Summary
Методом визуализации для мониторинга изменений мембранного потенциала с суб-микронных пространственных и суб-миллисекунды временное разрешение описано. Методика, основанная на лазерном возбуждении напряжение чувствительных красителей, позволяет измерять сигналы в аксонов и аксонов залогов, терминал дендритных ветвей и отдельных дендритных шипиков.
Protocol
1. Настройка оборудования
Шаг 1.1. Настройка изображения
Ключ к записи напряжения чувствительных сигналов красителя соответствующей конструкции установки. Мы используем прямой микроскоп (Olympus BX51WI или Zeiss AxioExaminer) оснащен тремя камерами. Установка предназначена для освещения отдельных нейронов в срезах мозга при возбуждении светом в эпи-флуоресценции, широкое поле микроскопа режиме, используя любой Nikon 60X/1.0 НС или Zeiss 63X/1.0 НС воды погружения цели. Наши микроскопы крепятся к столу виброизоляции и оснащена моторизованной этапах подвижные. Каждый микроскоп оснащен тремя портами камеры. Один порт камеры имеет стандартную высоким пространственным разрешением ПЗС-камеры для инфракрасной DIC видео-микроскопия (IR-1000, Dage MTI, США). Второй порт камеры быстрого сбора данных камер (до 20 кГц, частота кадров) с относительно низким пространственным разрешением (80 х 80 пикселей), но выдающимся динамическим диапазоном (14 бит) и исключительно низкий читатьшум (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Атланта). Третий порт Камера имеет ПЗС-камера с высоким пространственным разрешением (PixelFly, 1392x1024 пикселей; PCO AG, Германия), установленный на вращающемся диске-конфокальный сканер (CSU-10, Yokogawa, Япония) используется для сбора Z-стеки конфокальной изображения для подробные морфологические реконструкции окрашенные клетки. С удвоением частоты с диодной накачкой Nd: YVO4 лазер непрерывного излучения (400 мВт), излучающий на длине волны 532 нм (MLL-III/400 мВт; CNI, Чанчунь, Китай) является источником возбуждения светом. 2 мм в диаметре лазерного луча закрытом заслонкой (LS6; Vincent Associates) направлена на световод, соединенный с микроскопом через один порт эпифлуоресцентной конденсатора (ДО Photonics GmbH, Gräfelfing, Германия) предназначен для переполнять назад апертурой Цель и обеспечить практически равномерное освещение плоскости объекта. Лазерное излучение используется вместо обычной ксеноновой дуговой лампы, чтобы максимизировать чувствительность V м-изображений путем: (1) использование монохроматического бывшихЦитата свет в красном крыле спектра поглощения максимально V м чувствительность красителя 9, 10 и (2) увеличение интенсивности возбуждающего света за уровень, что может быть достигнуто путем дуговой лампы. Возбуждающего света нашло отражение в подготовке дихроичного зеркала с центральной длиной волны 560 нм и записанные света флуоресценции пропускают через 610 нм барьер фильтр (Schott RG610). Совокупный эффект от увеличения интенсивности света и использования вблизи оптимальных длин волн монохроматического возбуждения было резкое улучшение в чувствительности напряжения изображений с коэффициентом около 50 по сравнению с предыдущими измерениями 6.
Шаг 1.2. Настройте для равномерного освещения
Использование флуоресценции стандартный слайд (зеленый возбуждения / красного излучения). Вставьте соответствующие фильтры нейтральной плотности на пути лазерного луча, так что ПЗС не насыщен. Фокус целью на поверхностьслайда. Отрегулируйте положение приемном конце кварцевого световода перед целью запуска лазера, и отрегулируйте положение выходного конца света руководство прилагается к микроскопу с помощью соответствующих приводов на флуоресценции конденсатора для достижения центру и равномерное освещенность поля зрения.
