Summary
서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.
Abstract
biophysical 속성과 하나의 뉴런의 기능 조직을 이해하고 어떻게 프로세스 정보가 뇌가 어떻게 작동하는지 이해하는 중요한 요소입니다. 모든 신경 세포의 주요 기능은 보통 여러 소스에서 전기 신호를 처리하는 것입니다. neuronal 프로세스의 전기적 특성은 세부 측정의 부재에 예측하기 매우 복잡한 동적, 그리고 일반 경우에는 불가능합니다. 하나가 겠어 이러한 측정을 얻으려면 이상적으로, 그들은 neuronal 프로세스 및 작업 가능성 개시에 영향을 특정 위치에서 summate에 원산지 사이트의 여행으로 여러 사이트에서 subthreshold 이벤트를 모니터링 할 수 싶어요. 이 목표는 전극을 채용 측정의 기술적 한계로 인해 모든 신경을 달성되지 않았습니다. 이 단점을 극복하기 위해, 그것은 광범위한 병렬 recordin을 허용 이미징 기술을 패치 - 전극 접근 방식을 보완하기 위해 매우 바람직하다신경 세포의 모든 부분에서 GS. 하위 밀리 초와 하위 마이크로 미터 해상도의 특징 - 유기 전압에 민감한 염료 (V m-영상)과 막 잠재적 인 과도의 광학 녹음 - 여기, 우리는 이러한 기술을 설명합니다. 우리의 방법은 전압에 민감한 분자 프로브 2 선구적인 작업을 기반으로합니다. 초기 기술의 여러 측면이 지속적으로 수십 년 3, 5, 11을 통해 향상되었습니다. 또한, 이전의 작품은 V m 이미징의 두 중요한 특성을 문서화. 첫째, 형광 신호는 전체 생리적 범위 (, 10, 14, 16 100 뮤직 비디오에 -100 뮤직 비디오)를 통해 막전위에 비례합니다. 둘째, 여기에 사용되는 전압에 민감한 염료 (JPW 3028)와로드 뉴런이 감지 약리 효과가 없습니다. 기록 염료를로드하는 동안 스파이크를 확대하는 것은 7 4 완전히 치료입니다. 또한, 실험 증거는 확보하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다모든 감지 phototoxic 효과 4 이전 녹음의 상당수 (최대 수백), 6, 12, 13. 현재, 우리는 V m-이미징 기술의 감도를 극대화 할에 가까운 최적의 파장 레이저 광원의 뛰어난 밝기와 안정성의 이점을 누리십시오. 현재 감도는 axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 가지, 개인 수지상의 쪽 포함하여 신경 세포의 모든 부분에서 V m의 과도의 여러 사이트 광학 녹음 할 수 있습니다. 신호의 상호 작용을 취득 정보뿐만 아니라 동영상의 형태로 직접 시각화와 같은 양적 분석 할 수 있습니다.
Protocol
1. 장비 설치
1.1 단계. 영상 설정
전압에 민감한 염료 신호를 기록하기위한 핵심은 적절한 설치 디자인입니다. 우리는 세 대의 카메라가 장착 수직 현미경 (BX51WI 올림푸스 또는 Zeiss AxioExaminer)을 사용합니다. 설정은 니콘 60X/1.0 NA 또는 Zeiss 63X/1.0 NA 물을 찍어 목표를 사용하여 에피 형광, 넓은 필드 현미경 모드에서 여기 빛으로 뇌 조각의 조명 개별 뉴런을 위해 설계되었습니다. 우리 현미경은 진동 절연 테이블에 고정 방문객 이동 단계가 구비되어 있습니다. 각 현미경은 세 카메라 포트를 갖추고 있습니다. 하나의 카메라 포트는 비디오 현미경 (IR-1000, Dage MTI, USA) 적외선 DIC에 대한 표준 높은 공간 해상도 CCD 카메라가 있습니다. 두 번째 카메라 포트는 상대적으로 낮은 공간 해상도 (80 X 80 픽셀)하지만, 뛰어난 동적 범위 (14 비트) 및 읽기 매우 낮은과 빠른 데이터 수집 카메라 (최대 20 kHz에서 프레임 속도)이소음 (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, 디카 터, GA). 에 대한 공 촛점 이미지의 Z-스택을 수집하는 데 사용하는 회전 - 디스크 공 촛점 스캐너 (CSU-10, 요코, 일본)에 장착, 세 번째 카메라 포트는 높은 공간 해상도를 가진 CCD 카메라 (PCO AG, 독일 PixelFly, 1392x1024 픽셀)이 스테인드 세포의 자세한 형태학의 재건. 주파수 두 배로 다이오드 펌프 ND를 : 532 nm의 (MLL-III/400 MW, CNI, 장춘, 중국)에서 YVO4 연속 웨이브 레이저 (400 MW) 발광은 여기 빛의 원천입니다. 셔터 (LS6, 빈센트 연결합니다)에 의해 개폐 2mm 직경의 레이저 빔이 뒤쪽 조리개를 너무 많이 넣다하도록 설계된 단일 포트 epifluorescence 응축기 (포토닉스 GmbH의, Gräfelfing까지 독일)를 통해 현미경에 커플 링 라이트 가이드로 이동합니다 객관적이고 객체 비행기의 균일 한 조명 근처에 있습니다. 레이저 광은이 V m-영상의 감도를 극대화 할 수있는 기존의 제논 아크 - 램프 대신에 사용됩니다 : (1) 단색 예를 사용하여염료 9, 10 (2) 아크 - 램프에 의해 달성 할 수있는 수준을 넘어서 여기 빛의 강도를 증가 V m 감도를 극대화 할 수있는 흡수 스펙트럼의 붉은 날개에서 인용 빛. 기진 빛이 560 나노 미터와 기록 형광 빛이 610 nm의 장벽 필터 (SCHOTT RG610)를 통해 전달 된의 중심 파장과 이색 성 거울로 준비에 반영되었습니다. 빛 강도 증가와 가까운 최적의 단색 여기 파장의 사용의 통합 효과는 이전의 측정 6에 비해 약 50의 요소를 기준으로 전압 이미지의 감도에 극적으로 개선했다.
