Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.
In zoogdieren, zijn veel aspecten van het gedrag en de fysiologie, zoals slaap-waak cyclus en de lever metabolisme gereguleerd door endogene circadiane klokken (beoordeeld 1,2). De circadiane tijdwaarneming systeem is een hiërarchisch multi-oscillator-netwerk, met de centrale klok in de suprachiasmatische kern (SCN) synchroniseren en coördineren van extra-SCN en perifere klokken elders 1,2. Individuele cellen de functionele eenheden voor het genereren en onderhouden van circadiane ritmes 3,4, en deze oscillatoren van verschillende weefseltypen in het organisme hebben een opmerkelijk vergelijkbare biochemische mechanisme van negatieve feedback. Vanwege interacties op het neurale netwerk niveau in de SCN en door ritmische, systemische signalen op de organismaal niveau worden circadiane ritmes op organismaal niveau niet noodzakelijk cel-autonome 5-7. Vergeleken met traditionele studies van bewegingsactiviteit in vivo en ex vivo SCN explantaten, cell-gebaseerd in vitro assays zorgen voor ontdekking van cel-autonome circadiane gebreken 5,8. Strategisch, cel-gebaseerde modellen zijn meer experimenteel handelbaarder voor fenotypische karakterisering en snelle ontdekking van de fundamentele klokmechanismen 5,8-13.
Omdat circadiaanse ritmes zijn dynamische, zijn longitudinale metingen met een hoge temporele resolutie die nodig is om klokfunctie te beoordelen. In de afgelopen jaren is real-time opname met bioluminescentie vuurvlieg luciferase reporter als een gebruikelijke techniek voor het bestuderen circadiane ritmes in zoogdieren 14,15, omdat het zorgt voor het onderzoek van de persistentie en dynamica van moleculaire ritmes. Om cel-autonome circadiane ritmes van genexpressie controleren, kan luciferase reporters in cellen worden geïntroduceerd via transiënte transfectie 13,16,17 of stabiele transductie 5,10,18,19. Hier beschrijven we een stabiele transductie protocol met lentivirus gemedieerde genafgifte. Thij lentivirale vector systeem superieur aan traditionele methoden zoals voorbijgaande transfectie en kiemlijntransmissie vanwege de efficiëntie en de veelzijdigheid en maakt het mogelijk efficiënte levering en stabiele integratie in het gastheergenoom van zowel delende als niet-delende cellen 20. Zodra een reporter cellijn wordt vastgesteld, kan de dynamiek van klokfunctie worden onderzocht door middel van bioluminescentie opname. We beschrijven eerst de generatie van P (Per2)-d Luc reporter lijnen, en vervolgens presenteren van gegevens uit deze en andere circadiane verslaggevers. In deze testen worden 3T3 muisfibroblasten en U2OS menselijke osteosarcoomcellen als cellulaire modellen. We bespreken ook de verschillende manieren van het gebruik van deze klok modellen in circadiane studies. Hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op een grote verscheidenheid aan celtypen om de cellulaire en moleculaire basis van biologische klok bestuderen en kan nuttig zijn in de aanpak van problemen in andere biologische systemen.
1. Wijzigingen aan huidige protocol
1.1 Opname apparaten en doorvoer overwegingen
Vanwege de commerciële beschikbaarheid, heeft de LumiCycle (Actimetrics) uitgegroeid tot de meest gebruikte automatische luminometer apparaat voor real-time opname 4,5,9,19,29-31. De LumiCycle werken fotomultiplicatorbuizen (PMTs) als lichtdetectoren, die zeer hoge gevoeligheid en weinig ruis 14 te verschaffen, en is daarom bijzonder geschikt voor data-acquisitie v…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
FBS | HyClone | SH3091003 | |
Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
All other chemicals | Sigma | ||
Equipment | |||
Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37°C | ||
Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
LumiCycle | Actimetrics |