Шаг 1.3. Определить колебательных шума
Нанесите небольшое черное пятно краски на поверхность флуоресценции слайд. Запись интенсивности света с NeuroCCD в непрерывном режиме записи. Фокус цель на темном краю черной меткой чернила. Запись интенсивности света в течение 100 мс при 2 кГц частотой кадров. Отображение пространственных средних дробной интенсивность света следы (f / F) от ~ 20 пикселей получения света от равномерно освещенные области и от ~ 20 пикселей по краю чернилами знак. Избыточный шум в записях из пикселей с высокими краями отличие отражает колебательные шума всистемы.
Шаг 1.4. Виброизоляция
Он является обязательным для снижения вибрации с помощью вибрации изоляция таблице ниже уровня дробового шума при интенсивности света сравнима с экспериментальными условиями записи. Настройте таблицу виброизоляции, пока вибрационного шума по интенсивности света из пикселей покрытие резкий край изображения незначительны. Ни один из оборудования с движущимися частями (механические жалюзи, вентиляторы) может быть установлен на столе. Кабели от оборудования на таблице, прилагаемой к другим компонентам, которые не изолированы от вибрации должны быть свободными, чтобы они не передают механические колебания в микроскоп.
2. Выбор соответствующего нейрона для V м-Imaging
Шаг 2.1. Выбор нейронов
Сделать срезах мозга в соответствии со стандартными процедурами. Используйте мышь линии выражения EGFP в отдельных нервных клеток япроценты. С вращающийся диск конфокальной системы, визуализировать EGFP помечены нейронов в срезе. Выберите нейронов V м-изображений с неповрежденными дендритных / аксональной деревьев, а также с процессами параллельно и близко к поверхности среза. Это не может быть достигнуто в мышей дикого типа, потому что аксоны и дендриты тонкий, по большей части, не видны в режиме DIC микроскопии.
3. Загрузка нейронов с напряжением чувствительной краски
Шаг 3.1. Заполнение патч пипетки
Заполните пипетки стеклянные патч от кончика с красителем свободного внутриклеточного решения путем применения отрицательного давления в течение примерно 15 с до 2/3 от электродов конус. Красителя бесплатное решение на кончике необходимо для предотвращения разлива красителя на срез, что увеличивает фоновой флуоресценции и резко снижает отношение сигнал-шум. Вернуться заполнения электрода с раствором, содержащим напряжение мембраны impermeant чувствительной краситель растворяется JPW3028В внутриклеточных решение (0,8 мм).
JPW3028, самый успешный напряжение зонда для внутриклеточных приложений, является вдвойне положительно заряженный аналог ANEP серии липофильных стириловых красителей, что еще достаточно растворимы в воде, которые будут использоваться для микроинъекции. Ди-этиловый аналог этого красителя имеет практически идентичные характеристики (в том числе напряжения чувствительность) и доступен в продаже как JPW1114 (см. Таблицу 1). Мы готовим 20 мМ маточного раствора в дистиллированной H 2 O. 50 мкл аликвоты раствора хранятся замороженными при -20 ° C. Для окончательной концентрации красителя 0,8 мм, 2 мкл раствора растворяют в 50 мкл внутриклеточных решение на день эксперимента. Раствора красителя является стабильной и может храниться при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Таким образом, мы сохраняем один 50 мкл при комнатной температуре, пока не будет израсходован.
Шаг 3.2. Создание гига-уплотнение быстро
Шаг 3.3. Контроль за уровнем окрашивания
Во время красителя диффузии в цельноклеточной конфигурации, мониторинг физиологического состояния нейронов путем регистрации вызванных потенциалов действия в текущем зажим режиме. Кроме того, следить за количеством окрашивания, записывая отдыха интенсивности света (RLI) из клетки сомы с частотой кадров от 2 к Гц, а на долю от полной интенсивности света регулируется с фильтры нейтральной плотности (мы используем 0,04% от интенсивности лазерного излучения от 400 мВт лазер). Продолжить процесс загрузки красителя, пока потенциал действия начинает расширяться, как правило, после 20-40 минут, в зависимости от размера электрода и сопротивления.