1.2 단계. 균일 한 조명으로 조정
형광 슬라이드 표준을 (녹색 여진 / 빨간색 방출)을 사용합니다. CCD는 포화되지 않은 수 있도록 레이저 빔 경로에 해당하는 중립적 인 밀도 필터를 삽입합니다. 의 표면에 목표를 집중슬라이드. 레이저 런처 목표 앞의 석영 빛 가이드의 수신 끝의 위치를 조정하고, 달성하기 어려운 형광 콘덴서에 적절한 액츄에이터를 사용하여 현미경에 부착 된 광 가이드의 출력 끝의 위치를 조정 중심의 균일 시야의 조명.
1.3 단계. 진동 소음을 결정
형광 슬라이드의 표면에 작은 검은 색 잉크 표시를하십시오. 연속 촬영 모드에서 NeuroCCD과 기록 빛의 세기. 검은 색 잉크 마크의 어두운 가장자리에 목표를 집중하십시오. 2 kHz에서 프레임 속도 약 100 밀리 초에 대한 빛의 세기를 기록합니다. 균일하게 조명 영역에서와 잉크 마크의 가장자리 ~ 20 픽셀의 빛을받는 ~ 20 픽셀의 부분 광도 흔적 (ΔF / F)의 공간 평균을 표시합니다. 고 대비 가장자리와 픽셀의 녹음에 과다한 소음의 진동 소음을 반영시스템.
1.4 단계. 진동 절연
이 실험 녹음 조건에 비해 광도의 샷 노이즈 아래 수준으로 진동 절연 테이블을 사용하여 진동을 줄이기 위해 필수입니다. 이미지의 날카로운 가장자리를 덮고 픽셀에서 빛의 세기에 진동 소음이 무시할 때까지 진동 절연 테이블을 조정합니다. 움직이는 부품 (기계 셔터, 팬)과 장비의 없음이 테이블에 장착 할 수 없습니다. 진동으로부터 격리되지 않은 다른 구성 요소에 연결된 테이블에 장비의 케이블들은 현미경을 기계적 진동을 전송하지 않는 것이 느슨한 있도록해야합니다.
2. V m-이미징을위한 적절한 신경 세포의 선택
2.1 단계. 뉴런의 선택
표준 절차에 따라 뇌 조각을 만듭니다. 나는의 개별 신경 세포에서 EGFP을 표현 마우스 줄을 사용하여nterest. 회전 디스크 공 촛점 시스템으로 슬라이스에서 EGFP 표시 뉴런을 표시합니다. 그대로 axonal / 수지상 나무가 V m-이미징에 대한 뉴런를 선택하고 프로세스가 슬라이스의 표면과 평행과 가까이에 실행으로. axons과 얇은 수석은 대부분의 경우, DIC 현미경 모드에서 볼 수 없습니다 때문 야생 형 생쥐에서 수행 할 수 없습니다.
3. 전압에 민감한 염료로로드 뉴런
3.1 단계. 패치 피펫의 작성
전극 테이퍼의 2 / 3까지 약 15 s에 대한 부정적 압력을 적용하여 염색 무료 세포 솔루션을 끝에서 유리 패치 피펫를 입력합니다. 끝에서 염료를 무료로 솔루션은 배경 형광을 증가하고 극적 노이즈 비율로 신호를 감소 슬라이스에 염료의 유출을 방지 할 필요가 있습니다. 용해 막 impermeant 전압에 민감한 염료 JPW3028를 포함하는 솔루션을 전극을 백업 작성세포 솔루션 (0.8 ㎜).
