Summary
概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。
Abstract
哺乳動物では、行動や睡眠覚醒サイクルと肝臓代謝などの生理機能の多くの側面は、内因性の概日時計（1,2日 ）によって規制されている。サーカディアン計時システムは、同期や他の場所で1,2エクストラSCNおよび周辺クロックを調整する視交叉上核（SCN）に位置し、中央のクロックで、階層的なマルチ発振器ネットワークです。個々の細胞は、概日リズム3,4、および生物シェアの異なる組織型著しく類似した生化学的な負のフィードバック機構のこれらの発振器の生成と維持のための機能部である。しかし、SCNの神経ネットワークレベルおよび生物体レベルでリズミカルな、全身の手がかりを通じて相互作用のために、生物体レベルで概日リズムが細胞自律的な5-7というわけではありません。 生体とSCNの外植片のex vivo、cの自発運動の伝統的な研究に比べエルベースインビトロアッセイは、細胞自律的な概日5,8欠陥の発見を可能にします。戦略的には、細胞ベースのモデルは、表現型の特徴と基本的な時計機構5,8-13の迅速な発見のために、より実験的に扱いやすいです。
概日リズムは動的であるため、高い時間分解能で縦測定は、時計機能を評価する必要があります。近年では、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを用いたリアルタイム生物発光の記録は、それが分子リズムの永続性とダイナミクスの検討を可能にするように、哺乳類14,15の概日リズムを研究するための一般的な手法となっています。遺伝子発現の細胞自律的な概日リズムを監視するには、ルシフェラーゼレポーターは、一過性のトランスフェクション13,16,17または安定した伝達5,10,18,19を介して細胞内に導入することができる。ここでは、レンチウイルス媒介遺伝子送達を用いて安定した伝達プロトコルを記述します。 T彼は、レンチウイルスベクターシステムは、その効率性と汎用性の一過性トランスフェクション及び生殖系列伝達など、従来の方法よりも優れている：それは分割し、非分裂細胞20の両方の宿主ゲノムへの効率的な配信と安定した統合を可能にします。レポーター細胞株が確立されると、時計機能のダイナミクスは、生物発光の記録を使って調べることができます。我々は最初のP（PER2）-D Lucレポーターライン、その後これと他のサーカディアン記者から存在するデータの生成を説明します。これらのアッセイにおいて、3T3マウス線維芽細胞およびU2OSヒト骨肉腫細胞は細胞モデルとして使用されています。我々はまた、概日の研究では、これらのクロックモデルのさまざまな使用方法について説明します。ここで説明する方法は、概日時計の細胞·分子レベルで研究する細胞種の多種多様に適用することができ、かつ他の生物系で問題に取り組む上で役立つことがあります。
Protocol
1。レンチウイルスルシフェラーゼレポーターの構築
哺乳類の概日レポーターコンストラクトは、通常の概日プロモーターがルシフェラーゼ遺伝子と融合された発現カセットを含んでいます。両方のライゲーションと組み換えベースの戦略は、一般的にDNAクローニングのために使用されます。例として、ここでは、不安定化ルシフェラーゼ （D リュック ） はマウスPER2プロモーターの制御下にあるP（PER2）-Dリュックレンチウイルスレポーターを生成するための組換えベースのGatewayクローニング法を説明します。
- PER2プロモーターのクローニング。フォワードプライマー（5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 '）およびリバースプライマー（5'を使用して、上流のマウスPER2 BACクローン9月13日からの転写開始部位の、526 bpのPER2プロモーターDNA断片を増幅するPCRを使用して、 -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '）、および生成するpENTR5'-TOPOベクター（Invitrogen）にクローンpENTR5'-P（PER2）。
- D リュックのクローニング。 D リュックは、前述の 21として急速なタンパク質分解のためにホタルルシフェラーゼ遺伝子とC末端PEST配列を含む。 pENTR / DD リュックを生成するためにpENTR / D-TOPOベクター（Invitrogen）にD リュックの DNA断片、およびクローンを増幅するPCRを使用しています。
