Summary
Представленный метод предлагает способ определения функционального эффективной кардиотропной аутоантител в плазме пациентов с дилатационной кардиомиопатией, независимо от специфического антигена, анализируя влияние изолированного иммуноглобулина пациента на клеточном сокращения и внутриклеточного кальция в переходных изолированные кардиомиоцитов крысы.
Abstract
Дилатационная кардиомиопатия (DCM) является одной из основных причин сердечной недостаточности у молодых взрослых 1. Хотя генетическая предрасположенность и экспозиции воздействию токсичных веществ известны причины этого заболевания примерно у одной трети пациентов, происхождение DCM остается во многом неясной. В Значительное число этих больных аутоантител против сердечных эпитопы были обнаружены и, как предполагается, играют ключевую роль в возникновении и прогрессировании заболевания 2,3. Важность сердечного аутоантител подчеркивается улучшение гемодинамики наблюдается в DCM пациентам после удаления аутоантител к иммуноадсорбции 3-5. Различные специфические антигены уже определены 2,3 и антитела против этих целей могут быть обнаружены с помощью иммуноанализа. Тем не менее, эти методы не могут различать стимулирование (и, следовательно, функционально эффективными) и блокирование аутоантител. Там растет Доказательство томсе, что это различие имеет решающее значение 6,7. Можно также предположить, что цели для ряда кардиотропной антитела еще неизвестные и поэтому не могут быть обнаружены с помощью иммуноанализа. Таким образом, мы создали метод для выявления функционально активных кардиотропной антител, независимо от их соответствующим антигеном. Фон для метода является высокая гомология обычно наблюдаются функциональные области сердечной белков между млекопитающими 8,9. Это означает, что сердечные антител, направленных против антигенов человека будет перекрестно реагируют с не-человека клетки-мишени, которая позволяет тестирование IgG у пациентов DCM на взрослых кардиомиоцитов крысы. Наш метод состоит из 3 шагов: во-первых, IgG изолирован от пациента плазмы с помощью сефарозы связанных анти-IgG антител, полученных из столбцов иммуноадсорбции (PlasmaSelect, Teterow, Германия). Во-вторых, взрослые кардиомиоциты выделяют коллагеназы перфузии в аппарат Лангендорфа перфузии Использование AProtocol изменения от предыдущих работах 10,11. Полученные кардиомиоциты, которые прикреплены к ламинин покрытием камерных coverglasses и окрашивали Фура-2, кальций-селективный флуоресцентный краситель, который может быть легко приведена в клетке для наблюдения внутриклеточного кальция (Ca 2 +) содержание 12. В последнем шаге, эффект от пациента IgG на сокращение клеток и Ca 2 + переходных полей стимулировали кардиомиоцитов контролируется в Интернете с помощью коммерческих миоцитов кальцием и сократительной системы мониторинга (IonOptix, Милтон, Массачусетс, США), подключенный к стандартному обратный флуоресцентный микроскопом.
Protocol
1. IgG Изоляция от образцов пациентов
- Подготовить мини-иммуноадсорбции столбцов, заполняя 3 мл анти-IgG сефарозе в 2 мл ЭДТА плазма пациента в пустую колонку Econo Pac. IgG изоляции требуется по меньшей мере 2 мл плазмы пациента.
- Поместите фильтр в верхней части анти-IgG сефарозе, разрезать нижний кончик колонке и нажмите фильтра для достижения скорости потока примерно 1 капля / сек. Пусть сохранение решение бежать из колонны.
- Промойте колонку с 3-х томах 0,9% NaCl в объеме плазмы.
- Внесите плазмы на колонку. Когда плазма полностью погружен в анти-IgG сефарозе, мыть при том же объеме 0,9% NaCl.
- Внесите один плазменный объем 0,2 М глицин HCl, рН 2,8 на колонке, и пусть погрузиться в сефарозе. Добавить другой объем глицин HCl на колонку. Сбор потока через в 15 мл трубки и регулирования рН до 7,3 с 0,5 М Трис-HCl, рН 8,0.
- Для регенерации колонки, Промывают 3 плазменных объемов глицин HCl. После окончательной промывки 2-х томах 0,9% NaCl, колонка может быть использована для следующих образцов плазмы. Кроме того, колонка может быть заполнена с сохранением решение и хранить при температуре 4 - 8 ° C в течение 4 недель.
