Summary
प्रस्तुत विधि फैली हुई cardiomyopathy के साथ रोगियों के प्लाज्मा में कार्यात्मक प्रभावी cardiotropic autoantibodies का पता लगाने के लिए, चाहे विशिष्ट प्रतिजन के सेलुलर और पृथक चूहे cardiomyocytes में छोटा करने intracellular कैल्शियम यात्रियों पर अलग रोगी immunoglobulin के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है.
Protocol
1. रोगी के नमूने से आईजीजी अलगाव
- 2 मिलीलीटर रोगी EDTA प्लाज्मा प्रति एक खाली Econo पीएसी स्तंभ में 3 मिलीग्राम विरोधी आईजीजी sepharose भरने से मिनी immunoadsorption कॉलम तैयार. आईजीजी अलगाव रोगी प्लाज्मा के कम से कम 2 मिलीलीटर की आवश्यकता है.
- विरोधी आईजीजी sepharose के शीर्ष पर एक फिल्टर रखें, स्तंभ के निचले टिप खोलने में कटौती और ड्रॉप लगभग 1 / सेकंड की एक प्रवाह दर तक पहुंचने के लिए फिल्टर प्रेस करने के लिए. संरक्षण स्तंभ से बाहर चलाने के समाधान करते हैं.
- धोने के 3 0.9% प्लाज्मा की मात्रा के प्रति NaCl संस्करणों के साथ स्तंभ.
- स्तंभ पर प्लाज्मा विंदुक. जब प्लाज्मा विरोधी आईजीजी sepharose में पूरी तरह डूब गया है, एक ही मात्रा 0.9% NaCl के साथ धो लो.
- पिपेट 0.2 एम ग्लाइसिन एचसीएल, पीएच 2.8 के स्तंभ पर एक प्लाज्मा मात्रा और में विसर्जित करते sepharose. स्तंभ पर ग्लाइसिन एचसीएल के एक और मात्रा जोड़ें. प्रवाह के माध्यम से एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ले लीजिए और ७.३ 0.5 एम Tris एचसीएल, 8.0 पीएच के साथ पीएच समायोजित.
- स्तंभ को पुनर्जीवित, 3 संस्करणों प्लाज्मा ग्लाइसिन एचसीएल साथ धो लो. 0.9% NaCl 2 संस्करणों के साथ एक अंतिम धोने के बाद स्तंभ अगले प्लाज्मा नमूना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, स्तंभ संरक्षण समाधान के साथ भरा जा सकता है और 4 में संग्रहीत - 8 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 सप्ताह के लिए.
- Cardiomyocytes पर उपयोग के लिए है, एकत्र आईजीजी अंश प्रयोगात्मक बफर (EB) के खिलाफ dialyzed जा है. EB की तैयारी के लिए, 117 मिमी NaCl, 2.8 मिमी KCl, 0.6 मिमी 2 MgCl, 1.2 मिमी KH 2 4 पीओ, 1.2 मिमी CACL 2, 10 मिमी HEPES और एक चुंबकीय उत्तेजक पर 20 मिमी ग्लूकोज 1 एल आसुत जल को जोड़ने और पीएच समायोजित 7.3.
- एक सेलूलोज़ एस्टर डायलिसिस झिल्ली ट्यूब एक आणविक वजन 100 केडीए की काट के के साथ आईजीजी अंश भरें. 1 एल EB ट्यूब में रखो और 4 में एक चुंबकीय दोषी के साथ धीरे धीरे हलचल ° सी. 8 घंटे के बाद, ताजा EB के 3 एल में डायलिसिस ट्यूब को हस्तांतरण और 4 पर एक और 20 घंटे के लिए dialyze डिग्री सेल्सियस
- डायलिसिस गर्मी, पानी के स्नान inactivat में नमूना के बाद 57 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिएई पूरक कारकों. कुल आईजीजी एकाग्रता का निर्धारण और 330 ग्राम प्रत्येक आईजीजी युक्त aliquots तैयार. जब माप (4.3 कदम) के लिए cardiomyocytes नमूना जोड़ने, EB के साथ 1 मिलीलीटर aliquots भरने के लिए. Undiluted aliquots आगे उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है.
