الهدف الرئيسي هو دراسة الخصائص الحركية و / أو للحصول على قوة العضلات، فمن المستحسن أن تكون خياطة قصيرة قدر الإمكان أو الاستعاضة عن خياطة بقضيب معدني.
تشريح النعلية: والنعلية هو في الغالب بطيئة الأكسدة العضلات مع اللون الأحمر الغنية. فمن ~ 1 مم أقصر من مؤسسة كهرباء لبنان ولكن يزن أكثر بقليل من مؤسسة كهرباء لبنان. ومعصب من قبل العصب الظنبوبي وينفذ العمل من الثناء أخمصي القدم. لتشريح النعلية، وصول إلى الجانب الخلفي الجانبي من الساق، ودفع جانبا عضلة الساق التي تغطي عادة soleuق، وتحديد العضلات مع اللون الأحمر الداكن. في الأصل (القريبة)، وقطع الأربطة التي تربط إلى النصف القريب من الساق الخلفية على طول الخط soleal والداني 1/3 من الشظية والخلفي؛ المقبل في الإدراج (البعيدة)، وقطع وتر العقبي الذي يدرج في الخلفية عقبي. مجانا الدقيقة لالنعلية وجبل العضلات بشكل صحيح النعلية في غرفة حمام أما بالنسبة لمؤسسة كهرباء لبنان.

3. قياس انقباض عضلات الهيكل العظمي متفرقة

مرة واحدة هي التي شنت العضلات في حمام غرف فردية الأنسجة، وبدء التسجيل. معظم أنظمة مماثلة تسمح التصفير من خط الأساس للتسجيل قوة. عادة ما يرتبط بهذه المهمة مع مكبر للصوت، في حالة محددة من نظام PowerLab، وظيفة مكبر للصوت الجسر. يسهل مراقبة التغييرات الأساسية وتوفر وسيلة مريحة لجميع تقلصات العضلات التي سيتم تحليلها من الصفر. يتم تحفيز العضلات ثم معزولة مع الموجة المربعة البقوليمكن أن تتراوح على نطاق واسع وظيفة من حجم الغرفة والبلاتين سمك الأسلاك، المسافة بين الأسلاك، وحتى تكوين الحل التجريبية. لقد استخدمنا الحالي من 60 مللي أمبير (لاحظنا أن التيارات فوق 350 مللي أمبير ويبدو أن تضر الاستعدادات العضلات) والقطارات التحفيزية لل350، 500، والسيدة 1000، اعتمادا على أهداف بروتوكول معين. ينبغي أن يكون الفرد قد البقول مربع موجة مدة تتراوح 0،3 حتي 1 مللي.
الخطوة التالية هي اختيار تردد من التحفيز قادرة على إنتاج التحفيز تكززي تنصهر (مثلا: ~ 100 هرتز للسماح للقوة القصوى الإنتاج في العضلات وEDL ~ 60 هرتز في العضلات النعلية)، في حين تمتد ببطء وبعناية لتحديد العضلات الأمثل طول هذه العضلات. كما تمتد بعناية العضلات، والانتظار لمدة 30 ثانية، وتحفيز على 100 هرتز؛ الانتظار 30 ثانية وتمتد مرة أخرى، ثم كرر التحفيز، حتى النقطة التي لا تزيد قوة بعد الآن.
هذه العضلات لديها undergonه تغييرات كبيرة في البيئة. ووصف خطوة في البروتوكولات لدينا فمن المستحسن أن يتم السماح العضلات على التكيف مع البيئة الجديدة، "موازنة". تتوازن هذه العضلات في نفس التردد من التحفيز المستخدمة خلال مرحلة تمتد، 100 هرتز لمدة 20-30 دقيقة، حتى لا يقل عن 5 انقباضات متتالية تكززي مستقرة تماما (وليس الحد، وليس زيادة، خط الأساس مستقرة). تواتر القطارات تنشيطية (100 هرتز، 500 مللي مدة، 1 مللي الفردية نبض) خلال موازنة هو 1 دقيقة، أي ما يعادل لدورة العمل من 1.66٪، والتحفيز غير مجهد. وفي هذا السياق، دورة اجب 1.66٪ يعني أن أكثر من ما مجموعه 100٪، وتعمل العضلات 1.66٪ من الوقت، يمكن في نهاية المطاف من خلال زيادة عضلات دورة العمل أن يتسبب في التعب. إذا العضلات غير ذلك من الأصحاء، والماوس نوع البرية تظهر الشخصي مجهد خلال هذه الفترة موازنة، فمن الممكن أن تلف خلال فترة التشريح، نقص الأكسجة يحدث في غرف / العضلات، أو ايلى المفرطةctrolysis من خلال الأقطاب تحفيز تولد الجذور الحرة. وقد اقترح في وقت سابق ان Westerblad التيارات أكبر من 400 mA لحث على تشكيل الجذور الحرة ^23. من الواضح، ويقترح البلاتين أعلى مستوى من الجودة، لأن معادن أخرى ستؤدي حتما إلى تشكيل الجذور الحرة وسمية العضلات.