- レポーターベクターの構築。レンチウイルスデスティネーションベクタpLV7-BSD（BSD、ブラストサイジン耐性遺伝子）を持つ2つのpENTRプラスミド、pENTR5'-P（PER2）とpENTR / DD リュックを混ぜ、pLV7-BSD-Pを生成するクロナーゼを使用して組換え反応を行う（PER2）-D Lucレポーター（ 図1）。 pLV7-BSDは、式Caのすぐ下流に挿入された中でウッドチャック肝炎ウイルスpLenti6/R4R2/V5-DESTの修正版（我々の研究室で行われた）（Invitrogen）を用い、転写後調節エレメント（WPRE）配列22です遺伝子の発現を増強するssette。
2。レンチウイルス粒子の産生
1。シード293T細胞（1日目）
- 10cmの培養皿に10％FBSおよび1×ペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミン（PSG）を補充したDMEM中でレギュラー90〜100％コンフルエントになるヒト胚性腎（HEK）293T細胞を成長させる。 （低継代数とともに急速に増殖している細胞は、効率的なトランスフェクションのために重要です。）
- 前にPBS中で各ウェルにポリ-L-リジン0.001％の1mlを添加し、20分間室温でインキュベートすることにより、トランスフェクションのために細胞を播種コート6ウェル培養プレートに。液を除き、使用前に1×PBSで一回すすいでください。
- 2ミリリットルレギュラーDMEMでプレコートしたプレートの各ウェルにトリプシンとシードと293T細胞0.75×10 6個の細胞を取り除きます。徹底的に渦巻プレート各ウェル内の細胞の均一な分布を得るために。 37℃で一晩インキュベーター内で細胞を成長させる。
- 1日目から、播種された細胞を観察します。細胞は80〜90％のコンフルエンスに到達する必要があります。
- と3パッケージングベクター（1.3μgのギャグ/ POL、0.5μgの、レンチウイルスレポータープラスミドDNA（劉ラボなどpLV7-P（PER2）-Dリュック ）の2μgを追加することで、1.5 mlのマイクロチューブにプラスミドをトランスフェクション混合物を準備REV、および0.7μgのVSVG、Invitrogen社）。トランスフェクションとその後の感染の両方のコントロールとして、我々は通常、CMVプロモーターの制御下で増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を保有するレンチウイルスGFP発現ベクターのトランスフェクションの追加だけでなく、pLV156-CMV-EGFP（ 図1A）を含み、 20前述したように。
- ステップ2のプラスミドミックスに、0.25MのCaCl 2（2.5MストックからのDNase / RNaseフリーddH 2 Oで希釈したもの）を100μlを加えてよく混合します。その後、2倍のBBS溶液（50mM BE100μlを加えるS、280 mMのNaCl、1.5mMののNa 2 HPO 4、pHは6.95）と、優しく、しかし、完全に混合する。 15分間室温でDNAミックスをインキュベートする。
- 待っている間に、293T細胞から培地を吸引し、2 mlの新鮮な培地に変更します。トランスフェクションの前に培地のpHを平衡化するために、少なくとも10分間インキュベーターにプレートを返す。
- ドロップによる293T細胞降下に手順3からトランスフェクション混合物を追加します。渦巻優しくプレート、顕微鏡下で粒子形成を観察します。 CO 2、37℃で一晩5％でインキュベートする。 （カポ4 / DNA沈殿物の微粒子形成が効率的なトランスフェクションのために重要です。）
3。収穫ウイルス粒子（日3-4）
- 細胞は、100％コンフルエントに達した細胞から培地を吸引し、2 mlの新鮮なレギュラーDMEMで置き換える必要があり、その時点で約16時間トランスフェクション後（3日目）。 37℃で一晩インキュベートする。
- 4日目に、TRANでEGFP発現を観察することにより、トランスフェクション効率を評価sfectionコントロール細胞（高EGFP発現と90〜100％のトランスフェクション効率が良いウイルス予備校の信頼性の高い予測因子である。）
- 分泌され、感染性ウイルス粒子を含む培地を収集します。残留293T細胞を除去し、ウイルスを含む上清を回収し、5分間> 2,000 xgで遠心分離します。あるいは、媒体は、0.45μmのメンブランフィルターでクリアすることができます。ウイルス粒子は感染症で使用するための準備が整いました。
3。 3T3細胞への感染
1。シード3T3細胞（3日目）
翌日20〜30％コンフルエントを取得するために分割し、12ウェルプレート上の3T3細胞のシード適切な数（〜12000）。 37℃で一晩インキュベートする。
2。 3T3細胞（4日目）に感染
- 播種した細胞を観察します。 20〜30％の合流点（50％未満）は、感染症のために望まれている。
- ウイルスを含む回収した培地に5μg/ mlの最終濃度にポリブレンを追加粒子。ピペッティングでよく混ぜる。