2. चूहा cardiomyocytes का अलगाव
- 2 + मुक्त अलगाव बफर CA (आईबी) की तैयारी के लिए, 110 मिमी NaCl, 2.6 मिमी KCl, 1.2 मिमी MgSO 4, 1.2 मिमी KH 2 4 पीओ, 20 मिमी HEPES और 11 मिमी 1 एल आसुत पानी का उपयोग कर एक चुंबकीय ग्लूकोज जोड़ने दोषी. 7.4 पीएच 0.2 बंध्याकरण के लिए सुक्ष्ममापी बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से कमरे के तापमान और फिल्टर में समायोजित करें.
- एक thermostated Langendorff छिड़काव प्रणाली के ऊपरी जलाशय में आईबी के 80 मिलीलीटर भरें. थर्मोस्टेट सेटिंग्स समायोजित करने के लिए एक बफर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के बनाए रखने के लिए और 95% 2 हे / 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ बफर aerate.
- लगभग 10,000 वजन - collag की 12,000 यूenase प्रकार द्वितीय, 175 मिलीग्राम फैटी एसिड मुक्त BSA और 20 मिलीलीटर 100 मिमी CACL 2 स्टॉक समाधान के 22.5 μl युक्त आईबी में भंग. ऊपरी जलाशय में अलगाव बफर के पीएच नियंत्रण और समायोजित यदि आवश्यक हो.
- 375 शरीर / छ किलो वजन thiopental के साथ 200 ग्राम 175 की एक Wistar चूहे संज्ञाहीन करना. Thiopental समाधान के लिए 2500 आइयू हेपरिन जोड़ें. Thoracotomy, एक अक्षुण्ण महाधमनी चाप के साथ आबकारी ध्यान दिल के बाद और यह ठंडा 0.9% NaCl में स्थानांतरित कर सकते हैं. साफ खून से दिल और आसपास के ऊतकों और ताजा 0.9% NaCl हस्तांतरण. महाधमनी पर्दाफाश, प्रवाह Langendorff प्रणाली के reducer खोलने के लिए 2-3/sec की एक छोड़ने गति प्राप्त और प्रवेशनी के लिए दिल देते हैं.
- 1 बूंद / सेक शेष रक्त धोने के एक प्रवाह की दर के साथ 3 मिनट तक दिल छिड़कना. Langendorff प्रणाली में आईबी प्रसारित करने के लिए शुरू करो. ऊपरी जलाशय से 20 मिलीलीटर बफर निकालें, कोलैजिनेज और ज्यादा के रूप में 80 मिलीलीटर तक पहुँचने के लिए आवश्यक बफर के समाधान के रूप में फिर से भरना में भरने के लिए. ग प्रसारित एक और 27 मिनट के लिए ollagenase समाधान. प्रवाह दर समय - समय पर नियंत्रित किया जाना चाहिए और 1 बूंद / सेक प्रवाह reducer का उपयोग पर बनाए रखा.
- प्रवेशनी से दिल, atria और महाधमनी से साफ अलग है और छोटे - छोटे टुकड़ों में काट. कोलैजिनेज समाधान कम जलाशय में चलाने की अनुमति दें, 40 मिलीलीटर की एक अधिकतम मात्रा को कम करने और आगे 10 के लिए कटा हुआ ventricles को पचाने में 95 हे% 2/5% सीओ 2 के साथ निरंतर वातन के तहत 15 मिनट. बाद में, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 200 सुक्ष्ममापी जाल आकार धुंध के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर.
- 10 मिलीलीटर 200 सुक्ष्ममापी 2 CACL युक्त आईबी में 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान और resuspend कोशिकाओं में 43 XG सेल निलंबन अपकेंद्रित्र: Ca 2 + 3 चरणों में कोशिकाओं की सामग्री को पुनर्स्थापित. फिर अपकेंद्रित्र और 10 मिलीलीटर आईबी में 500 सुक्ष्ममापी CACL 2 के साथ कोशिकाओं resuspend. के बाद एक अंतिम centrifugation 50,000 कोशिकाओं / मिलीलीटर की एक घनत्व बाँझ फ़िल्टर्ड EB में cardiomyocytes (1.8 देखें) resuspend.
- कोट 4 10 ग्राम प्रति laminin और इंतजार जब तक यह पूरी तरह से सूख जाता है के साथ अच्छी तरह से संभाग coverglass.
- हर अच्छी तरह से एक कट टिप के साथ एक micropipette का उपयोग कर में cardiomyocyte निलंबन की 1 मिलीग्राम भरें. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पालन करने की अनुमति दें.