- Для использования на кардиомиоциты, доля собранных IgG должен быть диализу против экспериментальных буфера (EB). Для подготовки EB, добавить 117 мм NaCl, KCl 2,8 мм, 0,6 мм MgCl 2, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 1,2 мМ CaCl 2, 10 HEPES мм и 20 мм глюкозы в 1 л дистиллированной воды на магнитной мешалкой и регулирования рН до 7,3.
- Заполните фракции IgG к диализу целлюлозы трубку мембраны эфир с молекулярной массой отрезаны от 100 кДа. Положите трубку в 1 л EB и помешивать с магнитной мешалкой при температуре 4 ° C. После 8 часов, передает диализа трубки в 3 л свежего EB и диализ в течение еще 20 ч при 4 ° C.
- После диализа, тепло образца в течение 30 мин при 57 ° C на водяной бане до inactivatмножители е дополнение. Определение общей концентрации IgG и подготовить аликвоты, содержащий 330 мкг IgG каждого. При добавлении образца в кардиомиоциты для измерения (шаг 4,3), заполнить аликвоты по 1 мл EB. Неразбавленный аликвоты могут храниться при температуре от -20 ° C до дальнейшего использования.
2. Выделение кардиомиоцитах крысы
- Для подготовки Ca 2 +-бесплатное выделение буфера (IB), добавить 110 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 20 HEPES мм и 11 мм глюкозы в 1 л дистиллированной воды с помощью магнитного мешалкой. Отрегулируйте рН до 7,4 при комнатной температуре и процеживают через 0,2 мкм бутылку топ фильтр для стерилизации.
- Заполнить 80 мл IB в верхнем резервуаре термостатировали системы перфузии Лангендорфа. Отрегулируйте настройки термостата для поддержания буферной температуре 37 ° C и проветрить буфер с 95% O 2/5% CO 2 в течение 30 мин.
- Взвешивание приблизительно 10.000 - 12.000 U из collagenase типа II, 175 мг жирных кислот BSA и растворить в 20 мл IB содержащий 22,5 мкл 100 мМ CaCl 2 раствора. Контроль рН выделения буфера в верхний резервуар и корректировать при необходимости.
- Анестезировать крыс Вистар в 175 - 200 г с 375 мкг / кг тиопентала массы тела. Добавить 2500 МЕ гепарина в тиопентала решение. После торакотомии, акцизы сердце тщательно с неповрежденным дуги аорты и передать его в ледяную 0,9% NaCl. Очистить сердце от крови и окружающих тканей и передачи на свежий 0,9% NaCl. Предоставление доступа к аорте, открыть поток редуктора системы Лангендорфа чтобы получить падение скорости 2-3/sec и приложить сердце к канюлю.
- Заливать сердца на срок до 3 мин при скорости потока 1 капля / сек, чтобы смыть оставшиеся крови. Начало распространить IB в системе Лангендорфа. Удалить 20 мл буфера из верхнего резервуара, заполните решение коллагеназы и пополнить столько буфер, необходимых для достижения 80 мл. Распространить с ollagenase решение еще 27 мин. Скорость потока должна контролироваться периодически и поддерживается на 1 капля / сек помощью потока редуктора.
- Снимите сердце от канюли, очистить от предсердия и аорты и нарезать на мелкие кусочки. Разрешить коллагеназы решение бежать в нижний резервуар, уменьшите громкость до максимума 40 мл и далее переваривать нарезанный желудочков в течение 10 - 15 мин при непрерывной аэрации с 95% O 2/5% CO 2. После фильтрации суспензии клеток через 200 мкм, размер ячеи марлю в 50 мл трубки.
- Восстановление Ca 2 + содержание клеток в 3 этапа: центрифуги суспензию клеток на 43 мкг в течение 2 мин при комнатной температуре и ресуспендирования клеток в 10 мл IB, содержащей 200 мкМ CaCl 2. Центрифуга снова и ресуспендирования клеток в 10 мл IB с 500 мкМ CaCl 2. После окончательного центрифугирования ресуспендируют кардиомиоцитов в стерильной фильтрации EB (см. п. 1.8) до плотности 50000 клеток / мл.
- Пальто 4 хорошо патрон покровного стекла с 10 мкг ламинина на лунку и подождите, пока он полностью высушен.
- Заполнить 1 мл кардиомиоцитов подвески в каждую лунку помощью микропипетки с разрезом чаевых. Разрешить клетки придерживаться в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Развести 10 мкл 1 мг / мл Фура-2 утра раствор в 5 EB мл. Держите окрашивание раствора в темноте.