- 3T3細胞から培地を吸引除去し、ウェルあたり上記のウイルス混合物1mlを加える。 37℃で一晩インキュベートする。 （ポリブレン感染効率を向上させるために使用されていますが、絶対に必要ではありません。それはいくつかの細胞毒性がありますので、事前の検査が推奨されています。）
3。感染した細胞を（5日目以降）を選択します
- 二十四時間感染後、感染細胞からウイルスとポリブレンを含む培地を吸引除去し、1×PBSで1回洗浄し、新鮮な培地に変更します。 37回復と成長のための℃で一晩インキュベートする。
- ときに合流します（通常1〜2日後）、37℃で一晩インキュベートした細胞を分割します。
- 翌日、細胞から吸引培地（<50％のコンフルエンスが望まれている）と安定形質導入細胞を選択するために、10μg/ mlのブラストサイジンを含む新鮮な培地と交換してください。 （ブラストサイはkill-曲線経験的に特定の細胞株のために決定する必要があります。）
4。レポーター細胞の生物発光の記録
1。シードレポーター細胞
ブラストサイジン耐性レポーター細胞を伝播し、35mm培養ディッシュに分割します。コンフルエントになるまで37℃でインキュベートする。私たちは通常、サーカディアン表現型の各条件の下に各レポーター細胞株に対する≥3料理を準備。
2。同期と記録媒体への変更
- コンフルエントレポーター細胞から培地を吸引除去し、PBSで1回洗浄し、DMEMに、10μMフォルスコリン（または200nMのデキサメタゾン）を含むと交換してください。細胞を同期させるために、1時間37℃でインキュベートする。 （あるいは、細胞を温度サイクル23または血清ショック24で同期させることができます。）
- 待っている間、記録を作成し次のように、3T3細胞用る培地：10％FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン/ GLN、1μMフォルスコリン、1mMのルシフェリン、25mMのHEPES、pH7.4を含む1×DMEM（Hyclone社）。血清およびフォルスコリン濃度は経験的に決定することができる。薄暗い細胞については、フェノールレッドを含まない培地を用いることができる。
- フォルスコリン治療の終了時に、培地を吸引し、作りたての記録媒体と交換してください。
3。レポーター細胞の生物発光の記録
- 培地交換後、蒸発を防ぐために真空グリースで所定の位置に40ミリメートル滅菌カバーガラスとシールで培養皿をカバーしています。
- H 2 OやCO 2をせずに36℃のインキュベーターセットに内蔵されていLumiCycleルミノメーター、上に皿をロードします。
- リアルタイム生物発光の記録を開始します。私たちは通常、二週目のための媒体の変化と連続記録（Savelyev らを参照してください。詳細については）25に続いて、1週間のリズムを記録します。 （96我々の記録のためのLLプレート、シナジーSL2は、記録装置として使用されていました。細部のためのディスカッション1.1を参照）。
5。データ解析とプレゼンテーション
レポーター細胞は、概日時計機能に対する表現型への影響を決定するための重要な高分解能の定量的な発光の記録が容易になります。位相、周期の長さ、リズムの振幅、減衰率などの概日のパラメータを得るために、我々は生物発光5,14データを分析するLumiCycle解析プログラム（Actimetrics）を使用します。簡単に言えば、生データは、ベースラインは最初フィットしており、ベースラインを差し引いたデータはパラメータが決定されるから、正弦波、に取り付けられている。永続的なリズム、> 90％は通常達成されるの適合度を示すためのサンプル。培地交換時に高レベルの過渡生物発光のために、我々は通常解析からのデータの最初のサイクルを除外します。
データプレゼンテーションのために、私たちは通常、TIに対する生データ（生物発光、カウント/秒）をプロット私（日）。必要な場合には、ベースラインを差し引いたデータは、振幅と位相を比較するためにプロットすることができます。
6。代表的な結果
1。フェーズ固有の概日記者
概日時計は、生化学的な負のフィードバック機構1に基づいています。コアフィードバックループは、リズミカルな遺伝子発現を（朝の段階では、 例えば、Rev非ERBαで）を生成するために概E / E'-ボックスエンハンサーエレメントに作用転写活性化因子BMAL1やCLOCK、およびリプレッサーPERSとCRYS、から構成されています。およびROR / REV-ERBバインディング要素（RRE、夜フェーズのため、、コア·ループは、少なくとも2つの他の概日のシスエレメント、DBP/E4BP4バインディング要素（日段階のため、 例えば、Per3 D-ボックス）を調整し、統合例えば、BMAL1）17。複数概要素による組み合わせ調節は、小説の中間相を生成することができます。たとえば、Cry1転写酵素る、別個のCry1夕方時フェーズ13を生じさせる3つのすべての概要素（ すなわち 、E / E'-ボックスおよびD-ボックス要素Cry1遺伝子の第1イントロン中のプロモーターとのRREで）によって媒介される。