- 1 मिलीग्राम / एमएल की 10 μl Fura 2 5 मिलीलीटर EB में स्टॉक समाधान. पतला अंधेरे में धुंधला हो समाधान रखें.
- Coverglass और विंदुक प्रत्येक कुएं में धुंधला हो समाधान के 0.5 मिलीग्राम से बफर और स्वाधीन कोशिकाओं से ले लो. मध्यम झटकों के तहत 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. बाद में, धुंधला हो जाना समाधान ले, कोशिकाओं 1 मिलीलीटर EB के साथ एक बार धो और अंत में प्रत्येक कुएं में 0.5 मिलीलीटर EB भरें. धुंधला प्रक्रिया के दौरान प्रत्यक्ष प्रकाश से बचें और हमेशा अंधेरे में दाग कोशिकाओं रखने.
4. सेल छोटा और 2 Ca यात्रियों + की रिकॉर्डिंग
- संभाग एक उलटा प्रतिदीप्ति मीटर पर coverglass रखेंicroscope एक myocyte कैल्शियम और सिकुड़ना रिकॉर्डिंग प्रणाली से जुड़ा है. एक और अच्छी तरह से 1 तपका ट्यूब में बाढ़ के साथ एक कस्टम बनाया इलेक्ट्रोड स्थिति. 1 / एमएल मिनट EB और बिजली की उत्तेजना शुरू (20 वी, 1 हर्ट्ज, 5 मिसे अवधि) के साथ Superfuse cardiomyocytes. कोशिकाओं के बारे में 2 मिनट के लिए उत्तेजना के लिए अनुकूलित करने के लिए अनुमति दें.
- स्पष्ट striation और निरंतर संकुचन के साथ एक अक्षुण्ण छड़ के आकार cardiomyocyte चुनें. स्थिति दृश्य क्षेत्र के केंद्र में सेल और कैमरा चैनल खुला. सेल क्षैतिज सेल फ्रेमन एडाप्टर घूर्णन और खुर्दबीन मंच हिल वीडियो क्षेत्र के भीतर मालूम.
- बढ़त वीडियो क्षेत्र के नियंत्रण तत्वों (2 चित्रा) का पता लगाने को समायोजित करने के लिए, फ्लोरोसेंट चैनल और 10 रिकॉर्ड खुला 15 संकुचन प्रारंभिक सेल छोटा और Ca 2 + क्षणिक प्राप्त.
- प्रकाश माइक्रोस्कोप चैनल की विरंजन प्रतिदीप्ति दाग से बचने के. EB के माध्यम से नमूना प्रवाह स्विचएक तीन तरह वाल्व और रोगी आईजीजी के 1 मिलीग्राम के साथ superfuse cardiomyocytes साथ बाईपास. बंद करो पंप से पहले अच्छी तरह से हवा तक पहुँचता है.
- प्रकाश चैनल खोलें और एक और रिकॉर्ड 10 - 15 संकुचन को तीव्र सेल प्रतिक्रिया प्राप्त. रिकॉर्डिंग रोकें और प्रकाश चैनल फिर बंद. 2 और 5 मिनट के बाद रिकॉर्डिंग दोहराएँ.
- अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड रखना. ट्यूब EB के साथ अच्छी तरह से और साफ संभाग coverglass के अगले अच्छी तरह से जारी है.
- विश्लेषण सेल छोटा और 2 Ca + IonWizard "Edge-Length/Length" का उपयोग कर सॉफ्टवेयर के साथ क्षणिक और fura 2 संख्यात्मक / अनुपात subtracted "खिड़की, क्रमशः. प्रारंभिक सेल को छोटा और Ca 2 + शिखर तीव्र के लिए आधारभूत (बीएल% शिखर घंटे) के लिए भेजा ऊंचाई के क्षणिक, 2 मिनट और 5 मिनट प्रतिक्रिया से प्रतिशत परिवर्तन की गणना.
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Representative Results
में क्षेत्र में सेलुलर inotropy की माप के लिए दो उदाहरण वयस्क (2 चित्रा) cardiomyocytes myocyte Ca 2 + और सिकुड़ना रिकॉर्डिंग प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं नीचे दिए गए उत्तेजित चित्रा 3 एक नियंत्रण माप की एक छाप देता है. चित्रा 4 में जबकि cardiodepressive एंटीबॉडी का प्रभाव डीसीएम के साथ एक रोगी के दिखाया गया है.
