שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.
ביונקים, היבטים רבים של התנהגות ופיזיולוגיה כגון מחזורי שינה והערות וחילוף חומרים כבדים מוסדרים בשעוני יממת אנדוגני (סקר 1,2). המערכת הביולוגית זמן שמירה, היא רשת היררכית רב מתנד, עם השעון המרכזי ממוקם בגרעין suprachiasmatic (SCN) סנכרון ותיאום שעונים-SCN נוסף והיקפיים אחר 1,2. תאים בודדים הם יחידות פונקציונליות לדור ותחזוקה של מקצבי יממה 3,4 ומתנדים אלה של סוגי רקמות שונים בנתח אורגניזם מנגנון משוב דומה להפליא ביוכימי שלילי. עם זאת, בשל אינטראקציות ברמת הרשת העצבית בSCN ובאמצעות רמזים קצביים, מערכתיים ברמת האורגניזם, מקצבי יממה ברמת האורגניזם אינם בהכרח תא אוטונומי 5-7. בהשוואה למחקרים מסורתיים של פעילות של תנועה בגוף חי וexplants SCN vivo לשעבר, גell מבוסס במבחני חוץ גופייה מאפשרת גילוי פגמי תא אוטונומי יממת 5,8. מבחינה אסטרטגית, מודלים מבוססי תאים יותר בניסוי צייתנים לאפיון פנוטיפי וגילוי מהיר של מנגנוני שעון בסיסיים 5,8-13.
בגלל מקצבי יממה הם דינמיים, מדידות אורכות עם רזולוציה גבוהה זמנית נחוצות להערכת תפקוד שעון. בשנים האחרונות, הקלטת פליטת אור בזמן אמת באמצעות בלוציפראז הגחלילית ככתב הפכה לשיטה נפוצה ללימוד מקצבי יממה ביונקים 14,15, שכן היא מאפשרת לבחינה של ההתמדה והדינמיקה של מקצבים מולקולריים. כדי לפקח על מקצבי יממת תא אוטונומי של ביטוי גנים, כתבי וציפראז ניתן הוכנסו לתאים באמצעות transfection החולף 13,16,17 או תמרה יציבה 5,10,18,19. כאן אנו מתארים פרוטוקול תמרה יציבה באמצעות משלוח הגן lentivirus בתיווך. Tמערכת וקטור lentiviral הוא עדיף על שיטות מסורתיות כגון transfection חולף ושידור germline בגלל היעילות והרבגוניות שלו: הוא מאפשר העברה יעילה ויציבה אינטגרציה לתוך הגנום של המארח הוא חלוקה ולא חלוקת תאים-20. ברגע ששורת תאי כתב הוא הקים, את הדינמיקה של פונקציית שעון יכולה להיבחן דרך הקלטת פליטת אור. אנו מתארים לראשונה את הדור (Per2) קווי P-d לוק כתב, ולאחר מכן מציגים נתונים מזה וכתבי יממה אחרים. במבחנים אלה, fibroblasts העכבר 3T3 וU2OS תאי סרטן עצמות אדם משמשים כמודל לסלולרי. אנחנו גם לדון בדרכים שונות של שימוש במודלים אלה במחקרי שעון יממה. שיטות שתוארו כאן ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים ללמוד את הבסיס התאי ומולקולרי של שעוני יממה, ועשויה להיות שימושי בהתמודדות עם בעיות במערכות ביולוגיות אחרות.
1. עשיית שינויים בפרוטוקול הנוכחי
1.1 מכשירי הקלטה ושיקולי תפוקה
בגלל הזמינות המסחרית שלה, LumiCycle (Actimetrics) הפך את מכשיר luminometer האוטומטי הנפוץ ביותר להקלטה בזמן אמת 4,5,9,19,29-31. LumiCycle מעסיק צינורות …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומי למדע (IOS-0920417) (ACL).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
FBS | HyClone | SH3091003 | |
Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
All other chemicals | Sigma | ||
Equipment | |||
Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37°C | ||
Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
LumiCycle | Actimetrics |