الحصول على قوة العلاقة مقابل التردد (FF) من خلال تحفيز العضلات مع ترددات التحفيز التالية: 1-140 هرتز (هرتز في الزيادات من 5-10)، مع تواتر من 30-60 ق عند إجراء التجارب في C. ° 25 عند تنفيذ التجارب في C ° 37، تمديد FF لترددات أعلى تصل إلى 300 هرتز لعضلة الحجاب الحاجز، 180-200 هرتز لالنعلية، و220-250 هرتز لمؤسسة كهرباء لبنان. المقبل، وتحديد وتيرة التحفيز الذي يولد قوة قصوى تكززي (T _ماكس) وحوالي ½ القصوى تكززي القوة (1/2 T _{حد أقصى)،} وأحيانا أنه من الصعب الحصول على _{الحد الأقصى} المحدد لكلا ½ T EDL والوحيدلنا العضلات في حالة استخدام مصدر واحد هو محفز، وذلك بسبب الاختلافات الجوهرية بين هذه العضلات. حلا قابلا للتطبيق هو تحديد تردد أن تنتج 30-70٪ من الحد _الأقصى T. الأساس المنطقي لهذه الترددات من التحفيز هو أن T _ماكس يوفر معلومات هامة للأحداث آلات مقلص / التشكيل، في حين أن _{الحد الأقصى} T ½ يوفر معلومات أكثر أهمية في تنظيم الكالسيوم ^{+ 2} وعملية ECC. لتكون على يقين أنه تم تحقيق القوة القصوى، يمكن إضافة 10-20 ملم الكافيين في حل الاستحمام في حين تحفيز العضلات. إذا كان قد تم التوصل إلى القوة القصوى، والقوة لا زيادة في وجود مادة الكافيين. يتم إزاحة FF إلى اليمين وقوات تميل إلى أن تكون أعلى قليلا في درجات حرارة أعلى التجريبية. باستخدام هذا النظام، يمكن إجراء أي ترددات أخرى إذا التحفيز مرغوب فيه. الملف الشخصى متميزة مقلص من العضلات سريعة EDL حال السكر والعضلات بطيئة النعلية الناتج عن الأكسدةهو مبين في الشكل 2.
بعد موازنة، والتعب في عضلات _ماكس T ½ لمدة 5 دقائق، مع فاصل من التحفيز 2 ثانية و 25٪ لدورة العمل (الشكل 3). ويعتقد هذا البروتوكول مجهد محددة لتعكس على نحو أفضل مساهمة كا ^{2 +} شبكية الهيولى العضلية انقباض العضلات الإفراج عن ^31.
استرداد العضلات في _أقصى T ½ لمدة 30 دقيقة أو حتى قوة مستقرة، في فترة حد أدنى 1. لا يمكن أن يؤديها على بروتوكول إضافي مجهد الآن باستخدام T _ماكس التحفيز، التي يعتقد أنها تعكس حالة من آلات مقلص ^31. وثمة خيار آخر هو تمديد بروتوكول مجهد ليقحم القطارات تنشيطية التي تولد T _{ماكس وماكس} T ½ خلال التعب واستعادة العضلات مع نفس النوع من التحفيز.
