Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Summary

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Abstract

Memelilerde, davranış ve uyku-uyanıklık döngüsü ve karaciğer metabolizması gibi fizyolojisi birçok açıdan endojen sirkadiyen saat ^(1,2 yorumlanan) tarafından düzenlenir. Sirkadiyen zaman tutma sistemi senkronize ve başka yerlerde ^1,2 ekstra SCN ve periferik saatler koordine suprakiazmatik nükleus (SCN) bulunan merkez saati ile, hiyerarşik bir multi-osilatör ağıdır. Bireysel hücrelerin üretimi ve sirkadiyen ritim ^3,4 ve organizma payı farklı doku tiplerinin bir oldukça benzer biyokimyasal negatif geribildirim mekanizmasının bu osilatörler bakımı için fonksiyonel birimlerdir. Bununla birlikte, SCN nöronal ağ seviyesinde ve organizma seviyesinde ritmik, sistemik işaretler ile etkileşimler nedeniyle, organizma seviyesinde ritminin hücre-bağımsız ^5-7 olması gerekli değildir. In vivo ve SCN eksplantlar ex vivo, c lokomotor aktivite geleneksel çalışmaları ile karşılaştırıldığındaell-tabanlı cep özerk sirkadiyen kusurları ^5,8 keşfi için izin vitro tayinlerde. Stratejik, hücre tabanlı modeller fenotipik karakterizasyonu ve temel saat mekanizmaları ^5,8-13 hızlı keşif için daha fazla deneysel uysal vardır.

Sirkadiyen ritim dinamik olduğundan, yüksek zamansal çözünürlüğe sahip boylamasına ölçümleri saat fonksiyonu değerlendirmek için gereklidir. Son yıllarda, bir muhabir olarak ateşböceği lusiferaz kullanarak gerçek zamanlı biyolüminesans kayıt, moleküler ritimlerin sebat ve dinamiklerinin incelenmesi için izin verir gibi, memeliler ^14,15 bölgesindeki sirkadiyen ritim eğitimi için ortak bir teknik haline gelmiştir. Gen ekspresyonu hücre-özerk sirkadiyen ritim izlemek için, lusiferaz gazetecilere geçici transfeksiyon ^13,16,17 veya stabil transdüksiyon ^5,10,18,19 yoluyla hücre içine sokulabilir. Burada lentivirüs-aracılı gen teslimat kullanarak istikrarlı iletimi protokol açıklar. TO lentiviral vektör sistemi böyle nedeniyle verimlilik ve çok yönlülük geçici transfeksiyon ve germline iletimi gibi geleneksel yöntemlere üstündür: bölünerek ve hücreler ²⁰ sigara bölünmesi hem konak genom içine verimli teslimat ve istikrarlı entegrasyonuna izin verir. Bir muhabir hücre hattı kurulduktan sonra, saat fonksiyonu dinamikleri biyolüminesans kayıt yoluyla incelenebilir. İlk olarak P (Per2)-D Luc raportör hatları, ve daha sonra bu ve diğer sirkadyen muhabirlerden mevcut veri üretimini açıklıyoruz. Bu analizlerde, 3T3 fare fibroblastlarının ve U2OS insan osteosarkom hücre hücresel model olarak kullanılmıştır. Biz de sirkadiyen çalışmalarda bu saat modelleri kullanmanın çeşitli yollarını tartışmak. Burada anlatılan Yöntemleri sirkadiyen saatlerin hücresel ve moleküler temeli incelemek için hücre tipleri çok çeşitli uygulanabilir, ve diğer biyolojik sistemlerde sorunlara mücadelede yararlı olabilir.

Protocol

1. Lentiviral Lusiferaz Muhabirleri İnşaatı

Bir memeli sirkadyen raportör yapı genellikle sirkadiyen bir promotör, lusiferaz gen ile birleşmesini sağlayan bir ifade kaseti içerir. Hem ligasyonu ile rekombinasyon bazlı stratejilerin genellikle DNA klonlama için kullanılır. Bir örnek olarak, burada istikrarsız lusiferaz (d Luc) fare Per2 promotörün kontrolü altında olduğu bir P (Per2)-D Luc lentiviral raportör üretilmesi için bir rekombinasyon bazlı ağ geçidi klonlama yöntem açıklanmaktadır.

1. Per2 organizatörü klonlanması. Bir ileri primer (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') ve bir ters primeri (5' ile, yukan doğru bir fare BAC klon Per2 ^9-13 transkripsiyon başlatma sitesinin 526 bp promoter Per2 DNA fragmanı amplifiye etmek için PCR kullanarak -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '), ve pENTR5' TOPO-vektörüne (İnvitrojen) içine klon elde edilmektedirpENTR5'-P (Per2).
2. D Luc klonlanması. D Luc ateşböceği lusiferaz gen ve daha önce ²¹ açıklandığı gibi hızlı protein yıkımı için bir C-terminal PEST dizisi içerir. Pentr / Dd Luc üretmek için pentr / D-TOPO vektörüne (İnvitrojen) içine d Luc DNA fragmanı, ve klon amplifiye etmek için PCR kullanarak.
3. Muhabir vektör İnşaatı. Lentiviral hedef vektör pLV7-BSD (BSD, blasticidin e dirençli gen) ile iki pentr plazmidler, pENTR5'-P (Per2) ve pentr / Dd Luc, karıştırılır, ve bir pLV7-BSD-P oluşturmak için klonaz kullanılarak rekombinasyon tepkime gerçekleştirmek (Per2)-d Luc muhabiri (Şekil 1). pLV7-BSD woodchuck hepatit virüsü transkripsiyon sonrası düzenleyici element (WPRE) dizileri ²² ifadenin ca aşağı hemen takılı edildiği pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) değiştirilmiş bir sürümü (bizim laboratuarımızda yapılan) gen ekspresyonunu artırmak için ssette.