遺伝子調節のこれらのメカニズムに基づいて、我々は、4つの異なるレポーター構築物を生成した：調節領域17に、両方のE / E'-ボックスおよびD-ボックス要素を含むP（PER2）-DリュックとP（Cry1）-Dリュックの記者、 26,27、P（Cry1） -すべての3つの要素（ すなわち 、E / E'-ボックス、D-ボックス、およびRRE）13,17によって組み合わせ調節を表すイントロン -D リュック 、およびP（BMAL1）-DリュックレギュもっぱらRRE 9,17,19,21によって。我々は、レポーター発現の予想の明確なフェーズ（ 図2）を生成する3T3細胞にこれらのレポーターを導入しました。
2。 RNAiおよび薬理学的にACTIによる遺伝子ノックダウンveの化合物
トランスフェクション効率が高い場合には、合成siRNAは一過性遺伝子発現をノックダウン細胞にトランスフェクトすることができます。トランスフェクションは、技術的に困難な場合には、shRNA発現ベクターを安定細胞によって産生されるshRNAを遺伝子ノックダウン（KD）のsiRNAに処理されるように、レンチウイルス感染を介して細胞内に導入することができます。ここでは、pLL3.7ゲートウェイ発現ベクター9（ 図3B）を使用して、3T3細胞でU2OS細胞におけるsiRNA（ 図3A）およびshRNAを用いたCry1 Cry2と遺伝子のKDの効果を提示します。 3T3細胞に加えて、U2OSモデルは、市販のヒトsiRNAライブラリーのハイスループットスクリーニング（ 例えば 、ヒト起源、堅牢な概日リズムの検証関数を生成することができるための重要な要件を満たしている主な理由は別の抜群の携帯クロックモデルとなっているすべての既知の時計遺伝子、高効率なトランスフェクション及び影響を受けやすい定量的な発光記録）。両方の種類の細胞では、RNAi媒介KDは以前マウスノックアウト（KO）や携帯KDスタディ5,10,11,28と一貫クロック表現型が得られた。たとえば、Cry1 KD短縮期間の長さとリズムの永続性を低減し、Cry2 KDは期間を長くする一方。さらに、選択された小分子は、薬理学的標的と混乱させるタンパク質の機能（ 図3C）に使用することができます。
図1。レンチウイルス媒介遺伝子送達システム。 2レンチP（PER2）-D LucレポーターベクターおよびCMV-EGFPコンストラクトの（A）の模式図。宿主細胞ゲノムに統合するための唯一の領域が示されています。両方のレポーターコンストラクトでは、d リュックの転写がPER2プロモーターの直接制御下にある。 pLV7-BSD-P（PER2）-D Lucベクター（再で組合せベースのクローニング）、共発現ブラストサイジン耐性遺伝子（BSD）が感染した細胞の選択を容易にする。 pLV156-P（PER2）-D Lucベクター（ライゲーションベースのクローン作成）では、EGFPの翻訳は目視や感染した細胞のFACS選別を可能にする、Dリュックの内部リボソーム侵入部位（IRES）下流によって媒介される。また、SV40プロモーター/ターミネーター（P / T）は絶縁体（議論1.3を参照）として使用されます。 CMV-EGFP制御ベクトル、EGFP発現に強力なCMVプロモーターの制御下にある。トランスフェクションし、感染したGFP発現細胞の（B）の蛍光画像が。これらの細胞におけるGFPの発現によって示されるように、典型的には、我々は、293T細胞の一過性トランスフェクションでは、私たちの興味のある細胞株のレンチウイルス感染の両方で高い効率を達成しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 3T3細胞での生物発光レポーターの位相特異的発現 、この実験で使用したレンチウイルスレポーターベクターは、P（Cry1）-Dリュック、P（Cry1）、pLV7-BSD-P（PER2）-Dリュックです- 。 イントロン -D リュック 、とP（BMAL1）-Dリュック 。矢印で示すように、各記者が、振動の異なる相を示す。 PER2とCry1プロモーターは、朝·日の各フェーズと夜の段階では、Pによる組み合わせ調節（Cry1）でBMAL1プロモーターでピーク生物発光を駆動しながら- イントロン宿すのE-box、D-ボックス、およびRRE要素がピーク生物発光の夕方の位相を与える。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図3。レポーター細胞の概日生物発光リズムの遺伝学的および薬理学的摂動。 （A）は、Cry1の影響およびU2OSレポーター細胞の細胞リズムにsiRNAによるノックダウンCry2。 LumiCycleルミノメーターは、35 mmの培養ディッシュ中の細胞の生物発光の記録のために使用された。図は、適合されている リファレンスエルゼビア（2009年）からの許可を得て、第10位、。