تكرار FF كما هو موضح في الخطوة 3.4؛ الأساس المنطقي هو أن الاختلافات بين فرق المظهريويمكن ملاحظة سلالات erent، ونماذج المرض، أو العلاج بالعقاقير عن طريق تحليل FF قبل وبعد التعب. لدينا على سبيل المثال ذكرت في وقت سابق ان بعد التعب يتم إزاحة FF من الشباب العضلات النوع البري إلى اليسار، بينما في العضلات العضلات من العمر، يتم إزاحة إلى اليمين، مما يشير إلى آثار تغييري الفرق من التعب العضلات والهيكل العظمي بوصفها وظيفة من الشيخوخة.
لبحث مساهمة الكالسيوم خارج الخلية ^{2 +} دخول في انقباض العضلات، يمكن تغيير الحل الاستحمام في محلول يحتوي على الكالسيوم ^{2 +} لا ولكن EGTA 0.1 مم (0 CA ² ملي حل Tyrode ^{+) 32.} وبدلا من ذلك، يمكن تطبيق حاصرات مختلفة من متجر تعمل القناة في حل الاستحمام. وهناك أمثلة قليلة هي: 2-aminoethyl diphenylborinate (2-APB)، SKF96365، 3،5 مكرر (trifluoromethyl) بيرازول 2 (BTP-2) وazumolene، وما إلى ذلك ^{33 و 34.} ويمكن استخدام الكافيين للتحقيق وظيفة مستقبلات ryanodine، ويمكن استخدامها لتقييم بوكل العامخصائص إزالة الاستقطاب من هذه الاستعدادات. ويمكن أيضا أن تستخدم أدوية أخرى للتحقيق في التحوير المهم للقوة من قبل أثناء التعب ⁺ نا، K ^+، ونا ^{+ +-K} مضخات ^35. معظم هذه العقاقير لها أحجام صغيرة نسبيا ويبدو أن نشر هذه الاستعدادات بسرعة إلى العضلات كما يتضح من آثارها المباشرة. عدم وجود تأثير من قبل أي أدوية معينة لا يعني بالضرورة أن المخدرات غير فعالة واختبارات إضافية باستخدام جرعة أعلى بكثير من تلك المستخدمة في التجارب الألياف العضلية واحد في بعض الأحيان ضرورية.
أدى تطبيق واحد فريدة من نوعها لهذا النظام فيفو السابقين إلى الاكتشاف الأخير لتناوب ميكانيكي في A-tric ^{- / -} عضلات ^{4، 30.} كما تم تعريفها تناوب حلقات انفجار المتقلبة للقوة مقلص خلال مرحلة تراجع الملف الشخصي مجهد. خلال هذه الأحداث يمكن زيادة قوة مقلص حظات فوق مستواه السابق للقوة خلالمجهد التحفيز لما في ذلك من إطلاق سراحه أكثر إما كا ^{2 +} أو آلية مقلص أصبحت أكثر حساسية لكا ^{2 +.} اندلاع قوة مقلص يجب أن يكون أعلى من 50٪ قوتها السابقة، وينبغي أن ينظر إلى تفشي لا يقل عن 10 مرات خلال عملية دقيقة 5-التحفيز التعب. تناوب ميكانيكي ليست شائعة في الهيكل العظمي والعضلات من نوع الفئران البرية، ولكن يمكن أن ينظر إليه في بعض العضلات مع اضطراب متحولة من بين الخلايا مما يشير الى عملية CA ^{2 +} مثل مثلوثي بين الخلايا الكاتيونات نوع القناة A (tric-A) ^{- / -} العضلات ^4. يمكن أن يتسبب من خلال التحفيز الميكانيكي تناوب مجهد، والعلاج مع حمض الكافيين وcyclopiazonic (CPA)، انظر الشكل 3 للتسجيل تناوب ممثل هذه الميكانيكية. طبيعة هذه الظاهرة هو فضول تماما، في حين أن العضلات التي يتم مجهد يبدو قادرا على إنتاج المزيد من القوة لحظات. في المنشور رسائلنا السابقة، بالاشتراك مع الكالسيوم خلية واحدة ^{2 +} تحليل يكشف عن أن ظهور تناوب هو نتيجة من الكالسيوم SR SR ^{2 +} الزائد وغير مستقرة. ونحن نعتقد أن فهم أعمق للتناوب قد يؤدي إلى فهم أفضل لعملية ECC.