Расширение шипованные полностью обратимо и, скорее всего, из-за емкостной нагрузки эффект насыщенного концентрации красителя в мембране соматической. Форма волны всплеска полностью восстановлен после концентрации красителя находится в равновесии по всему нейрону.
Шаг 3.4. Снимите красителя электрода
В конце периода окрашивания, осторожно потяните за патч пипетки от сомы в напряжении конфигурации зажим обеспечения того, чтобы переход от целых клеток для выезда за пределы патч конфигурации достигается в процессе.
Шаг 3.5. Подождите, пока краска диффузии
ных "> Инкубируйте кусочек для дополнительного 1.5-2 часа при комнатной температуре, чтобы обеспечить напряжение чувствительных красителей распространяться в нейронных процессов. после значительного количества красителя диффундирует от сомы в дендритные и аксональной процессов, форма волны AP полностью восстанавливается.4. Оптической записи
Шаг 4.1. Выбор сотового отсека для работы с изображениями
Найдите сомы окрашенных нейронов при низком уровне света флуоресценции и вновь патч нейрона со стандартной (без красителей) патч электрода ОПК. Визуализируйте нейронных процессов при низком уровне освещенности при частоте кадров 10-40 Гц в режиме непрерывной записи CCD для напряжения изображений. Уменьшить уровень света фильтры нейтральной плотности до минимума, необходимого для визуализации объектов, представляющих интерес. Мы используем 0,01% из 400 лазерных мВт при позиционировании окрашенных нейронов. Использование этапе XY, положение нейронных процессов интереса к тОн середине площадь изображения. Защита сомы от возбуждения света, используя частично закрыта диафрагма поля остановки микроскопом. Защитные сомы от света высокой интенсивности возбуждения позволит значительно снизить фотодинамической повреждений во время записи.
Шаг 4.2 Запись оптических сигналов, связанных с мембранный потенциал переходных
Запись оптических сигналов, связанных с backpropagated точек в отдельных дендритных ветвей. Запись оптических сигналов, связанных с точками доступа в аксон. Запись оптических сигналов, связанных с backpropagating точек доступа в дендритных шипиков. Используйте кадров подходят для точного восстановления формы сигнала и сохранить записи периодов и воздействия света высокой интенсивности возбуждения как можно короче, чтобы минимизировать отбеливания красителя и фотодинамической повреждения. Например, рассматривая последовательность зарождения и распространения одной потенциалов действия в аксон требует записи периодов 5-10 мс. Возбуждение интенсивности светати во время записи является компромиссом между сигнал-шум с одной стороны, и степень обесцвечивания красителя и фотодинамической повреждения, с другой стороны. Мы используем 100% интенсивностью 400 мВт лазер в записи с длинными участками аксонов, когда площадью 300 мкм в диаметре горит. При возбуждении светом сосредоточено до 30 мкм диаметром область дендритных визуализации позвоночника, мы используем 10-25% от интенсивности лазерного излучения. Необходимая продолжительность записи является важным фактором, определяющим оптимальный интенсивности возбуждающего света; более короткие периоды записи позволяют высокой интенсивности света. Оптимальная интенсивность освещения лучше всего определяется эмпирически для каждого препарата и измерения параметров.
