Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.
Memelilerde, davranış ve uyku-uyanıklık döngüsü ve karaciğer metabolizması gibi fizyolojisi birçok açıdan endojen sirkadiyen saat (1,2 yorumlanan) tarafından düzenlenir. Sirkadiyen zaman tutma sistemi senkronize ve başka yerlerde 1,2 ekstra SCN ve periferik saatler koordine suprakiazmatik nükleus (SCN) bulunan merkez saati ile, hiyerarşik bir multi-osilatör ağıdır. Bireysel hücrelerin üretimi ve sirkadiyen ritim 3,4 ve organizma payı farklı doku tiplerinin bir oldukça benzer biyokimyasal negatif geribildirim mekanizmasının bu osilatörler bakımı için fonksiyonel birimlerdir. Bununla birlikte, SCN nöronal ağ seviyesinde ve organizma seviyesinde ritmik, sistemik işaretler ile etkileşimler nedeniyle, organizma seviyesinde ritminin hücre-bağımsız 5-7 olması gerekli değildir. In vivo ve SCN eksplantlar ex vivo, c lokomotor aktivite geleneksel çalışmaları ile karşılaştırıldığındaell-tabanlı cep özerk sirkadiyen kusurları 5,8 keşfi için izin vitro tayinlerde. Stratejik, hücre tabanlı modeller fenotipik karakterizasyonu ve temel saat mekanizmaları 5,8-13 hızlı keşif için daha fazla deneysel uysal vardır.
Sirkadiyen ritim dinamik olduğundan, yüksek zamansal çözünürlüğe sahip boylamasına ölçümleri saat fonksiyonu değerlendirmek için gereklidir. Son yıllarda, bir muhabir olarak ateşböceği lusiferaz kullanarak gerçek zamanlı biyolüminesans kayıt, moleküler ritimlerin sebat ve dinamiklerinin incelenmesi için izin verir gibi, memeliler 14,15 bölgesindeki sirkadiyen ritim eğitimi için ortak bir teknik haline gelmiştir. Gen ekspresyonu hücre-özerk sirkadiyen ritim izlemek için, lusiferaz gazetecilere geçici transfeksiyon 13,16,17 veya stabil transdüksiyon 5,10,18,19 yoluyla hücre içine sokulabilir. Burada lentivirüs-aracılı gen teslimat kullanarak istikrarlı iletimi protokol açıklar. TO lentiviral vektör sistemi böyle nedeniyle verimlilik ve çok yönlülük geçici transfeksiyon ve germline iletimi gibi geleneksel yöntemlere üstündür: bölünerek ve hücreler 20 sigara bölünmesi hem konak genom içine verimli teslimat ve istikrarlı entegrasyonuna izin verir. Bir muhabir hücre hattı kurulduktan sonra, saat fonksiyonu dinamikleri biyolüminesans kayıt yoluyla incelenebilir. İlk olarak P (Per2)-D Luc raportör hatları, ve daha sonra bu ve diğer sirkadyen muhabirlerden mevcut veri üretimini açıklıyoruz. Bu analizlerde, 3T3 fare fibroblastlarının ve U2OS insan osteosarkom hücre hücresel model olarak kullanılmıştır. Biz de sirkadiyen çalışmalarda bu saat modelleri kullanmanın çeşitli yollarını tartışmak. Burada anlatılan Yöntemleri sirkadiyen saatlerin hücresel ve moleküler temeli incelemek için hücre tipleri çok çeşitli uygulanabilir, ve diğer biyolojik sistemlerde sorunlara mücadelede yararlı olabilir.
1. Mevcut Protokol Değişiklikler
1.1 Kayıt cihazları ve üretilen düşünceler
Çünkü ticari durumu, LumiCycle (Actimetrics) gerçek zamanlı kayıt 4,5,9,19,29-31 için en sık kullanılan otomatik luminometre aygıt haline gelmiştir. LumiCycle son derece yüksek hassasiyet ve düşük gürültü 14 sağlamak ışık dedektörü olarak fotoçoğaltıcı borular (Proje Yönetim Ekipleri) kullanır, ve bu nedenle son derece loş lusiferaz …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (IOS-0920417) (ACL) tarafından kısmen desteklenmiştir.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
FBS | HyClone | SH3091003 | |
Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
All other chemicals | Sigma | ||
Equipment | |||
Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37°C | ||
Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
LumiCycle | Actimetrics |