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Biology

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Published: September 27, 2012
doi:
10.3791/4234
, , , ,
1Department of Biological Sciences,The University of Memphis

Summary

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Abstract

Nos mamíferos, muitos aspectos do comportamento e fisiologia, tais como ciclos de sono-vigília e metabolismo do fígado são regulados pela endógenos relógios circadianos (revisado 1,2). O sistema de cronometragem circadiano é uma rede multi-oscilador hierárquica, com o relógio central, localizado no núcleo supraquiasmático (SCN) a sincronização e coordenação de relógios SCN-extra e periférico em outro lugar 1,2. As células individuais são as unidades funcionais para a geração e manutenção de ritmos circadianos 3,4, e estes osciladores de diferentes tipos de tecidos de um organismo a percentagem notavelmente semelhante mecanismo de feedback negativo bioquímico. No entanto, devido a interacções a nível de rede neuronal no SCN e através rítmicos, pistas sistémicos ao nível dos organismos, os ritmos circadianos no nível organismal não são necessariamente células autónoma 5-7. Em comparação com estudos tradicionais de actividade locomotora in vivo e ex vivo explantes SCN, cell com base em ensaios in vitro permitir a descoberta de células autônomas defeitos circadianos 5,8. Estrategicamente, baseados em células modelos são mais tratáveis ​​experimentalmente para a caracterização fenotípica e rápida descoberta de mecanismos de clock básico 5,8-13.

Porque os ritmos circadianos são dinâmicos, medições longitudinais com alta resolução temporal são necessários para avaliar a função do relógio. Em anos recentes, a gravação em tempo real usando a bioluminescência de luciferase do pirilampo, como repórter tornou-se uma técnica comum para o estudo de ritmos circadianos em mamíferos 14,15, uma vez que permite o exame da persistência e da dinâmica de ritmos moleculares. Para monitorar a célula-autónomos ritmos circadianos de expressão do gene, os repórteres de luciferase pode ser introduzido em células através de transfecção transiente 13,16,17 ou transdução estável 5,10,18,19. Aqui descrevemos um protocolo de transdução estável usando lentivírus mediada entrega de genes. Tele sistema vector lentiviral é superior aos métodos tradicionais, tais como a transfecção transiente e transmissão germinal devido à sua eficácia e versatilidade: ela permite a entrega eficiente e a integração estável no genoma do hospedeiro de ambos dividindo e não as células em divisão 20. Uma vez que uma linha celular repórter é estabelecida, a dinâmica da função de relógio pode ser examinado através da gravação de bioluminescência. Nós primeiro descrever a geração de P (Per2)-D linhas repórter Luc, e em seguida, apresentam dados deste e de outros repórteres circadianos. Nestes ensaios, os fibroblastos 3T3 de rato e células de osteosarcoma humano U2OS são utilizados como modelos celulares. Também discutimos várias formas de utilizar esses modelos de relógio em estudos circadianos. Métodos descritos aqui podem ser aplicados a uma grande variedade de tipos de células para o estudo da base molecular e celular do relógio circadiano, e pode ser útil na resolução de problemas em outros sistemas biológicos.

Protocol

1. Construção de Lentiviral Repórteres luciferase A construção repórter de mamífero circadiano geralmente contém uma cassete de expressão no qual um promotor circadiano é fundido com o gene da luciferase. Ambas as estratégias de ligação e de recombinação baseada são comumente usados ​​para a clonagem de DNA. Como um exemplo, aqui descrevemos um método baseado em recombinação clonagem Gateway para gerar um P (Per2)-d repórter Luc lentiviral, em…

Discussion

1. Modificações protocolo atual

1.1 dispositivos de gravação e considerações de rendimento

Devido à sua disponibilidade comercial, a LumiCycle (Actimetrics) tornou-se o dispositivo de luminimetro mais comumente utilizado automatizado para gravação em tempo real 4,5,9,19,29-31. O LumiCycle emprega tubos fotomultiplicadores (PMT), como detectores de luz, que proporcionam sensibilidade extremamente elevada e baixo ruído 14, e, por consegui…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado em parte pela National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments
DMEM HyClone SH30243FS For regular cell growth
DMEM Invitrogen 12100-046 For luminometry
FBS HyClone SH3091003  
Pen/Strep/Gln(100x) HyClone SV3008201  
B-27 Invitrogen 17504-044  
D-Luciferin Biosynth L-8220  
Poly-L-lysine Sigma P4707  
Polybrene Millipore TR-1003-G  
Forskolin Sigma F6886  
All other chemicals Sigma    
Equipment
Tissue culture incubator     5% CO2 at 37°C
Tissue culture hood     BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope     Phase contrast optional
LumiCycle Actimetrics    
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Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J. Vis. Exp. (67), e4234, doi:10.3791/4234 (2012).
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