5. Анализ данных
Шаг 5.1. Исправьте исходные данные для известных ошибок
Анализ и отображение данных проводились с использованием NeuroPlex программы (RedShirtImaging), написанный в IDL (ITT Visual Information Solutионы, Боулдер, штат Колорадо) и пользовательские Visual Basic процедуры. В условиях низкого уровня освещения, фоновой флуоресценции становится важным определяющим фактором f / F сигнала размера. Исходные данные впервые были исправлены этого эффекта путем вычитания средней интенсивности флуоресценции фон определяется из неокрашенных области на срезе. Впоследствии, программное обеспечение сигнал выравнивания была использована для корректировки временных джиттера в AP инициирования, а также для возможных мелких движений препарата во время усреднения. В височной области, А. П. сигналы были выровнены по взаимной корреляции электрически записанные точек в каждом испытании на опорный сигнал приобрел в начале усреднения (рис. 1b). В пространственной области изображения были выровнены в двух измерениях автономный образ кросс-корреляцию, чтобы компенсировать возможные небольшие боковые движения препарата. Правильная фокусировка изображения в Z-измерении была проверена до каждого отдельного судебного разбирательства; маленький л коррективы часто были необходимы. Пространственном и временном соответствие сигналы были усреднены, как показано на рисунке 1b. Медленные изменения в интенсивности света из-за обесцвечивания красителя были исправлены путем деления данных по соответствующим двойной экспоненциальной функции, полученные от записи испытания, не стимуляции (рис. 1b). Форма волны сигнала AP был реконструирован из набора точек данных, использующие кубический сплайн интерполяции, кусочно-непрерывная кривая, проходящая через каждую точку данных. Чтобы убедиться, что напряжение чувствительных красителей сигнала отслеживает мембранный потенциал без существенных искажений в масштабе времени миллисекунды, электрический сигнал AP от сомы был по сравнению с оптического сигнала AP из соседнего холма аксона, как показано на рисунке 3b. Два сигнала накладывать очень тесно, что позволяет дробовых шумов в оптической записи.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Анализ данных (анимация). (A) Верхняя панель: высокое разрешение конфокальной изображения окрашенных нейронов с аксона в положение записи. Запись электрод прикреплен к сому и внеклеточной стимулирующий электрод рядом с базальных дендритов схематически. Действие потенциалов, вызванных внеклеточным, синаптической стимуляции. Нижняя панель: низкое пространственное разрешение изображения флуоресценции аксона получены CCD используется для V м томография (B) Электрод записи из сома (черные следы), оптической записи с AIS (красные следы), а из узлов Ранвье (зеленые следы). . Топ следы: исходные данные из 9 исследований показывает временной джиттер в AP посвящения. Второй ряд следов: временно соответствие сигналов. Третий ряд следов: усредненный сигнал. Четвертый ряд следов: отбеливатель коррекции. Нижний следы: кубический сплайн-интерполяции с одним проходом временное сглаживание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное конфокальной микроскопии должно позволить четкое определение интактного нейронных процессов, которые близки к поверхности среза и расположены в одной плоскости фокуса. Выбор нервных клеток, которые используются для визуализации напряжения до напряжения чувствительных красителей нагрузки является критической. Например конфокальной изображения L5 пирамидальные нейроны, экспрессирующие EGFP в корковых срез (Crym трансгенных мышей линии) показаны на рисунке 2. Аксоны отдельных нейронов, четко видны. Клетки с длинным нетронутыми аксоны (белые стрелки) в одной плоскости фокуса близко к поверхности среза были выбраны.
Рисунок 2. Выбор L5 корковых нейронов на V-м визуализация сигналов AP от аксонов. Низкий (слева) и высокой (справа) увеличение изображения одного и того же региона срез; 488 нм возбуждения использованием Yokogawaвращающийся диск сканера.
Пространственная структура Na-канал кластеризации в начальном сегменте аксона (АИС) играет важную роль в настройке нейронов вычислений и изменения в Na-каналов распределения, как было показано посредником новых форм пластичность нейронов в аксон. Тем не менее, иммуноцитохимических данных по каналу распределения не может напрямую прогнозировать пространственно-временные характеристики потенциала действия посвящения, и до электрофизиологических меры являются либо косвенное (внеклеточный) или не имеют достаточного пространственного разрешения (внутриклеточных) непосредственно характеризуют зоны всплеска триггер (TZ). Критическим методологические улучшения чувствительности мембранного потенциала методом визуализации описаны здесь обеспечивает прямое определение местоположения и длины шипа TZ, как это определено в функциональном плане. Пример записи AP сигналы с высоким пространственным и временным разрешением показано на рисунке 3. Рисунок 3B показывает, чтодоступно чувствительности V-м визуализация было достаточно для точного мониторинга подпороговой деполяризации предшествующих регенеративной сигнал AP. Кроме того, сравнение оптических сигналов AP от сомы / аксонов холмик и из более отдаленных узлов Ранвье подтвердил, что точки доступа имеют заметно различную динамику в этих двух мест 8, 15, оба поршня вверх и снижение AP была быстрее в узлов Ранвье. Более подробную информацию о пространственно-временных пределах разрешение при измерении размеров и положения TZ шипованные см. рисунки 3 и 5 Попович и соавт. (2011).