في نهاية التجربة، وقياس طول ووزن العضلات الفردية باستخدام الفرجار ومعايرة الميزان التحليلي، فلاش تجميد العضلات في النيتروجين السائل وحفظها في -80 درجة مئوية، لا يمكن أن يؤديها منذ التحليلات الكيميائية الحيوية في هذه العضلات. يمكن أيضا أن تكون هذه العضلات ميكانيكيا-البشرة للتحقق مفصلة لعملية ECC، أو أن البشرة كيميائيا لتحديد الخصائص الأساسية مقلص في عدم وجود آليات تنظيمية ECC.
يتم تحويل قوة العضلات سجلت أول (إم) لإجبار غرام بناء على نتائج المعايرة وتطبيع ثم إلى منطقة مستعرضة الفسيولوجية (PCSA) باستخدام الصيغة التالية: قوة العضلات (N / سم ²⁾ = (القوة (ز) × العضلات lengtح (سم) × 1.06) / (وزن العضلات (ز) × 0.00981) ^5،36. وبدلا من ذلك، يمكن لقوة العضلات طبيعية البروتين الكلي أو مجموع المحتوى من أكتين العضلات الفردية باستخدام مقايسة البروتين برادفورد / Commossie الكمي تلطيخ الأزرق. في ظل ظروف معينة يمكن أن يكون كتلة العضلات في حين تأثرت بشدة بسبب الأمراض، الشيخوخة، العلاج بالعقاقير، وتطبيع قوة يعتمد على كتلة العضلات والبروتين و / أو محتوى أكتين يمكن أن توفر قراءات أكثر استقرارا.

4. ممثل النتائج

وتظهر عادة درجة حرارة الغرفة قوات مقلص من مؤسسة كهرباء لبنان والنعلية الاستجابة إلى الأقل، تردد المحفزات المتوسطة والعليا في الشكل 2. الانكماش الناجم عن EDL التحفيز هرتز 5 يبقى الفرد تشنجات نتيجة لعمل سريع من الكالسيوم ^{2 +} أتباز SERCA والكالسيوم ^{2 +} الجوهرية خصائص حساسية الماكينات مقلص، في حين أن الانكماش النعلية بنسبة 5 هرتز يبدأ الصمامات (أبطأ على أتبازد الحساسية للأعلى كا ^{2 +} الآلية مقلص)، ولكن لا تزال قوات الذروة منفصلة. في التحفيز هرتز 20، تنصهر جزئيا في حين أن تقلصات EDL من النعلية يشكل قوة تنصهر تماما تكززي. على التردد التحفيز التي تنتج T _ماكس التحفيز، والتي يمكن أن تختلف في درجة حرارة الغرفة 80 حتي 110 هرتز لمؤسسة كهرباء لبنان و60-90 هرتز لالنعلية، upstroke سريع والاسترخاء السريع للقوة تكززي في مؤسسة كهرباء لبنان أشار و، وهو ما يتعارض مع خصائص البطيء للعضلة النعلية. 2B الشكل يدل على أن يتم إزاحة المنحنى قوة التردد في عضلة EDL إلى اليمين بالمقارنة مع العضلات النعلية، مشيرا إلى أن العضلات النعلية أكثر حساسية لإطلاق الكالسيوم ^{+ 2} في أي تردد معين من بسبب وجود الميوسين البطيء والأشكال الإسوية تروبونين التحفيز. وبالإضافة إلى ذلك، وآلات مقلص يستجيب مع المزيد من القوة النسبية في العضلات النعلية في ترددات منخفضة نسبيا. الشكل 3 عرضSA الشخصي التعب العادي للمؤسسة كهرباء لبنان العضلات (اللوحة العليا) والنعلية (لوحة الأوسط). لاحظ تراجع أسرع في قوة مقلص تحت التحفيز مجهد في العضلات وارتفاع EDL انخفاض في القوة في نهاية البروتوكول دقيقة 5-التعب. وأخيرا، تبين وجود نموذجي الشخصي alternan الميكانيكية في عضلة متحولة في الشكل 3 (اللوحة السفلى)، الذي يعرف بأنه لحظة تفشي قوة خلال المرحلة تراجع الملف التعب في العضلات. اندلاع قوة مقلص يجب أن يكون أعلى من 50٪ قوتها السابقة، وينبغي أن ينظر إلى تفشي لا يقل عن 10 مرات خلال عملية دقيقة 5-التحفيز التعب.