2. Lentiviral Parçacıkların Üretimi

1. Tohum 293T hücreleri (1. gün)

1. % 10 FBS ve 1x 10 cm kültür tabaklarında üzerine Penisilin-Streptomisin-Glutamin (PSG) ile desteklenmiş düzenli DMEM% 90-100 izdiham insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri büyümek. (Düşük geçiş sayısı ile hızla büyüyen hücreler verimli transfeksiyon için önemlidir.)
2. Önceki her oyuğa PBS içinde% 0.001 poli-L-lizin, 1 ml eklenmesi ve 20 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe ile transfeksiyon, ceket 6 oyuklu kültür plakaları için hücreler ile tohumlama. Solüsyonu aspire ve kullanımdan önce 1x bir kez PBS ile yıkayın.
3. Tripsin ve tohum 0.75 ile 293T hücreleri ayrışır 2 x 10 ml normal DMEM ile önceden kaplanmış plakalar her bir yanı üzerine ⁶ hücre. Karıştırıcı levha iyice her bir kuyu içinde hücrelerinin eşit bir dağılım elde edilir. 37 ° C'da gece boyunca kuluçka makinesi içinde hücreler büyütün.

Capo ₄ / DNA yağış (2. gün) aracılığıyla tep "> 2. Geçici transfeksiyon

1. Gün 1 numaralı seribaşı hücreleri gözlemleyin. Hücre% 80-90 arasında izdiham ulaştırılması gerekmektedir.
2. Ve 3 paketleme vektörleri (1.3 ug Gag / Pol, 0.5 ug; lentiviral raportör plazmid DNA 2 mg (Liu laboratuvar örneğin, pLV7-P (Per2)-d Luc) ilave edilerek 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın Rev, ve 0.7 mikrogram VSVG; Invitrogen). Transfeksiyondan ve sonraki enfeksiyon her ikisi için bir kontrol olarak, genellikle, CMV promotörün kontrolü altında gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) barındıran bir lentiviral GFP ifade vektörü için transfeksiyon ek bir yanı, pLV156-CMV-EGFP (Şekil 1A) da içermektedir daha önce ²⁰ tarif.
3. 2. adımda plazmid karışımı 0.25 M _CaCl2 100 ul (2,5 M stoktan DNaz / RNaz-serbest GKD ₂ O ile seyreltilmiş) ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra 2x BBS çözeltisinden 100 ul (50 mm eklemekS, 280 mM NaCl, 1.5 ₂ HPO _4, pH 6.95) Na mM ve yavaşça ama iyice karıştırın. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında DNA karışımı inkübe edin.
4. Beklerken, 293T hücreleri orta aspirat ve 2 ml taze orta değiştirin. Transfeksiyondan önce ortam pH dengelemek için, en azından 10 dakika boyunca kuluçka makinesi ile levha geri dönün.
5. Damla 293T hücreleri damlasına kadar adım 3 transfeksiyon karışımı ekleyin. Swirl hafifçe plaka ve mikroskop altında partikül oluşumunu gözlemlemek. % 5 ° C de bir gece _CO2, 37 inkübe edin. (Capo ₄ / DNA çökelti Güzel parçacık oluşumu verimli transfeksiyon için önemlidir.)

3. Hasat viral partiküller (günde 3-4)

1. Hakkında 16 saat sonrası transfeksiyon (günde 3) hangi zaman hücreler,% 100 izdiham ulaşması gerektiğini hücrelerinden orta aspirat ve 2 ml taze düzenli DMEM ile değiştirin. 37 ° C de bir gece inkübe edin.
2. 4. günde, tran EGFP ifade gözlemleyerek transfeksiyon verimliliği değerlendirmeksfection kontrol hücreleri (yüksek EGFP ifadesi ile% 90-100 arasında Transfeksiyon verimliliği iyi bir viral hazırlık güvenilir bir belirleyicisidir.)
3. Salgılanan, bulaşıcı viral partiküller içeren orta toplayın. Rezidüel 293T hücreleri kaldırmak ve virüs içeren süpernatant toplamak için 5 dakika süreyle> 2.000 x g'de santrifüjleyin. Alternatif olarak, ortam bir 0.45 mikron membran filtre ile temizlenebilir. Viral parçacıkların enfeksiyon kullanıma hazırdır.

3. 3T3 Hücreleri Enfeksiyon

1. Tohum 3T3 hücreleri (günde 3)

12-plaka üzerinde Split ve 3T3 hücreleri tohum uygun sayıda (~ 12.000) tarafından ertesi gün% 20-30 izdiham elde etmek. 37 ° C de bir gece inkübe edin.

2. 3T3 hücreleri (günde 4) Infect

1. Numaralı seribaşı hücreleri gözlemleyin. % 20-30 (en az% 50) izdiham enfeksiyon için arzu edilir.
2. Viral içeren toplanmış ortama 5, ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona polybrene eklemeparçacıklar. Pipetleme ile iyice karıştırın.
3. 3T3 hücreleri, orta aspire ve kuyu başına yukarıda viral karışım 1 ml ekleyin. 37 ° C de bir gece inkübe edin. (Polybrene enfeksiyon etkinliğini arttırmak için kullanılır, ancak kesinlikle gerekli değildir. Bazı hücrelere karşı toksik olabilir gibi, testten önce önerilir.)