3T3レポーター細胞の細胞リズムにshRNAのノックダウンによってCry2の（B）の効果。からU6-shRNAのカセットを含むpLL3.7ゲートウェイベクトルはCry2遺伝子ノックダウンのために使用された。ウェスタンブロット解析（データは示していない）によって決定されるようshRNA2はshRNA1より良いノックダウン効率を有する。シナジールミノメーターは、96ウェルプレートでの細胞の生物発光の記録のために使用された。録音のための設定は次のとおりです。インキュベーター温度33℃、積分時間、15秒; CELでの小分子阻害剤のインターバル時間は、30分（C）の効果U2OSレポーター細胞のlularリズム。 CHIR99021とロスコビチンは、それぞれ、GSK-3およびCDKに対して向けられた阻害剤である。 ViewLuxシステム（CHIR99021アッセイ）とテカンルミノメーター（ロスコビチンアッセイ）384ウェルプレートでの細胞の生物発光のレコーディングのために使用された。図を参照19位（学術著作権2008国立アカデミー、米国）から適合させられます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
1。現在のプロトコルへの変更
1.1記録デバイスとスループットの考慮事項
なぜなら、その商業的利用可能性、LumiCycle（Actimetrics）は、リアルタイムレコーディング4,5,9,19,29-31ための最も一般的に使用される自動化されたルミノデバイスとなっています。 LumiCycleは非常に高感度、低ノイズ14を提供する光検出器として、光電子増倍管（PMTを）採用しており、それゆえ非常に薄暗いルシフェラーゼ生物発光ベースのデータ収集のために特に適している。他の同様のPMTベースのデバイス（ 例えば 、クロノス、ATTO社、およびPOLARstarオプティマ、BMG LABTECH社）も、多くの研究32,33で使用されてきた。
35-mmディッシュを用いLumiCycleアッセイは96に適合させることができます - 、384 - 偶数または1152ウェルプレートフォーマットで、ハイスループットスクリーニング（HTS）の実験のために。 1：HTSアッセイの開発は、主に次の2つの側面に焦点を当てています明るくルシフェラーゼおよび/またはより高いレポーター発現付き）良いレポーター細胞（以下を参照）、およびマルチウェルプレートを収容2）高感度記録装置。私たちと他の人がそのようなシナジーSL2（バイオテック）はInfinite M200（テカン）19、トップカウント（パーキンエルマー）28と、エンビジョン（パーキンエルマー）34など、いくつかのマイクロプレートリーダーを使用している。私たちの研究室では、LumiCycleおよびSynergy両方のデバイスは、温度制御や遮光インキュベーター内に配置されます。リソースが許せばあるいは、記録ユニットは恒温室に配置することができます。 HTSのため、このような統合/露出時間と時間ポイント間の間隔などの重要な設定が与えられたレポーターと記録装置のために経験的に決定されなければならない。
LumiCycleアッセイは、単一細胞の解像度で空間的な情報を提供しません。 Yamaguchi ら 35とウェルシュら 4,5 intでリアルタイム生物発光イメージングを開拓単一細胞の解像度を達成するために、高感度、低ノイズCCDカメラ15で、特別に設計された顕微鏡をegrating。近年では、より高感度イメージングシステムは、CCDと多色フィルタ36,37を乗じ超冷却と裏面照射型電子とLV200（オリンパス）とCellGraph（AB3000-A、B、ATTO）を含めて、市販されるようになってきた。イメージングもGNF自動ロボットシステム（GNFシステム）と組み合わせ、より洗練されたHTSの実験、 例えば 、ViewLux CCDイメージャ（パーキンエルマー社）で使用されています。このシステムは、時計機能10,12,19に影響を与える新規遺伝子および小分子のための大規模な画面を有効にしました。
1.2ルシフェラーゼレポーター
ルシフェラーゼは、まず植物やシアノバクテリア中の1990年代初頭の概日遺伝子発現のリアルタイム発光レコーディングで使用されていた、と一般的に2000年以来29,35,38-40哺乳類系で使用されてきた（LSOはレビュー14,15ページ ） を参照してください。ルシフェラーゼレポーターは、一般的にはるかに低い背景41によるGFPなどの蛍光レポーター、より毒性の少ない、より敏感である。最も一般的に使用される生物発光レポーターはネイティブリュックのコード領域が最適化された転写および翻訳のために修正されたpGL3ベクターシリーズ（プロメガ）で構築ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ（Luc +）です。