الشكل 1. الرسم التخطيطي يتم إنشاء نظام السابق 4-قناة انقباض الجسم الحي. ساحة الموجة البقول بنسبة كمبيوتر السيطرة على العشب مشجعا. وحدتين العزلة التحفيز التحفيز تصفية مصدره كهربائيtrical حدة مشجعا لإزالة أي تقلبات في إشارة كهربائية وإنشاء مستقرة إشارة موجة مربعة. يتم إرسال هذه الإشارة الكهربائية التي تمت تصفيتها إلى غرف الاستحمام التي تحتوي على 4 أسلاك البلاتين الأقطاب المحيطة بكل العضلات المعزولة. في نهاية المطاف، هو الحالي عبر القطبين (وتسمى التحفيز الميدانية) التي تولد إمكانات العمل، الأمر الذي أدى إلى تقلص العضلات. تم الكشف عن هذا الانكماش من قبل قوة محولات معينة، تنتقل إلى مكبرات الصوت الجسر، بلغ متوسط تصفيتها، (إشارة تكييف) والتي سجلتها برامج الكمبيوتر من خلال تحويل A D /.

الشكل 2. . قوات مقلص ممثل مؤسسة كهرباء لبنان والنعلية (A) يتسبب قوات مقلص بنسبة 5 هرتز (اللوحة العليا)، 20 هرتز (وسط لوحة) والقوة القصوى تكززي (T _ماكس) (لوحة أقل)؛ مدخل يظهر أثر لقوة مقلص من تلف العضلات، (B) علىتعيين ممثل تبين انكماش الفردية للقوة العلاقة مقابل التردد في مؤسسة كهرباء لبنان (FF، اللوحة العليا) ومنحنى تآمر الناتجة عن FF (اللوحة السفلى). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. ممثل الشخصي مجهد وتناوب الميكانيكية. نموذجي الشخصي انخفاض سريع مجهد للعضلات EDL (اللوحة العليا) والانخفاض البطيء مجهد الملف الشخصي للعضلة النعلية (لوحة الأوسط). مجهد التحفيز يؤدي إلى ظهور تناوب الميكانيكية في tric-A ^{- / -} العضلات مع اضطراب التعامل مع خصائص CA ^{2 +} (اللوحة السفلى).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قياس قوة مقلص وتعب المهم لتقييم شامل من وظيفة العضلات والهيكل العظمي. والغرض الرئيسي من هذا الفحص هو تحديد التغيرات في قوة العضلات وخصائص مجهد في ظل ظروف مرضية معينة، مثل sarcopenia والتعب في العضلات، واختبار تأثير المخدرات / الكواشف على انقباض العضلات. منذ يرتبط ارتباطا وثيقا مع قوة العضلات الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} الإصدار، خارج الخلية CA ^{2 +} دخول والحديث المتبادل بين هذين، يمكننا جمع أيضا معلومات عن حالة كا ^{2 +} الاشارات في العضلات والهيكل العظمي باستخدام هذا الأسلوب. وأظهرت هنا لدينا فريدة من نوعها تسمى النمط الظاهري "تناوب ميكانيكي" عندما شوهد انفجار حلقات متقلبة من قوة مقلص خلال مرحلة تراجع الملف الشخصي مجهد تحت SR زائد وغير مستقرة. يمكن للمرء أن يتوقع أن مجموعة متنوعة من الظواهر الهيكل العظمي والعضلات بما في ذلك القوة تتغير FF، تعب، حركية مقلص والانتعاش ABويمكن الكشف عن ility بعد التعب باستخدام مقايسة انقباض في المختبر تحت ظروف مرضية مختلفة.