3. Enfekte hücreler (Günde 5 ve yukarısı) seçin

1. Yirmi dört saat sonrası enfeksiyon, enfekte olmuş hücrelerde virüs ve polybrene içeren orta aspire, 1x kez PBS ile yıkayın ve taze orta değiştirin. 37 iyileşme ve büyüme için ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. Ne zaman konfluent (genellikle 1-2 gün sonra), 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri ve ayrıldı.
3. Ertesi gün, aspirat hücreleri (<% 50 kesişme noktası tercih edilir) arasından orta ve stabil bir şekilde seçmek için 10 ug / ml Blasticidin içeren taze aracı madde ile yerine hücreleri transdük. (Blasticidin kill-eğrisi ampirik belirli bir hücre hattı için tespit edilmesi gerekmektedir.)

4. Muhabir Hücrelerinin Biyoparlaklık Kaydı

1. Tohum muhabiri hücreleri

Blasticidin dayanıklı muhabiri hücreleri yayma ve 35-mm'lik kültür kaplarına yayılmıştır. Konfluent kadar 37 ° C'de inkübe edin. Biz genellikle sirkadiyen fenotipleme için her koşulda, her muhabiri hücre hattı için ≥ 3 yemekleri hazırlamak.

2. Senkronizasyon ve kayıt ortamı değişiklik

1. Konfluent muhabiri hücrelerden orta aspire kez PBS ile yıkayın ve DMEM 10 uM forskolin (veya 200 nM deksametazon) içeren ile değiştirin. Hücreler senkronize etmek için 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. (Alternatif olarak, hücre sıcaklık döngüleri ²³ veya serum şok ²⁴ ile senkronize edilebilir.)
2. Beklerken, kayıt hazırlamakaşağıdaki gibi 3T3 hücreleri için ing orta: FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 uM forskolin, 1 mM lusiferin, 25 mM HEPES, pH 7.4 ile% 10 oranında içeren 1x DMEM (HyClone). Serum ve forskolin konsantrasyon ampirik olarak belirlenmektedir. Çok loş hücreleri, fenol kırmızı içermeyen aracı madde kullanılabilir.
3. Forskolin ile tedavi sonunda, ortam aspire ve taze kayıt ortamı ile değiştirin.

3. Raportör hücrelerin Bio-ışıldama, kayıt

1. Orta değişikliğinin ardından, buharlaşmayı önlemek için vakum gres ile yerde 40 mm steril lamelleri ve mühür ile kültür kaplarına kapsamaktadır.
2. H ₂ O veya CO ₂ olmadan 36 ° C'de bir inkübatör set içinde tutulur LumiCycle luminometre, üzerine yemekleri yükleyin.
3. Gerçek zamanlı biyolüminesans kayda başlayın. Biz genellikle bir ikinci hafta için orta değişim ve sürekli kayıt (Savelyev ark. Ayrıntılar için) ^25, ardından 1 hafta ritimleri kaydetmek. (96-biz kayıt edilmesi için,ll plakaları, Sinerji SL2 kayıt cihazı olarak kullanılan; detaylar için Tartışma 1.1).

5. Veri Analizi ve Sunumu

Muhabir hücreleri sirkadiyen saat fonksiyonu üzerinde fenotipik etkileri belirlemek için kritik yüksek çözünürlüklü kantitatif lüminesans kayıt kolaylaştırır. Faz, periyot uzunluğu, ritim genlik ve sönüm oranı dahil sirkadiyen parametrelerini elde etmek için, biz biyolüminesans verileri ^5,14 analiz LumiCycle Analiz programı (Actimetrics) kullanın. Kısaca, ham veri taban ilk donatılmıştır ve bazal çıkarıldığı veri parametreleri belirlenmiştir hangi bir sinüs dalgası için donatılmıştır. Kalıcı ritimleri,>% 90 genellikle elde edilir iyiliği-of-fit gösteren örnekler için. Orta değişim üzerine yüksekten geçici biyoparlaklık nedeniyle, biz genellikle analiz verilerinin ilk döngüsü hariç.

Veri sunumu için, genellikle ti karşı ham veri (biyoparlaklık, sayım / sn) çizmekBana (gün). Gerektiğinde, bazal çıkarıldığı veri genlik ve faz karşılaştırmak için çizilebilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

1. Faz-spesifik sirkadiyen gazetecilere

Sirkadiyen saat biyokimyasal bir negatif geri bildirim mekanizması ¹ dayanmaktadır. Çekirdek geribesleme döngüsü ritmik gen ekspresyonu (sabah faz, örneğin, Rev-erb α ile) üretmek için sirkadiyen E / E'-box arttırıcı unsurları harekete transkripsiyonel aktivatörleri BMAL1 ve SAAT ve baskılayıcılar pers ve crys oluşmaktadır. Çekirdek döngü en az diğer iki sirkadiyen cis-elementler, DBP/E4BP4 bağlama elemanı düzenler ve entegre (D-box; günlük faz, örneğin, Per3 için); gece faz ve ROR / REV-ERB bağlama elemanı (HKD örneğin, BMAL1) ^17. Birden sirkadiyen elemanları tarafından Kombinatoryal düzenleme yeni ara fazları üretebilirsiniz. Örneğin, Cry1 transkripsiyontion farklı Cry1 akşam-zaman aralığı ¹³ 'nün her üç sirkadyen elemanları (Cry1 geninin ilk intron içinde promotör ve RREs yani, D / E'-kutu ve D-box elemanları), aracılık etmektedir.