- Снимите буфер и одинокие клетки покровного стекла и пипеткой 0,5 мл окрашивание раствора в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при умеренном встряхивании. Затем снять окрашивание раствора, промыть клетки один раз с 1 мл EB и, наконец, залить 0,5 мл EB в каждую лунку. Избегайте прямых солнечных лучей во время окрашивания процесса и всегда держать окрашенных клеток в темноте.
4. Запись сокращения клеток и Ca 2 + переходных
- Поместите покровного стекла камерные на обратную м флуоресценцииicroscope подключен к миоцитов кальция и сократимость записи. Разместите заказ электрод с притоком и отток трубки в первой скважины. Переливать кардиомиоцитов с 1 мл / мин EB и начать электрической стимуляции (20 В, 1 Гц, 5 мсек). Дайте клеткам адаптироваться к стимуляции в течение примерно 2 мин.
- Выберите нетронутым стержень формы кардиомиоцитов с четким страты и постоянное сокращение. Поместите ячейку в центре поля зрения и открыть канал камеры. Ориентируйтесь ячейки по горизонтали в области видео, вращая адаптер ячейки каркаса и перемещения микроскопа.
- Отрегулируйте края обнаружения элементов управления области видео (рис. 2), откройте флуоресцентного канала и запись 10 - 15 сокращений для получения начального сокращения клеток и Ca 2 + преходяще.
- Закрыть канал световой микроскоп, чтобы избежать обесцвечивания флуоресценции пятна. Переключение потока через от EB к образцуобход с 3-ходовой клапан и переливать кардиомиоцитов с 1 мл пациента IgG. Остановите насос перед воздуха достигает хорошо.
- Откройте световой канал и одновременно записывать другую 10 - 15 сокращений, чтобы получить острую реакцию клетки. Для приостановки записи и закрыть световой канал снова. Повторить записи через 2 и 5 мин.
- Выньте электрод хорошо. Очистка труб тщательно EB и переходите к следующему также из покровного стекла камерные.
- Анализ сокращение клеток и Ca 2 + переходные с IonWizard программного обеспечения с использованием "Edge-Length/Length» и «фура 2-числовых вычитается / Ratio" окна, соответственно. Вычислить процентное изменение от начального сокращения клеток и Ca 2 + переходных высоты пика называется базовой (бл% пик ч) для острого, 2 мин и 5 мин ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Два примера для измерения сотовой инотропный эффект в области стимулировали взрослых кардиомиоцитов (рис. 2) с помощью миоцитов Са 2 + и сократительной системы записи приведены ниже. Рисунок 3 дает представление о контрольных измерений, а на рисунке 4 эффектом кардиодепрессивное антител пациента с DCM показан.
В обоих примерах, начальная сокращение клеток и Ca 2 + переходных во время superfusion с EB демонстрируют четкое и постоянное пиков, что является необходимым условием для анализа. Мы знаем из опыта, что клетки, обладающие начальными% бл пик ч в диапазоне 7 - 14% костюма лучше всего подходит для нашего приложения, в то время как кардиомиоциты с более низкой или более высокой начальной сократимости часто склонны проявлять неспровоцированной изменения клеточного сокращения. После применения контроля IgG, то есть IgG изолированы от здоровых лиц, инотропный кардиомиоцитов и остаетсяnchanged на протяжении всего измерения (рис. 3А). В отличие от superfusion с IgG антител содержащие кардиодепрессивное сопровождается снижением клеточного сокращения (рис. 4а), сопровождается снижением Ca 2 + переходных процессов, которые, как правило, менее выражено (рис. 4В). Обычно мы замечаем, что новое устойчивое состояние устанавливается для обоих, сокращение клеток и Ca 2 + переходных процессов, через 2 мин которой сохраняется до конца измерения через 5 мин. Приведенный пример показывает очень четко отрицательный инотропный эффект при снижении клеточного сокращения на 54% и Са 2 + переходных на 31%, через 5 мин. Тем не менее, изменения часто являются менее выраженными. Таким образом, мы определили верхний и нижний предел для отрицательной и положительной инотропной как среднее ± 2SD для управления IgG здоровой контрольной группы, чтобы избежать ложных положительных результатов. Соответственно, клетки рассматриваются только как отрицательный или положительный инотропный WКурица изменения клеточного сокращения превышает этот порог, который мы определили, что примерно на ± 10%.