दोनों उदाहरणों, प्रारंभिक सेल छोटा और Ca 2 + EB के साथ superfusion दौरान क्षणिक प्रदर्शन स्पष्ट और निरंतर चोटियों, जो विश्लेषण के लिए एक शर्त है. हम अपने अनुभव से जानते हैं कि कोशिकाओं 7 की रेंज में एक प्रारंभिक बीएल% चोटी घंटे प्रदर्शन - 14% हमारे आवेदन के लिए सबसे अच्छा सूट, जबकि कम या अधिक प्रारंभिक सिकुड़ना साथ cardiomyocytes अक्सर सेल छोटा करने की अकारण परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं. नियंत्रण आईजीजी के आवेदन करने के बाद, यानी आईजीजी स्वस्थ नियंत्रण विषयों से अलग, cardiomyocytes की inotropy यू रहता हैपूरे माप (चित्रा 3A) भर nchanged. इसके विपरीत, आईजीजी cardiodepressive एंटीबॉडी युक्त साथ superfusion सेल छोटा करने की एक कमी (4A चित्रा), कमी Ca 2 के द्वारा साथ द्वारा पीछा किया जाता है + यात्रियों है जो आम तौर पर कम स्पष्ट है (4B चित्रा). हम आम तौर पर पालन कि एक नए स्थिर राज्य, सेल दोनों छोटा और 2 मिनट के बाद जो 5 मिनट के बाद माप के अंत तक संरक्षित है 2 Ca + यात्रियों के लिए स्थापित है. दिए गए उदाहरण में एक बहुत स्पष्ट सेल छोटा करने की एक कमी के साथ 54% और 2 सीए के 5 मिनट के बाद 31% से यात्रियों नकारात्मक inotropic प्रभाव दिखाता है. हालांकि, परिवर्तन अक्सर कम स्पष्ट हैं. इसलिए, हम मतलब के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक inotropy के लिए एक ऊपरी और निचले सीमा परिभाषित ± एक स्वस्थ नियंत्रण समूह के नियंत्रण आईजीजी के लिए 2SD झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए. तदनुसार, कोशिकाओं को केवल नकारात्मक या सकारात्मक inotropic w के रूप में माना जाता हैसेल छोटा करने की मुर्गी परिवर्तन इस ± सीमा, जो हम करने के लिए लगभग निर्धारित 10% से अधिक है.
चित्रा 1. Autoantibody का पता लगाने के cardiomyocyte सिकुड़ना को मापने के द्वारा फ्लो चार्ट. पहले, आईजीजी रोगी विरोधी आईजीजी sepharose कॉलम (पीले रंग में प्रकाश डाला) का उपयोग कर नमूने से निकाला जाता है. दूसरा, cardiomyocytes चूहे दिल से enzymatic पाचन Fura 2 (नीले रंग में हाइलाइट) के साथ दाग से अलग कर रहे हैं. अंत में, सेल छोटा और Ca 2 + यात्रियों ऑनलाइन निगरानी कर रहे हैं और एक myocyte कैल्शियम और सिकुड़ना रिकॉर्डिंग सिस्टम (हरे रंग में हाइलाइट) का उपयोग कर रहे हैं.
चित्रा 2. पृथक चूहे cardiomyocyte myocyte सिकुड़ना रिकॉर्डिंग सिस्टम के वीडियो क्षेत्र में तैनात सेल नीचे ग्राफ गणना तीव्रता बढ़त का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया निशान को प्रदर्शित करता है. तीर किनारे नियंत्रण तत्वों का पता लगाने का संकेत मिलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. एक नियंत्रण माप के प्रतिनिधि उदाहरण सेल (A) छोटा और Ca 2 + क्षणिक (बी) से पहले ऑनलाइन नजर रखी थी (प्रारंभिक), तुरंत (तीव्र), 2 मिनट और आईजीजी साथ superfusion बाद 5 मिनट. लाल लाइनों माप की रोक का संकेत मिलता है.
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चित्रा 4. एक आईजीजी युक्त नमूना cardiodepressive एंटीबॉडी का उदाहरण माप सेल (A) छोटा और 2 Ca + क्षणिक (बी) से पहले ऑनलाइन मापा गया था (प्रारंभिक), तुरंत (तीव्र), 2 है और आईजीजी के साथ superfusion के बाद 5 मिनट मिनट. लाल लाइनों माप की रोक का संकेत मिलता है.