Gen regülasyonu bu mekanizmaların dayanarak, dört farklı muhabiri yapıları oluşturulur: P (Per2)-d Luc ve P (Cry1) E / E'-box ve düzenleyici bölgesinde ¹⁷ D-box elemanları hem de içeren-d Luc ^{gazetecilere, 26,27;} P (Cry1) - Tüm üç unsur tarafından kombinatoryal düzenlenmesi (örneğin, E / E'-kutusu, D-box ve HKD) ^13,17 temsil Intron-d Luc ve P (BMAL1)-d Luc düzenlenmiş münhasıran RRE ^9,17,19,21 tarafından. Biz muhabiri ifade beklenen farklı faz (Şekil 2) üretmek için 3T3 hücreleri içine bu gazetecilere tanıtıldı.

2. RNAi ve farmakolojik acti yoluyla Gen devirmeDaha önce bileşikleri

Transfeksiyon verimliliği yüksek olduğunda, sentetik siRNA geçici gen ekspresyonu yıkmak için hücrelere transfekte edilebilir. Transfeksiyondan teknik olarak zor olduğunda, bir ifade vektörü shRNA hücre tarafından üretilen shRNA gen devirme (KD) için siRNA için işlemden geçirilir, böylece stabil bir şekilde lentiviral enfeksiyon yoluyla hücre içine transdüksiyon ile olabilir. Burada bir ağ geçidi pLL3.7 ifade vektörü ⁹ (Şekil 3B) kullanılarak 3T3 hücreleri içinde U2OS hücrelerinde siRNA (Şekil 3A) ve shRNA kullanılarak Cry1 ve cry2 genlerin KD etki yaratmadığı. 3T3 hücreleri ek olarak, U2OS modeli, piyasada bulunan bir insan siRNA kütüphanelerinin yüksek verimli tarama teknikleri (örn., insan kaynaklı, sağlam sirkadyen ritim, nin onaylanmış fonksiyon üretme yeteneğine sahip için anahtar gereksinimlerini büyük ölçüde karşılayan bir üstün hücresel saat modeli olmuştur bilinen tüm saat genler ve yüksek verimli transfeksiyon ve mükellefkantitatif lüminesans kaydı). Her iki hücre tiplerinde, RNAi-aracılı KD önceki fare nakavt (KO) ve hücresel KD çalışmalar ^5,10,11,28 ile tutarlı saat fenotipler ile sonuçlanmıştır. Örneğin, Cry1 KD kısaltır süre uzunluğu ve ritim sebat azaltır, cry2 KD dönemi uzatır oysa. Buna ek olarak, seçilmiş küçük moleküller ve farmakolojik olarak hedef protein işlevi perturb (Şekil 3C) için de kullanılabilir.

Şekil 1. Lentivirüs-aracılı gen dağıtım sistemi. İki lentiviral P (Per2)-d Luc muhabiri vektörler ve CMV-EGFP (A) şematik diyagramı oluşturmak. Konak hücre genomu içine entegre için sadece bölge gösterilmiştir. Her iki muhabiri yapıları, d Luc transkripsiyon Per2 organizatörü doğrudan kontrolü altındadır. PLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vektör (rekombinasyon bazlı klonlama), bir coexpressed Blasticidin direnç geni (BSD) ile enfekte olan hücrelerin seçilmesi mümkündür. PLV156-P (Per2) In-d Luc vektörü (ligasyon bazlı klonlama), EGFP çeviri görsel gözlem ile enfekte olmuş hücreler FACS sıralamak için izin veren bir dahili ribozom giriş bölgesini (IRES) d Luc aşağı aracılık etmektedir. Buna ek olarak, bir SV40 promoter / terminatör (P / T) bir yalıtkan (tartışma 1.3) olarak kullanılır. CMV-EGFP kontrol vektör olarak, EGFP ifade güçlü bir CMV promotörün kontrolü altındadır. Transfekte edilen ve enfekte GFP-ifade eden hücrelerin (B) Floresan görüntüler. Genellikle, 293T hücreleri geçici transfeksiyon ve bu hücreleri GFP ile gösterilir bizim ilgi hücre hatları, lentiviral enfeksiyon hem de yüksek verim elde etmek. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. 3T3 hücreleri biyolüminesans gazetecilere Faz-spesifik ekspresyonu Bu deneyde kullanılan lentiviral muhabiri vektörleri pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, ve P (BMAL1)-d Luc. Her bir raportör olarak oklarla gösterilen salınım farklı bir faz sergiler. Per2 ve sabah günlük evreleri ve gece aşamasında BMAL1 organizatörü, P (Cry1) tarafından kombinatoryal düzenlenmesine Cry1 yararlanıcı sürücü pik biyolüminesans iken - Intron E-box barındıran, D-box ve RRE elemanlar pik biyolüminesensin akşamı faz bahşeder . büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3. Muhabir hücrelerinde sirkadiyen biyolüminesans ritimlerin genetik ve farmakolojik pertürbasyon. (A) Cry1 Etkileri ve U2OS muhabiri hücresel ritimleri siRNA'lar tarafından cry2 devirme. LumiCycle luminometrede 35 mm tabaklar içinde hücre biyolüminesans kayıt için kullanılmıştır. Şekil uyarlanmıştır Referans Elsevier (2009) izni ile 10.. 3T3 muhabiri hücresel ritimleri shRNAs tarafından cry2 knockdown (B) Etkileri. gelen Bir U6-shRNA kaset içeren bir ağ geçidi pLL3.7 vektör cry2 gen demonte için kullanılmıştır. shRNA2 Western blot analizi (veriler gösterilmemiştir) tarafından belirlendiği gibi shRNA1 daha iyi bir devirme verimliliğine sahiptir. A Sinerji luminometrede 96 çukurlu bir plaka içinde biyolüminesans hücrelerin kayıt için kullanılmıştır. Kayıt için ayarları aşağıdaki gibidir:. Inkübatör sıcaklığı, 33 ° C; entegrasyon süresi, 15 saniye; cel küçük molekül inhibitörlerin zaman aralığı, 30 dk (C) EtkileriU2OS raportör hücre lular ritim. Chir99021 ve Roscovitine sırasıyla, GSK-3 ve CDK karşı inhibitörleridir. ViewLux sistemi (Chir99021 tahlil) ve bir Tecan luminometrede (Roscovitine tahlil) 384 oyuklu plakalar hücre biyolüminesans kayıtlar için kullanılmıştır. Şekil Referans # 19 (Bilimler Copyright 2008 Ulusal Bilimler Akademisi, ABD) 'den uyarlanmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