ホタルルシフェラーゼおよびその高度に安定しており、細胞透過性の基板、D-ルシフェリンの組み合わせは、長期的な記録のために理想的です。 D リュックリュックの修正バージョンです+急速なタンパク質分解を可能にするためには、そのC末端に融合PEST配列と。さらに改良版、Luc2は 、より高い、より少ない異常発現とpGL4 Vectorのシリーズ（プロメガ）をご利用いただけます。しかし、我々は、一過性にトランスフェクトでリュック+とLuc2間のパフォーマンスに有意な差は観察されなかった 3T3およびU2OS細胞（データは示さず）。最近のレポートでは、ブラジルのコメツキ ルシフェラーゼ（E リュック ） は、単一細胞イメージング42に適した、 リュック+よりもはるかに明るいシグナルを示すことが示された。
多くの最近の研究では、mPER2を利用してきました:: LUC融合ノックインレポーターマウス4,5,9,19,25,29-31,43。このレポーターシステムは、SCNを含む細胞や組織外植片のサーカディアン表現型解析を可能にします。我々の以前の研究で、我々は行動的に特徴付け時計遺伝子のノックアウトの多くがこのレポーターマウスラインを通過し、SCN、肝臓、肺外植培養のex vivoで生物発光リズムの動態を検討し、解離したSCNのニューロンおよび in vitro 4 で培養された線維芽細胞において、 5,9,31。これらの研究は、私達は細胞と生物のレベルでクロック動作の分子の詳細に重要な洞察を得ることができました。
1.3遺伝子送達方法
それらは一過性のトランスフェクション11,13,16,17またはレンチウイルス形質5,9,18を介して様々な種類の細胞に導入することができるようe_content ">ベクトルベースクロックの記者は、偉大な汎用性を提供します。面倒が少なく再現性があり、一過性にトランスフェクトした細胞は、することができますがまた、安定な細胞株を生成するために抗生物質の継続的な存在に成長させること。レンチウイルスベクターは、まだ細胞のゲノムだけでなく、より効率的で汎用性にため、その安定した統合が好ましい。で感染した細胞上に提示pLV7ベクトルができるほか抗生物質を選択し、我々は他のベクターを使用しており、例えば、pLV156-P（PER2）-D Lucベクターは、EGFPの翻訳は内部リボソーム侵入によって媒介され、ここで、P（PER2）-Dリュック-IRES-EGFP発現カセットを含む目視および統合を用いた細胞の蛍光活性化細胞選別（FACS）を可能にするD リュックの部位（IRES）下流、EDベクトル5（ 図1）（下記参照）。統合サイトの影響、構成的プロモーターとターミネーター（P / T）からレポーターを遮蔽するために絶縁体として導入やおとりすぐ上流P（PER2）-D Lucレポーター発現カセット（例えばの、底は、 図1Aに構築することができます）と、Brown ら 18とLiu らによって報告された。5これまでの研究では、in vivoおよび/ またはex vivoで 44から48の両方の組織特異的遺伝子摂動の探査のための基礎を確立した。例えば、ウイルス粒子は、SCNスライス標本続いSCNの領域に注入することができます。 ex vivoでアッセイが続く生体内でこれに代わるものとして、SCNのスライスは、高力価のウイルスとのインキュベーションに続いて、第一および培養のex vivo解剖することができます。しかし、比較的厚い組織切片の低感染効率に起因する、非常に一貫性のex vivoでのプロトコルが開発されていない。
細胞系および記録条件の選択1.4
3T3マウス線維芽細胞16,17、U2OSヒト骨肉腫細胞10,11,19,28、およびマウスの線維芽細胞をマウスに9,13由来：ずっと私たちは時計のメカニズムの生化学および細胞生物学について知っているのは、次の3つの細胞モデルに基づいている、34。レンチウイルスベクター系は、割ると非分裂哺乳動物細胞の両方の宿主ゲノムへの効率的な配信と安定した統合を可能にするため、一過性のトランスフェクションのように、特定の種類の細胞に限定されない。携帯と生理反応の広い範囲の調節における概日時計の役割を考えると、今後の研究では、確かに、マウス由来、市販の細胞株もしくは初代細胞、細胞の種類の多種多様に拡張されます。これらの細胞自律的な時計の研究では、組織ubiquを見つける助けになります概日時計のitous、ならびに組織固有のプロパティ。
それはレポーター細胞を生成することは別の記者の実証試験（ 例えば 、様々なベクターおよびプロモーターの種類）、そして時にはさらなる最適化を必要とするかもしれないことは注目に値する。すべての細胞型は細胞自律的なリズムを持っていない。携帯リズムの細胞の健康と持続性を向上させるには、記録媒体の最適化がしばしば必要になります。たとえば、次のように3T3記録媒体に代わるものとして、U2OS細胞に使用する記録媒体は、次のとおりです。1X DMEM（Invitrogen社製）、2％、B-27、1μMフォルスコリン、1mMのルシフェリン、14.5ミリメートルのNaHCO3、10mMのHEPES液（pH7.2）。 1mMのルシフェリンであれば、通常は十分ですが、最終的な濃度（0.1〜1 mM）を各セル/レポータータイプに決定することができる。フォルスコリンは必要ないかもしれません、その濃度は、経験的に、各細胞型について決定されてもよい。
