生物钟单个细胞内发挥作用,也就是说,它们是细胞的自我。在这里,我们描述了使用非侵入性,实时荧光素酶为基础的生物发光技术产生的细胞自主的时钟模型的方法。记者细胞提供听话的,功能性的昼夜节律生物学研究的模型系统。
在哺乳动物中,许多方面的行为和生理的,如睡眠-觉醒周期和肝脏代谢的调节内源性生物钟(审阅1,2)。时间的昼夜节律系统是一个分层的多振荡器网络,与中央的时钟位于视交叉上核(SCN)同步和协调其他额外的SCN和外设时钟1,2。单个细胞的生成和维护的昼夜节律3,4,这些振荡器在有机体份额显着相似的生化负反馈机制的不同组织类型的功能单元。然而,由于在神经元网络级在SCN和有机体一级通过节奏,系统性的线索的相互作用,在有机体一级的昼夜节律不一定细胞自主5-7。相对于传统的研究在体内的自发活动和SCN外植体离体 ,CELL-总部设在体外实验中可以发现的细胞自主的昼夜缺陷5,8。在战略上,基于细胞的实验模型更易于处理的表型特征和基本时钟机制的快速发现5,8-13。
因为昼夜节律是动态的,纵向的高时间分辨率的测量来评估时钟功能。近年来,实时使用萤火虫荧光素酶的生物发光记录,记者已成为一种常见的技术研究在哺乳动物中的昼夜节律14,15,因为它允许分子节奏的持久性和动态检查。细胞的自我监控的昼夜节律基因表达,荧光素酶记者可以被引入到细胞通过瞬时转染13,16,17或稳定转导5,10,18,19。在这里,我们描述了一个稳定传导协议的慢病毒介导的基因传递。 Ţ他慢病毒载体系统是优于传统的方法,如瞬时转染和生殖传输,因为它的效率和多功能性:它可以有效地提供稳定整合到宿主基因组的分裂和非分裂细胞20。记者细胞系建立之后,时钟功能的动态可以检查通过生物发光记录。我们首先介绍了新一代的P(Per2基因 )-D 吕克记者的线条,然后和其他昼夜记者从目前的数据。在这些实验中,3T3小鼠成纤维细胞和U2OS人骨肉瘤细胞被用作细胞模型。我们还讨论了不同的方式使用这些时钟模型在昼夜节律的研究。这里描述的方法可以应用到多种类型的细胞,研究细胞和分子基础的生物钟,并在处理其他生物系统的问题可能会被证明是有用的。
1。目前的协议的修改
1.1记录装置和吞吐量的考虑
由于其商用中,LumiCycle(Actimetrics)已成为最常用的自动光度计设备实时记录4,5,9,19,29-31的 。 LumiCycle采用光电倍增管(PMT)作为光探测器,它提供了极高的灵敏度和低噪声14,因此特别适合于数据采集极其暗淡的基于荧光素酶发光。其他相似的PMT的设备( 例如 ,克罗诺斯,阿托公司; POL…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持的,部分由美国国家科学基金会(IOS-0920417)(ACL)。
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
FBS | HyClone | SH3091003 | |
Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
All other chemicals | Sigma | ||
Equipment | |||
Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37°C | ||
Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
LumiCycle | Actimetrics |