Рисунок 1. Схема обнаружения аутоантител путем измерения кардиомиоцитов сократимость. Во-первых, IgG извлекается из образцов пациентов с использованием анти-IgG сефарозе столбцов (выделены желтым цветом). Во-вторых, кардиомиоциты, изолированных от крыс сердца ферментативного пищеварения и окрашивают Фура-2 (выделены синим цветом). Наконец, сокращение клеток и Ca 2 + переходных мониторинг в Интернете с помощью миоцитов кальцием и сократимость Recording System (выделено зеленым).
Рисунок 2. Изолированные кардиомиоцитов крыс расположены в области видео из миоцитов системы записи сократимость. Приведенный ниже график в ячейке отображается расчетная интенсивность следов используются для обнаружения края. Стрелки указывают на край обнаружения элементов управления. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Представитель пример контрольного измерения. Сотовые сокращение (А) и Ca 2 + переходных (б) контролировалась онлайн-до (начальные), немедленно (острая), 2 мин, 5 мин после superfusion с IgG. Красные линии обозначают паузу измерения.
"Рисунок 4" FO: содержание ширина = "4.5in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
Рисунок 4. Пример измерения образцов IgG антитела, содержащие кардиодепрессивное. Сотовые сокращение (А) и Ca 2 + переходных (B) была измерена онлайн-до (начальные), немедленно (острая), 2 мин, 5 мин после superfusion с IgG. Красные линии обозначают паузу измерения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный метод предлагает подходящий способ обнаружения функционально эффективными сердечными аутоантитела у больных с DCM неясного происхождения. По сравнению с другими методами, например, выявление функциональных активные антитела против β1-адренорецепторов их влияние на уровни цАМФ 6, наш метод не зависит от конкретных эпитопов. Конечно, есть и другие эпитопа независимых анализов, описанных в литературе, т. е. считая избиении Скорость кардиомиоцитов новорожденных 13, измерения токов кальция у взрослых кардиомиоцитов патчем техника зажима или сократимость изолированного волокна Пуркинье 14. В преимуществом этих методов анализа, представленные здесь, меньше времени и обеспечивает повышение объективности в связи с стандартизированный протокол. Кроме того, он позволяет обнаруживать влияния на сократимость и внутриклеточного кальция переходных в то же время.
Подобный OTее в пробирке анализы, результаты, полученные с представленными метод может быть оспорено в искусственных условиях применяются к клеткам. Искусственный кардиомиоцитов новорожденных крыс были зарегистрированы приложить преимущественно между micropillars на расстоянии 30 мкм или меньше, чем на плоской поверхности. При подключении к последней, клетки были обнаружены просмотров волокон актиновых стресс и неупорядоченные миофибрилл 15. Тем не менее, потенциальное воздействие стресса волокон в сократимость анализа, описанного здесь может быть незначительным, так как взрослые кардиомиоциты только культивировали в течение очень короткого периода времени до 6 часов, которое может уменьшить образование такого волокна и клетки укорочение и Ca 2 + переходных относятся к начальным сократимость соответствующей ячейке, чтобы минимизировать влияние индивидуальных различий между клетками. Еще одним ограничением является высокий спрос на подопытных животных и времени. Поэтому метод не подходит для высокопроизводительного скрининга из патиродители.
Дальнейшая реализация мыслимы для метода. В связи с антигеном независимости она может быть применена к другим идиопатической сердечно-сосудистых заболеваний, где аутоиммунного воздействия предполагается.
Кроме того, сократимость измерений может быть легко настроен для изучения функционального воздействия других веществ. Это позволяет анализировать потенциальное влияние препаратов на сердце, что может быть полезно, например, в разработке лекарственных препаратов и тестирование. Помимо основных параметров, предусмотренных по изменениям сокращение клеток и Ca 2 + от исходного уровня, дополнительная информация может быть получена из измерений, которая позволяет более подробное определение наблюдаемого эффекта. Например, вылета и возвращения скорости может быть рассчитана из клетки сокращение событий, которые могут указывать на конкретные систолического и диастолического эффекта препарата или антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Федерального министерства экономики и технологий проект ЗИМ-KF 2727801MD0 и Центра инновационных компетенций - гуморальный иммунный ответ сердечно-сосудистых заболеваний ( ZIK-поход, BMBF ФКЗ 03Z2CN12) Федерального министерства образования и научных исследований Германии. Жилищного строительства и экспериментах на животных были проведены в соответствии с рекомендациями Общество лабораторных животных науки (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-СОЛАС) и Федерации европейских лабораторных животных Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