レンチウイルス予備校の1.5トランスフェクション効率
高いTR293T細胞のansfection効率が良好なウイルス準備のために重要である。主要な考慮事項は、293T細胞とトランスフェクション試薬の選択の健康があります。 293T細胞は非常に凝り性であると慎重な取り扱いを必要とすることができます。このように、細胞増殖速度と形態を注意深く監視する必要があります。一貫性のために、我々は血清が最初に試験し、細胞を維持するためにテストされ、その後使用されているのと同じバッチすることをお勧めします。我々は常に新しい2倍のBBSおよびCaCl 2ストック溶液をテストし、高い継代数および/ または遅い成長率を使用すべきでない表示の0.25 Mの細胞の周りにCaCl 2の作業濃度を最適化します。 293T細胞は、トランスフェクション試薬の数と容易にトランスフェです。カポ4に加えて、我々はまたFUGENE 6（ロシュまたはプロメガ）またはリポフェクタミン-2000（Invitrogen）を用いて優れたトランスフェクション効率を達成しました。これらの脂質ベースのトランスフェクション（リポフェクション）試薬が高価であるが、カポ4より良好なトランスフェクション一貫性を与える。フォーR大規模レンチプレップ、我々は、これは低コストのトランスフェクションのためCaPO4の使用をお勧めします。
クローン細胞株の1.6世代
非濃縮粗ウイルス粒子は、形質導入した細胞では比較的低力価（10 6ウイルス粒子/ ml）と、レポーターの発現である低い。これはLumiCycle記録など、ほとんどのアプリケーションで十分ですが、明るい記者は、多くの場合、必要に応じて機密性の低い記録装置を用いて、ハイスループットアッセイで、 例えばされています。レポーターの発現が高い力価のウイルス調製物を使用することで増やすことができます。これを行うには、我々は、より大きな培養容器のトランスフェクションのためのそのようなAS15 10cm皿を使用していて、4日目と5日目に二回メディアを集めることをお勧めします。 10倍濃度（10 7ウイルス粒子/ ml）は、遠心フィルター装置（Millipore）を用いてろ過を行う。前述のように100倍以上の濃度（≥10 8ウイルス粒子/ ml）は、超遠心分離を行う
2。細胞自律的なレポーターの時計モデルの応用
組織または動物モデルとは異なり、細胞ベースのモデルは遺伝的および薬理学的摂動に敏感に反応しており、必要なときに、また、HTSフォーマットで使用します。遺伝子機能の摂動は、過剰発現またはRNAiによるノックダウンすることによって達成することができる。選択的な小分子は、タンパク質の機能を妨害するために使用することができます。ここでは、簡単にD概日リズムの研究では細胞自律的な時計のモデルのいくつかの用途をiscuss。
コアクロック機構の研究2.1
細胞自律的なクロックモデルが大幅機構の研究を促進した。 Hogeneschらは、時計機能11のシステム·レベルの特性を調べるために時計機能16、およびU2OSモデルのために必要とされるCRYSすることによって、そのフィードバック抑制を示すこと3T3モデルを使用していました。 Rev非erbαとβがで冗長な役割を果たしていることを示すために、線維芽細胞モデル- Cry2-/ -その遅延フィードバック抑制が時計機能13のために必要であることを示すために、マウス由来の線維芽細胞モデル、およびBMAL1-/： -我々は、Cry1-/を採用RRE媒介リズミカルな遺伝子発現を調節し、そのBMAL1リズムが批判的にコアクロック機能9は必要ありません。さらに、レポーター細胞内の化学スクリーニングが同定および/またはGSの機能の解明許可K-3β（期間短縮摂動）19、CK1σとε（摂動ときに期間が延長）49、CK1α12。後述するように、これらのモデルは、追加のクロック·コンポーネントの識別を容易にします。戦略的には、これらの携帯電話のモデルは、 インビボ検証と探査のための新しいエントリポイントを提供する基本的なメカニズムの迅速な発見のためのより扱いやすいです。
クロック因子の同定2.2