الخطوة الأكثر أهمية بالنسبة لهذا الاختبار هو عزل العضلات سليمة كله (أو حزم العضلات وشرائح العضلات) بحيث تكون خالية من الضرر. هذا الهدف هو الأسهل أن يتحقق في الأعمال التحضيرية العضلات كلها. هنا علينا أن نبرهن على ترك ما يكفي من الأربطة والأوتار والعضلات لادراك التعادل كله مهم جدا لمنع ربط العضلات نفسها، مما يؤدي إلى تلف العضلات والموت في نهاية المطاف العضلات. وبالإضافة إلى ذلك، محتدما المستمر للحلول مع O 100٪ إما ₂ في حالة HEPES أو الحلول المستندة إلى مزيج من O ₂ CO ₂ لوبيكربونات الحلول المستندة إلى أمر بالغ الأهمية. نقص الأكسجة وفرط التأكسج منع المهم في حين يمكن استخدام مقياس التدفق. كنا أيضا في حالة معينة جهاز معين يقيس الأكسجين الذائب في السوائل الاستحمام الأنسجة. في ظل ظروف معينة، حيث العضلات موره عرضة للضرر، والتعامل مع العضلات المعزولة في حل الكالسيوم ⁺ خالية من ² قبل تركيب محول على قوة تساعد على استرخاء العضلات وتقليل الضرر العضلات قبل التجربة. الأدوية مثل 2،3 - يمكن أيضا butanedione monoxime (BDM) أو N-بنزيل-P-التولوين sulphonamide (BTS) تضاف أثناء تشريح لتقليل الضرر، خاصة إذا تم إعداد حزم العضلات أو شرائط العضلات، وهو أمر شائع لدراسة انقباض من الحجاب الحاجز ^{37 و 38.} أثناء التسجيل، سوف تولد الاستعدادات التالفة عادة أقل قوة وزادت الضوضاء الأساسية وتقلبات (انظر مدخل الشكل 2)، ويجوز استبعاد نتائج من هذه العضلات من مجموعة البيانات التحليل، ما لم يكن ذلك جزءا من تجربة لتحليل ردود التالفة العضلات. نقطة أخرى يمكن تجاهل أو نسيان بسهولة هو أن التحفيز الكهربائي نفسها يمكن أن تكون مصدرا للسمية للعضلات. نوصي تنظيف دوري الأقطاب وعلى chambوهناك حاجة أيضا إيه بمحلول هيبوكلوريت 1٪ لإزالة أي الملوثات، والحطام البروتين، يحذر الأكسدة تراكم الخ. الخاص عند ضبط طول العضلات التي شنت. من المهم أن تمتد في خطوات صغيرة لتجنب الإفراط في التمدد والمحاذاة الأمثل للخيوط رقيقة وسميكة أمر بالغ الأهمية لسير عبر جسر كفاءة ^39. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن أن يتم الاحتفاظ الموضع النسبي للحزم العضلات لنصرة الأقطاب التحفيز المستمر والانحياز مجال بين جميع القنوات لضمان أن كمية متساوية من التيار الكهربائي يتم تطبيقها على العضلات المعزولة. في ظل ظروف تجريبية لدينا، والعضلات من الشباب الفئران البرية نوع تظل مستقرة لأكثر من 12 ساعة وأطول حتى إذا تم إضافة المضادات الحيوية، FBS 0.2٪، والأحماض الأمينية في حل الاستحمام.

مع الرعاية والرقابة السليمة، ويمكن هذا النظام فيفو السابقين تقديم معلومات عن العلاقة بين CA ^{2 +} يدل على أند تقلص العضلات دون تعقيد الأوعية الدموية والغدد الصماء، والجهاز العصبي. على سبيل المثال، وفقدان الكالسيوم خارج الخلية الاعتماد على ^{2 +} هو وجود توقيع من الهيكل العظمي والعضلات في حين SR العمر كا ^{2 +} الافراج عن ضعف غلة عادة أقل قوة مقلص وسريعة الشخصي مجهد. كما exampled هنا، ظهور تناوب الميكانيكية يشير SR غير مستقرة، والتي نعتقد أنها لا تقتصر على tric-A ^{- / -} العضلات، ولكن أيضا إلى حد ما في عضلات الهيكل العظمي أخرى في ظل ظروف مرضية توليد SR كا ^{2 +} الزائد وعدم الاستقرار. هذا الإعداد يسمح بالوصول المباشر للعضلة لمختلف التلاعب الفسيولوجية والدوائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل SDG AHA 10SDG2630086 لX تشاو، RO1-J AR061385 إلى ما وGO RC2AR05896 المنح لM. Brotto

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca²⁺ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca²⁺ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca²⁺ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5