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Discussion
प्रस्तुत विधि अस्पष्ट मूल के डीसीएम के साथ रोगियों में कार्यात्मक प्रभावी हृदय autoantibodies का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त तरीका प्रदान करता है. अन्य तरीकों की तुलना में, शिविर 6 स्तरों पर उनके प्रभाव से β1 adrenoceptor खिलाफ कार्यात्मक सक्रिय एंटीबॉडी का पता लगाने जैसे, हमारे विधि एक विशिष्ट मिलान के स्वतंत्र है. बेशक वहाँ अन्य मिलान स्वतंत्र assays साहित्य में वर्णित हैं, यानी नवजात 13 cardiomyocytes, पैच दबाना तकनीक या पृथक Purkinje 14 फाइबर की सिकुड़ना वयस्क cardiomyocytes में कैल्शियम धाराओं को मापने की धड़कन की दर की गणना. इन तरीकों के लाभ में, यहाँ प्रस्तुत परख कम समय लगता है और बढ़ मानकीकृत प्रोटोकॉल के कारण निष्पक्षता प्रदान करता है. इसके अलावा, यह सिकुड़ना और intracellular कैल्शियम यात्रियों पर एक ही समय में प्रभाव का पता लगाने की अनुमति देता है.
ओ.टी. के लिए इसी प्रकारउसे इन विट्रो assays में प्रस्तुत विधि के साथ प्राप्त परिणामों कृत्रिम कोशिकाओं को लागू शर्तों द्वारा चुनौती दी जा सकता है. संवर्धित नवजात चूहे cardiomyocytes micropillars के बीच preferentially फ्लैट substrates पर की तुलना में 30 मीटर या उससे कम की दूरी के साथ संलग्न करने के लिए सूचित किया गया. जब बाद के लिए संलग्न है, कोशिकाओं को actin तनाव फाइबर प्रदर्शित पाए गए और 15 myofibers unordered. हालांकि, सिकुड़ना परख में तनाव तंतुओं के संभावित प्रभाव यहाँ वर्णित नगण्य होने के बाद से वयस्क cardiomyocytes केवल 6 घंटा है जो जैसे फाइबर और सेल को छोटा और Ca 2 के गठन को कम कर सकते हैं कर रहे हैं अप करने के लिए एक बहुत ही कम समय अवधि के लिए सभ्य हो + क्षणिक संबंधित सेल की कोशिकाओं के बीच व्यक्तिगत मतभेदों के प्रभाव को कम करने के प्रारंभिक सिकुड़ना में जाना जाता है. एक और सीमा प्रायोगिक पशुओं और समय की उच्च मांग है. इसलिए विधि पति की उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैपिता.
इसके अलावा कार्यान्वयन विधि के लिए बोधगम्य हैं. स्वतंत्रता प्रतिजन के कारण यह अन्य अज्ञातहेतुक हृदय रोग, जहां एक autoimmune प्रभाव माना जाता है के लिए लागू किया जा सकता है.
इसके अलावा, सिकुड़ना माप को आसानी से अन्य पदार्थों के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. यह दिल है, जो लाभकारी जैसे दवा के विकास और परीक्षण में हो सकता है पर एक दवाओं के संभावित प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. बुनियादी सेल छोटा और आधारभूत से 2 Ca + के परिवर्तन द्वारा प्रदान की मापदंडों के अलावा, अधिक जानकारी के माप है जो मनाया प्रभाव का एक और अधिक विस्तृत परिभाषा परमिट से प्राप्त किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, प्रस्थान और वापसी वेग सेल को छोटा घटना है जो एक विशिष्ट सिस्टोलिक और एक दवा या एंटीबॉडी की diastolic प्रभाव का संकेत हो सकता से गणना की जा सकती है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हृदय रोगों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (- यह काम Sonderforschungsbereich 19 Transregio (SFB/TR19, C2) ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG), प्रौद्योगिकी और अर्थशास्त्र परियोजना ZIM-KF 2727801MD0 और अभिनव क्षमता के लिए केंद्र के संघीय मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया zik वृद्धि, शिक्षा और रिसर्च, जर्मनी के संघीय मंत्रालय के BMBF FKZ) 03Z2CN12. आवास और जानवरों के साथ प्रयोगों प्रयोगशाला पशु विज्ञान (Gesellschaft für Versuchstierkunde जीवी SOLAS) और यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान एसोसिएशन (FELASA) के फेडरेशन के लिए सोसायटी की सिफारिशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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