コアフィードバックループに加えて、時計のメカニズムはまた、多様なシグナリングおよび制御因子を統合しています。追加のクロック成分と修飾子の識別のために、細胞自律的な時計のモデルは本来の致死性、多面的な効果、変異動物モデル50に関連付けられている発達遺伝的補償のため、マウスでの遺伝子スクリーニングよりも有利で ある。機能ゲノミクス適切との組み合わせで、細胞ベースの画面、痛みは、効果的に新しいクロック要因10,28の識別のために画面ゲノムワイドsiRNAおよびshRNAのライブラリに高スループットの記録システムを用いて行われている。同様に、1は、時計機能12,19,34,49に及ぼす影響を研究するための多様な小分子の生物化学的なアプローチと画面を採用することができます。主要な時計遺伝子とその機能が同定されているが、これらの画面は、クロックの調節または調節に関与している追加のコンポーネントや修飾を同定した。これらの修飾子の多くは、同期または非同期キュー（クロック入力）のシグナル伝達を統合するための特定のモダリティを表す。
クロック出力の2.3研究
生体内での実質的にすべての細胞が体内時計を持っていますが、 試験管内で培養された細胞は、必ずしも、あからさまな概日リズムを表示しません。この文脈では、レポーターのアプローチはどうかをテストするための便利なツールを提供時計のメカニズムは、特定の細胞型に存在しています。細胞自律的な時計のメカニズムの存在は、マイクロアレイまたはRNA配列51,52、転写制御ネットワーク、プロテオーム、メタボロームとトランスクリプトームによって含むこれらの細胞において、同様にin vivoでの組織中のクロック出力、の研究を保証するものとします。これらの研究は、ゲノムワイドなRNAおよびタンパク質の発現パターンを調べるため、必然的に内在性発現を反映していないセルベースの発光レポーターアッセイを補完する。
3。細胞自律的な時計モデルの意義
SCNの内および異なる細胞や組織の種類を越えてサーカディアン機能の調整は正常な生理30の重要な側面です。中央SCNおよび周辺クロックは全体の概日、組織のすべての本質的な部分です。 SCNは、明/暗サイクルに網膜から連行に直接入力された光を受信し、コーディネーターとして機能する神経とホルモンの両方の接続を介して周辺クロックを同期させる。内部同期に加えて、周辺組織や細胞内の分子時計仕掛けはまた、最終的に生理機能や行動にあからさまな概日リズムを司る転写出力ネットワーク、無数のオーケストレーションを行います。
したがって、全身および局所の両方の信号は、概日生理を調節し、直接、間接的にSCNが全身から発せられる信号によって規制それらの対細胞自律的なクロックによって規制概日遺伝子を明らかにする必要がある。ペリフェラル·クロックの役割は、全身の影響が除去される、細胞自律的なクロックモデルで研究することができる。肝臓の場合には、組織特異的制御ネットワークはローカル生理学51,53のリズムを生成します。 in vitroおよび in vivo の概日リズムで比較することによって、我々は細胞自律的および全身キュー·ドリブン·クロック機能を区別することができます。実際、recenトンの研究は肝臓遺伝子発現6,51,52における肝クロックのための重要な役割を明らかにし始めている。異なる生理出力を表す様々な組織や細胞型特異的クロックモデルのフィールドワラントの開発における将来の研究。
時計のメカニズムの生化学および細胞生物学のこれまでの研究では、大部分、特に3T3、U2OS、マウスの線維芽細胞、肝臓などの細胞や組織の種類の数が限られ、頼ってきた。最もサーカディアン研究における暗黙の仮定は、クロックは、一般的に7すべての細胞に普遍的に適用することが考えられている一つの細胞または組織型に決定された全ての細胞や組織の種類、および遺伝子機能で同じように動作することです。しかし、より多くの細胞自律的なクロックモデルを確立し、特徴づけることにより、今後の研究では、ローカルサーカディアン生物学の基礎となる組織、特定のクロック特性を明らかにすることが期待されています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、国立科学財団（IOS-0920417）（ACL）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
| DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
| FBS | HyClone | SH3091003 | |
| Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| All other chemicals | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37 °C | ||
| Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
| Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
| LumiCycle | Actimetrics | ||
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