1. Mevcut Protokol Değişiklikler

1.1 Kayıt cihazları ve üretilen düşünceler

Çünkü ticari durumu, LumiCycle (Actimetrics) gerçek zamanlı kayıt ^{4,5,9,19,29-31} için en sık kullanılan otomatik luminometre aygıt haline gelmiştir. LumiCycle son derece yüksek hassasiyet ve düşük gürültü ¹⁴ sağlamak ışık dedektörü olarak fotoçoğaltıcı borular (Proje Yönetim Ekipleri) kullanır, ve bu nedenle son derece loş lusiferaz bazlı biyolüminesensin veri toplama için özellikle uygundur. Diğer benzer PMT tabanlı aygıtlar (örneğin, Kronos, Atto Co ve POLARstar Optima, BMG Labtech Inc) birçok çalışmada ^32,33 da ^{kullanılmıştır.}

35 mm yemekleri kullanarak LumiCycle denemesi 96 adapte edilebilir -, 384 - yüksek çıktılı tarama (HTS) deneyleri için hatta 1.152-plaka formatları. 1: HTS analizinin geliştirilmesi özellikle aşağıdaki iki yönleri üzerinde duruluyor) Iyi bir gazeteci parlak lusiferaz ve / veya daha yüksek muhabiri ifade (aşağıya bakınız) ile hücreler, ve 2) çoklu-kuyucuğu karşılamak son derece hassas kayıt cihazları. Biz ve diğerleri, bu gibi Sinerji SL2 (Biotek), Sonsuz M200 (Tecan) ^19, TopCount (Perkin Elmer) ^28, ve EnVision (Perkin Elmer) ³⁴ gibi çeşitli mikrolevha okuyucu kullanılmıştır. Bizim laboratuvarda, LumiCycle ve Sinerji cihazlar hem sıcaklık kontrollü ve ışık geçirmez inkübatör yerleştirilir. Kaynaklar izin Alternatif olarak, kayıt birimleri sıcaklık kontrollü bir odaya yerleştirilir. HTS için, bu tür entegrasyon / pozlama süresi ve zaman noktaları arasındaki aralığı gibi kritik ayarlar, belirli bir muhabir ve kayıt cihazı için ampirik olarak tespit edilmelidir.

LumiCycle tahlil tek hücre çözünürlükte mekansal bilgi vermemektedir. Yamaguchi et al. ³⁵ ve Welsh ve ark. ^4,5 int göre, gerçek zamanlı biyolüminesans görüntüleme öncülüktek hücre çözünürlük elde etmek için son derece hassas, düşük gürültülü CCD kamera ¹⁵ ile özel tasarlanmış bir mikroskop egrating. Son yıllarda, daha duyarlı görüntüleme sistemleri LV200 (Olympus) ve CCD ve renkli filtreler ^36,37 çoğaltan bir ultrasensitif soğutmalı ve arka-aydınlatmalı elektron ile CellGraph (AB3000-B, Atto) dahil olmak üzere, ticari olarak mevcut hale gelmiştir. Görüntüleme ayrıca örneğin daha sofistike HTS deneyler, GNF otomatik robot sistemi (GNF Systems) ile kombine bir ViewLux CCD (Perkin-Elmer) olarak kullanılmıştır. Bu sistem saat fonksiyonu ^10,12,19 etkileyen yeni genlerin ve küçük moleküller için büyük ölçekli ekranlar etkin.

1.2 Lusiferaz gazetecilere

Luciferases önce bitki ve siyanobakteriler içinde 1990'lı yılların başlarında sirkadyen gen ekspresyonunun gerçek-zamanlı kayıt ışıldama kullanılmıştır, ve genellikle 2000 ^29,35,38-40 (a beri memeli sistemi kullanılmıştırLSO) yorumları ^14,15 bkz. Lusiferaz gazetecilere genellikle çok daha düşük arka ⁴¹ nedeniyle bu tür GFP gibi floresan gazetecilere, daha az toksik ve daha hassastır. En sık kullanılan biyolüminesans raportör ateş böceği (Photinus pyralis) lusiferaz (Luc +) doğal Luc kodlama bölgesi optimize transkripsiyon ve çeviri için modifiye edildiği pGL3 vektörü serisi (Promega) içinde inşa edilmiştir. Olduğu Ateş böceği lusiferaz ve son derece stabil ve hücre-geçirgen alt tabaka, D-lusiferin, kombinasyonu, uzun süreli kayıt için idealdir. d Luc Luc değiştirilmiş bir sürümü + hızlı protein yıkımı için izin vermek için, C-terminalinde kaynaşmış bir PEST sırası ile. Daha da geliştirilmiş bir versiyonu, Luc2, daha yüksek ve daha az anormal ekspresyonu ile pGL4 vektör serisi (Promega) mevcuttur. Ancak, geçici olarak transfekte Luc + ve Luc2 arasında performans açısından anlamlı farklılık gözlenmedi 3T3 ve U2OS hücreleri (veriler gösterilmemiştir). Yakın tarihli bir raporunda, Brezilyalı tıklatın böceği lusiferaz (E Luc) tek hücre görüntüleme ⁴² için uygun Luc + çok daha parlak sinyal, gösterdikleri edildi.