Рисунок 3. Действие потенциальных сигналов от аксона. (A) Верхняя панель: высокое разрешение конфокальной изображения L5 корковых нейронов загружается с напряжением чувствительных красителей с аксона в положение записи; проекция фрОМ Z-Stack конфокальных изображений. Запись / стимулировании патч электрод прикреплен к сому. Нижняя панель: низкое пространственное разрешение изображения флуоресценции аксона получены CCD используется для V м-изображений. (B) AP связанных сигналов, записанных с частотой кадров 10 кГц. Следы на право: AP переходные из трех мест: 1-электрод записи из сома, 2-оптической записи из аксонов холмик; 3-оптической записи от первого узла Ранвье. Нижний следы: Наложение сигнала от тех же трех местах.
Нелинейного взаимодействия возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) и БАТ в дендритах, который отвечает за индукцию LTP до конца не изучен. Это взаимодействие существенно зависит от амплитуды обоих сигналов и, следовательно, должно быть пространственно неоднородно. Экспериментальная проверка этого предсказания требует пространственно хорошо разрешенных измерений, которые не были проведены, потому что дендритные ветви малого диаметра не являютсяccessible к электроду измерений. Мембранного потенциала методом визуализации описаны здесь позволяет осуществлять мониторинг электрической сигнализации из нескольких мест во всей беседке дендритные, как показано на рисунке 4. Характер БАТ деятельности в дендритных беседки характеризуется натриевого тока доминирует шипы в проксимальных регионах, которые постепенно меняется к длительным кальция текущего доминируют деполяризующих событий в дистальных дендритах.
Рисунок 4. Действие потенциальных сигналов из нескольких мест на дендритных беседки из L5 корковых нейронов. Слева: изображение высокого разрешения L5 корковых нейронов загружается с напряжением чувствительных красителей; проекция из Z-Stack конфокальных изображений. Справа: взрыв 4 AP инициирован при 100 Гц короткие деполяризующих импульсов тока (нижний луч) доставлены в сомы. Backpropagatingие потенциальных сигналов от шести выбранных местах (1-6) по апикальных дендритов и косой. Следы от 1 до 3, были получены от одной записи суда. Трассировка 4 представляет собой четыре средних суда, в то время как следы 5 и 6 шестнадцать средних суд.
Гипотеза, что шипы имеют электрический роль изменения синаптической эффективности, что лежит в основе пластичности и, возможно, обучения и памяти механизмы недавно получила значительное внимание из-за его критических последствий для мозга (Yuste, 2010). Существует, однако, очень мало прямых экспериментальных доказательств в пользу или против этой гипотезы. Неопределенность в интерпретации косвенных результатов и отсутствия прямых доказательств об электрических поведение дендритных шипиков обусловлено в первую очередь методологических ограничений - шипы являются небольшими и не доступны для обычных методов электрофизиологии. Таким образом, попытки исследовать этот вопрос в отсутствие экспериментальных данных, опиралась накомпьютерного моделирования с оценкой электрических параметров на основе морфологии позвоночника и диффузионные свойства позвоночника шея. Напряжение визуализации подход, описанный здесь, позволяет отслеживать действия потенциальных сигналов и синаптической потенциальных сигналов на пространственных масштабах отдельных дендритных шипов с высокой чувствительностью. Эксперименты теперь могут быть разработаны непосредственно проверить основные теоретические предсказания о поведении электрического дендритных шипиков. Например оптических сигналов, связанных с backpropagating точек доступа в отдельные дендритные позвоночника и его родителей дендритов показано на рисунке 5.