Birçok yeni çalışmalar mPER2 avantajı almış :: LUC füzyon knock-in muhabiri fare ^{4,5,9,19,25,29-31,43.} Bu muhabir sistemi SCN dahil hücreleri ve doku eksplant sirkadiyen fenotipleme sağlar. Daha önceki çalışmalarda, biz davranışsal karakterize saatin gen Knockouts birçok ile bu muhabir fare çizgisini geçti ve SCN, karaciğer ve akciğer eksplant kültür ex vivo biyolüminesans ritimlerin dinamikler incelenecek ve ayrışmış SCN nöron ve in vitro ⁴ kültüre fibroblast ^{içinde, 5,9,31.} Bu çalışmalar bize hücre ve organizma düzeyinde saatin çalışma moleküler detaya önemli anlayışlar kazanmak için izin verdi.

1.3 Gen teslimat yöntemleri

onlar geçici transfeksiyon ^11,13,16,17 veya lentiviral transdüksiyon ^5,9,18 aracılığıyla çeşitli hücre tipleri içerisine sokulabilir gibi e_content "> Vektör tabanlı saati gazetecilere, çok yönlülüğü sağlar. hantal ve daha az tekrarlanabilir, geçici olarak transfekte hücreler yapabilirsiniz rağmen ayrıca stabil hücre hatları oluşturmak için antibiyotik sürekli varlığında yetiştirilmelidir. lentiviral vektörleri yine çünkü hücre genomuna yanı sıra, daha verimli ve daha çok yönlülük içine kararlı bütünleşmesinin tercih edilir. enfekte olan hücreler olabilir, ki içinde, yukarıda sunulan pLV7 vektör yanı sıra Antibiyotik seçilmiş, diğer vektörler kullanılabilir olmayabilir. Örneğin, pLV156-P (Per2)-d Luc vektör, bir P (Per2)-D-Luc IRES-EGFP ifade kaseti EGFP çeviri bir iç ribozom giriş tarafından aracılık edildiği içerir bütünleşik hücrelerin görsel gözlem ve floresan aktive hücre sıralama (FACS) için izin d Luc sitesi (IRES) aşağı,ed vektörler ⁵ (Şekil 1) (aşağıya bakınız). Bütünleşme yer etkileri, bir konstitütif promotör ve terminatör (P / T) ve muhabir korumak için bir izolatör olarak katılabilmekte ya da decoy hemen akış yukarısında P (Per2)-D Luc raportör ifade kaseti (örneğin, alt Şekil 1A içinde inşa edilebilir ) ve Brown ve ark. ¹⁸ ve Liu ve ark. ⁵

Önceki çalışmalar in vivo ve / veya ex vivo ^44-48 hem doku-spesifik genetik pertürbasyon araştırılması için zemin oluşturmuştur. Örneğin, viral partiküller SCN dilim hazırlama, ardından SCN bölge içine enjekte edilebilir. Ex vivo deneyi takiben in vivo olarak buna bir alternatif olarak, SCN dilimler yüksek titresi virüs ile inkübasyon, ardından birinci ve ex vivo kültive parçalara edilebilir. Ancak, nispeten kalın dilimler doku enfeksiyonu, düşük verim nedeniyle,son derece tutarlı ex vivo protokolünün geliştirilmesi gerekmektedir.

Hücre hatları ve kayıt koşulları 1.4 Seçimi

3T3 fare fibroblast ^16,17, U2OS insan osteosarkom hücrelerinin ^10,11,19,28, ve fare fibroblastlar fareler ^9,13 türetilmiştir: Much biz saat mekanizmasının biyokimyası ve hücre biyolojisi hakkında bildiklerimizin üç hücresel modelleri esas ^{, 34.} Lentiviral vektör sistemi Memeli hücrelerinde bölünmesi ve non-bölme hem ev sahibi genom içine etkili biçimde aktarılması ve kararlı entegrasyonuna izin verir ve bu nedenle, geçici transfeksiyon de olduğu gibi bazı hücre tipleri ile sınırlı değildir. Hücresel ve fizyolojik tepkilerin geniş bir düzenleme içinde sirkadiyen saatlerin rol göz önüne alındığında, daha sonraki çalışmalarda kesinlikle fareler elde edilen ya da ticari olarak temin hücre çizgileri veya birincil hücreler, hücre tipleri çok çeşitli genişletmek olacaktır. Bu hücre-özerk saat çalışmalarda doku ubiqu keşfetmenize yardımcı olacaktırsirkadyen saatlerin itous gibi doku-spesifik özellikleri.

Bu muhabir üreten hücreleri (örneğin, çeşitli vektör ve organizatörü türleri) değişik gazetecilere ampirik test gerektirir ve bazen daha fazla optimizasyon olabilir dikkati çekiyor. Tüm hücre tipleri hücre-özerk ritimleri var. Hücre sağlığı ve hücresel ritimleri sebat, kayıt ortamının optimizasyonu geliştirmek için genellikle gereklidir. Aşağıdaki gibi, örneğin 3T3 kayıt ortamı için bir alternatif olarak, U2OS hücreleri için kullanılan kayıt ortamıdır: 1x DMEM (Invitrogen),% 2 B-27, 1 uM forskolin, 1 mM lusiferin, 14.5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES (pH 7.2). 1 mM lusiferin genellikle yeterlidir, fakat bir nihai konsantrasyon (0.1-1 mM) her bir hücre / raportör türü için tespit edilebilir. Forskolin gerekli olmayabilir ve bu konsantrasyon ampirik olarak her bir hücre tipi için tespit edilebilir.

Lentiviral hazırlık 1.5 Transfeksiyon verimliliği

Yüksek tr293T hücreleri ansfection verimlilik iyi bir viral hazırlık için önemlidir. Başlıca konular bir transfeksiyon reaktif 293T hücreleri ve seçim sağlık bulunuyor. 293T hücreleri çok titiz ve dikkatli kullanım gerektirir. Böylece hücre büyüme oranı ve morfolojisi dikkatle izlenmesi gerekir. Tutarlılık sağlamak için, serum test edilecek birinci ve hücreleri korumak için kullanılan aynı sonra test edilen yığın önerilir. Biz her zaman yeni 2x BBS ve _CaCl2 stok çözümleri denemek ve yüksek geçiş sayısı ve / veya yavaş büyüme oranı kullanılmaması gerektiğini gösteren 0.25 M. Hücreleri çevresindeki CaCl ₂ çalışma konsantrasyonu optimize. 293T hücreleri kolayca transfeksiyon reaktiflerin bir dizi transfectable edilir. Capo ₄ yanı sıra, aynı zamanda Fugene 6 (Roche veya Promega) ya da lipofektamin-2000 (Invitrogen) ile mükemmel transfeksiyon verimliliği elde. Bu lipid tabanlı transfeksiyon (lipofection) reaktifler daha pahalıdır, ama Capo ₄ daha transfeksiyon kıvamı vermek. For büyük ölçekli lentiviral preparatlarıyla, çünkü biz daha düşük maliyet transfeksiyon için CaPO4 kullanmanızı öneririz.

Klonal hücre hatları, 1.6 Üretimi

Un-konsantre ham viral partiküller nispeten düşük titrede (10 ⁶ viral parçacıkların / ml), ve de muhabir ifade hücreleri düşüktür transdük. Bu LumiCycle kayıt gibi bir çok uygulama için yeterli olmakla birlikte, daha parlak muhabirler genellikle, gerekli bir az hassas kayıt cihazı kullanılarak yüksek verim tayinlerde örneğin edilmektedir. Muhabir ifadesi yüksek titrede viral preparatlarıyla kullanılarak artırılabilir. Bunu yapmak için, biz transfeksiyon için büyük kültür gemiler böyle AS15 cm yemekleri kullanarak ve gün 4 ve 5. günde iki kez medya toplama öneririz. 10x konsantrasyonu (10 ⁷ viral parçacıkların / ml) için, santrifüj filtre cihazları (Millipore) kullanılarak filtrasyon gerçekleştirmek. Daha önce tarif edildiği gibi 100x ya da daha çok konsantrasyon (≥ 10 ⁸ viral partiküller / ml) için, ultra-santrifüj yapmak 5,18 gibi önemli sirkadiyen parametreleri değiştirmez, olduğunu kaydetti. Homojen bir hücre popülasyonu istenirse, klonal hücre hatları 96 oyuklu plakalar sıralama FACS tabanlı tek bir hücre elde edilebilir. Ancak bu klonal hücreler dikkatle incelenmelidir şarttır; hücre morfolojisi ebeveyn hücreler ayırt olmalı ve bu süre uzunluğu ve genlik olarak saat özellikleri enfekte hücre popülasyonu temsil etmelidir.

2. Hücre-özerk Reporter Saat Modelleri Uygulama

Doku veya hayvan modellerin aksine, hücre tabanlı modeller genetik ve farmakolojik tedirginliklerin mükellef bulunmaktadır ve gerektiğinde, aynı zamanda HTS biçimlerde kullanabilirsiniz. Gen fonksiyonu bozulması; aşırı ifade veya RNAi-aracılı devirme yoluyla elde edilebilir. Seçici küçük moleküller protein fonksiyona müdahale etmek için kullanılabilir. Burada kısaca dsirkadiyen çalışmalarda hücre-özerk saat modelleri bazı kullanımlarını iscuss.

Çekirdek saat mekanizmalarının 2.1 Eğitim

Hücre-özerk saat modelleri büyük ölçüde mekanik çalışmalar kolaylaştırmıştır. Hogenesch ve arkadaşları crys tarafından bu geribildirim baskının saat fonksiyonu ¹⁶ ve saat fonksiyonu ¹¹ sistem düzeyinde incelenmesini sağlayacaktır U2OS modeli için gerekli olduğunu göstermek için 3T3 modeli kullanılmıştır. Rev-erbα ve β gereksiz rolleri olduğunu göstermek için fibroblast modeli - cry2-/ - O gecikmeli dönüt baskının saat fonksiyonu ¹³ için gerekli olduğunu göstermek için fare türetilen fibroblast modeli ve BMAL1-/: - Biz Cry1-/ istihdam RRE-aracılı gen ekspresyonunu düzenleyen ritmik, ve bu BMAL1 ritim kritik çekirdek saat fonksiyonu ⁹ için gerekli değildir. Ayrıca, raportör hücre kimyasal tarama tanımlama ve / veya GS fonksiyonlarının açıklanmasını izin verilirK-3 β (dönemin kısalma zaman tedirgin) ¹⁹ CK1σ ve ε (perturbed zaman sürelerinin uzatılması) ⁴⁹ ve CK1α ^12. Aşağıda tartışıldığı gibi, bu modeller ek bir saat bileşenlerinin belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Stratejik, bu hücresel modeller daha sonra in vivo doğrulama ve keşif için yeni giriş noktaları sağlayan temel mekanizmaları, hızlı keşif için daha uysal vardır.