Рисунок 5. Действие потенциальных сигналов от отдельных дендритных позвоночника. Левая панель: верхний микрофотографии - анатомическая реконструкция получена из стека вращающийся диск конфокальной изображения. Нижняя микрофотографии - этuorescence изображений одного и того же региона, полученные с ПЗС-камерой для V м-изображений. Справа: Интенсивность флуоресценции прослеживает соответствующий БАТ от места 1-3, описанные на изображения CCD. Временные средние 9 исследований. Нижний след: электрод записи из сома. Обратите внимание, что следом 3 от площади без позвоночника не поддающийся обнаружению сигнал, указывающий на низкий уровень рассеяния света в поверхностном слое срез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается напряжения чувствительных красителей метод записи для мониторинга электрической активности отдельных нейронов с суб-микронных и суб-миллисекунды пространственно-временного разрешения. Лазерное возбуждение при почти оптимальной длины волны (относительно сигнала размера) улучшилась чувствительность записи на коэффициент ~ 50 по сравнению с предыдущими подходами. В настоящее время чувствительность позволяет контролировать электрические сигналы от всех частей отдельных нейронов, в том числе дендриты, аксоны, аксон залогов и аксонов терминалов, а также отдельных дендритных шипов. В настоящее чувствительности, записи переходных процессов мембранного потенциала может быть осуществлен с частотой кадров до 20 кГц. Модест усреднения сигнала (4-25 испытаний) можно легко повысить чувствительность записи выражается в виде отношения сигнал-шум на 2-5 раз. Главным ограничением напряжения изображений является отсутствие простого калибровки оптических сигналов из разных мест по абсолютной шкале напряжения. В некоторых подготовкус этим могут быть решены путем поиска сигнала мембранный потенциал, который имеет известные амплитуды во всех местах. AP сигналов в аксон, а в некоторых полностью возбудимым дендритов 6 обеспечивают отличный уровень калибровки.
Критические шаги в применении этой методологии являются:
- Сведение к минимуму световые эффекты рассеяния на ограничение записей в нейронов, расположенных вблизи поверхности острых кусочков мозга (<30 мкм). Это потребовало оптимизации нарезки процедура получения высокого процента здоровых нейронов в верхнем слое срез 1.
- Оптимизация количества прозрачного раствора на кончике электрода для доставки красителя, чтобы обеспечить быструю загрузку нейронов.
- Устранение механических вибраций препарат, который может быть источником избыточного шума в оптической записи.
- Применение малошумящих непрерывной волны (CW) лазеры с шумом RMS амплитуда <0,5% в качестве источника бывшихЦитата света.
- Контроль фотодинамической повреждения, выбрав соответствующую интенсивность света возбуждения по отношению к продолжительности периода записи и разделения последовательных записей темные периоды. Более длительные периоды записи требуют более низких интенсивностей света, чтобы предотвратить фотодинамической повреждения.
Запись примеры, приведенные выше, показывают, поворотным пунктом в позвоночнике и аксонов физиологии. Эти записи показывают замечательную силу имея возможности напрямую регистрировать электрические событий, которые могут быть проанализированы только с теоретической точки зрения в прошлом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Деян Zecevic заявляет, что он является совладельцем RedShirtImaging LLC., Компания, специализирующаяся на высокой скорости, низкий уровень шума ПЗС-камеры, используемые в вольт-чувствительных красителей записи. Все другие авторы сообщают об отсутствии финансовых интересов или потенциальных конфликтов интересов, связанных с текущим исследования.
Acknowledgments
Мы благодарны нашим сотрудникам Кнут Холтофф, Артур Konnerth и Марко Canepari, которые участвовали в начальном развитии этой техники, а также Лесли М. Лоев за любезно предоставленные красителей. Поддерживается NSF гранта IOS-0817969, NIH гранты NS068407 и M136043 и Кавли Институт неврологии Йельского университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M.
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