2.2 saat faktörlerin tanımlanması

Çekirdek geri besleme döngüsü ek olarak, saat mekanizma da farklı sinyalleme ve düzenleyici faktör entegre. Ek saati bileşenleri ve düzenleyici belirlenmesi için, hücre-özerk saat modelleri doğasında öldürücü, pleiotropik etkileri ve mutant hayvan modellerinde ⁵⁰ ile ilişkili gelişimsel genetik tazminat nedeniyle farelerde genetik tarama üzerinde avantajlıdır. Fonksiyonel genomik beğenme ile kombinasyon halinde Hücre bazlı ekranlar,ağrıları, etkili roman saat faktörlerin ^10,28 tanımlanması için ekran genom siRNA ve shRNA kütüphanelere high-throughput kayıt sistemleri kullanılarak yapılmıştır. Benzer şekilde, bir saat fonksiyonu ^12,19,34,49 üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla çeşitli küçük moleküller için kimyasal biyolojik yaklaşımları ve ekran istihdam edebilirsiniz. Büyük saat genler ve fonksiyonları tanımlanmış olsa da, bu ekranlarda saatin düzenlenmesi veya modülasyon katılan ek bileşenler veya modifiye belirledik. Bu değiştiricileri birçoğu senkron veya asenkron istekalar (clock girişi) arasında sinyal iletimi entegre belirli yöntemleri temsil eder.

Saat çıkışlarının 2.3 Eğitim

In vivo neredeyse tüm hücreleri sirkadiyen saatler olmasına rağmen, in vitro hücre kültürlerinde ille aşikar sirkadiyen ritim görüntülenmez. Bu bağlamda, muhabir yaklaşım olmadığını test etmek için yararlı bir araç sağlarsaat mekanizması belirli bir hücre tipi bulunmaktadır. Hücre-bağımsız saat mekanizmalar varlığı mikrodizi veya RNA sıralaması ^51,52, transkripsiyonel düzenleyici ağlar, proteom ve metabolome tarafından transcriptome da dahil olmak üzere, bu hücrelerde hem de dokularda in vivo saat çıkışları, çalışmalar garanti eder. Bu çalışmalar genom RNA ve protein ekspresyonu modellerini incelemek ve böylece zorunlu endojen ifade yansıtmaz hücre tabanlı lüminesans muhabiri testleri tamamlayıcı olacaktır.

3. Hücre-özerk Saat Modellerinin Önemi

SCN içinde ve farklı hücre ve doku türleri arasında sirkadiyen fonksiyonu Koordinasyon normal fizyoloji ³⁰ kritik bir yönüdür. HSN merkezi ve periferik saatler genel sirkadiyen organizasyonun tüm temel parçaları vardır. SCN doğrudan aydınlık / karanlık döngüsüne sürüklemek için retina ışık girdi alır ve bir koordinatör olarak hizmet vermektedirnöronal ve hormonal hem bağlantıları aracılığıyla periferik saatlerini eşitlemek. Dahili senkronizasyonu ek olarak, periferik dokularda ve hücre içinde moleküler clockwork da sonuçta fizyoloji ve davranışlarında belirgin sirkadiyen ritimleri yöneten transkripsiyonel çıkış ağlar, sayısız orkestra.

Bu nedenle, lokal ve sistemik hem de görüntü sinyallerini sirkadyen fizyoloji düzenler ve dolaylı olarak SCN kaynaklanan sistemik sinyal ile düzenlenir, bu vs hücre-bağımsız saatler tarafından direkt olarak düzenlenmiş sirkadyen genlerin ortaya çıkarmak için bir ihtiyaç vardır. Periferik saatlerin rolü sistemik etkiler defedildiği, hücre-özerk saat modelleri okudu olabilir. Karaciğer durumunda, dokuya özel düzenleyici ağlar lokal fizyoloji ^51,53 ritim oluşturur. In vitro ve in vivo sirkadiyen ritimler karşılaştırarak, hücre-özerk ve sistemik cue güdümlü saat fonksiyonları arasında ayrım mümkün olacak. Gerçekten de, recent çalışmalar hepatik gen ekspresyonu ^6,51,52 karaciğer saat için önemli bir rol ortaya başlamışlardır. Farklı fizyolojik çıkışları temsil eden çeşitli doku ve hücre tipine özgü saat modelleri alanında garanti gelişmesinde Gelecek araştırmalar.

Saat mekanizmasının biyokimyası ve hücre biyolojisi Önceki çalışmalarda büyük ölçüde hücre ve doku özellikle 3T3 tipi içeren, U2OS, fare fibroblast ve karaciğer sınırlı sayıda yararlanmıştır. Çoğu sirkadiyen çalışmalarda bir örtük varsayımı saati genellikle ⁷ tüm hücrelerde evrensel olarak geçerli kabul edilir bir hücre veya doku tipi belirlenen tüm hücre ve doku tipleri, ve gen fonksiyon aynı şekilde çalışır olmasıdır. Ancak, daha fazla hücre-özerk saat modelleri oluşturulması ve karakterize tarafından, gelecekteki çalışmalar yerel sirkadiyen biyolojinin temelini doku spesifik saati özelliklerini ortaya çıkarmak için bekleniyor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	For regular cell growth
DMEM	Invitrogen	12100-046	For luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
All other chemicals	Sigma
Equipment
Tissue culture incubator			5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood			BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope			Phase contrast optional
LumiCycle	Actimetrics