JPW3028, 세포 내 응용 프로그램에 대한 가장 성공적인 전압 프로브는 아직 microinjection에 사용 할 용해 충분히 물 lipophilic styryl 염료의 ANEP 시리즈의 이중 긍정적으로 청구 아날로그입니다. 이 염료의 디 에틸 아날로그 거의 동일한 특성을 (전압 감도 포함) 보유하고 JPW1114 (표 1 참조)와 같은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 소주 H 2 O.에서 20 MM 주식 솔루션을 준비 재고 솔루션 50 μl aliquots는 -20 ° C.에 고정 유지됩니다 0.8 mm의 최종 염료 농도를 들어, 재고 솔루션 2 μl는 실험 당일 세포 솔루션의 50 μl에 용해되어 있습니다. 재고 염료 솔루션은 안정적이며, 몇 개월 동안 실온에서 보관 할 수 있습니다. 이 소진 될 때까지 따라서, 우리는 실내 온도에 하나의 50 μl 나누어지는을 유지.
3.2 단계. 신속 기가 - 인감을 수립
3.3 단계. 착색의 수준을 모니터
전체 셀 구성에 염료 확산되는 동안, 전류 클램프 모드에서 evoked 액션 잠재력을 기록하여 신경 세포의 생리 상태를 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 2 K의 프레임 속도로 셀 소마에서 휴식 광도 (RLI)를 기록하여 착색의 양을 모니터링 Hz에서하고 중립적 인 밀도 필터 (우리는 400 MW 레이저에서 레이저 광 강도의 0.04 %를 사용)로 조정 전체 광도의 일부에서. 액션 잠재력은 전극의 크기와 저항에 따라, 보통 20-40분 후, 확대하기 시작 때까지 염료로드 프로세스를 계속합니다.
스파이크의 확대는 완전히 치료와 체세포의 막에있는 염료의 포화 농도의 용량 부하 효과 때문일 가능성이 높습니다. 염료 농도가 신경에 걸쳐 equilibrated 후 스파이크의 파형이 완전히 복원됩니다.
3.4 단계. 염료 전극을 제거
기간 얼룩의 말에 조심스럽게 외부 아웃 패치 구성에 전체 세포의 전환이 과정에서 달성되어 있도록 전압 클램프 구성에 소마에서 떨어져 패치 피펫을 당긴다.
3.5 단계. 염료 확산 기다립니다
다닐 "> neuronal 프로세스에 전파 할 수있는 전압에 민감한 염료를 사용할 수 있도록 상온에서 추가 1.5-2 시간의 조각을 배양. 수지상 및 axonal 프로세스의 파형으로 소마에서 도보로 염색 diffuses 상당한 양의 후 AP가 완전히 복원됩니다.4. 광학 녹음
4.1 단계. 이미지에 대한 세포 구획을 선택
낮은 조명 수준의 형광 및 재 패치 DIC 아래 표준 (없음 염료) 패치 전극과 뉴런에서 스테인드 뉴런의 소마를 찾습니다. 전압 이미징을위한 CCD의 연속 녹화 모드에서 10-40 Hz의 프레임 속도에서 낮은 조명 수준에서 neuronal 프로세스를 표시합니다. 관심의 대상을 시각화하는 데 필요한 최소 중립적 인 밀도 필터를 빛 수준을 줄일 수 있습니다. 우리는 스테인드 신경의 위치 동안 400 MW 레이저 강도의 0.01 %를 사용합니다. XY 스테이지 사용하여 t에 대한 관심의 neuronal 과정을 위치이미지 영역의 중간 그는. 현미경의 부분적 폐쇄 필드 스톱 아이리스를 사용하여 여기 빛으로부터 소마를 보호합니다. 높은 강도 여기 빛으로부터 소마를 차폐하는 것은 상당히 녹화하는 동안 photodynamic 손상을 줄일 수 있습니다.
막 잠재적 인 과도에 관한 기록 4.2 광 신호를 단계
개인 수지상 가지의 backpropagated APS에 관한 광학 신호를 기록합니다. 축삭의 APS에 관한 광학 신호를 기록합니다. 수지상 쪽의 APS를 backpropagating에 관한 광학 신호를 기록합니다. 신호 파형의 정확한 복원에 적합한 프레임 속도를 사용하고 표백 염색 및 photodynamic 피해를 최소화하기 위해 녹음 기간과 높은 강도 여기 빛에 노출 가능한 한 짧은으로 유지. 예를 들어, 축삭에 하나의 액션 전위의 개시와 전파의 순서를 검토하는 것은 5-10 밀리 초의 기록 기간이 필요합니다. 여기 빛 intensi녹화하는 동안 티는 한 손에 신호 대 잡음 비율과 표백 염색의 정도와 다른 한편으로는 photodynamic 손상 사이의 타협이다. 우리는 직경 300 μm의 영역이 밝아 axons의 긴 섹션에서 녹화에 400 MW 레이저의 강도의 100 %를 사용합니다. 여기 광이 수지상 척추 이미징을위한 30 μm 직경 영역에 초점을 맞추고 있습니다 때, 우리는 레이저 광도의 10~25%을 사용합니다. 녹화 필요한 기간은 최적의 여기 광도의 중요한 결정자이다; 짧은 녹음 기간은 높은 빛 농도 할 수 있습니다. 최적의 조명 강도가 가장 각 준비 및 측정 설정에 경험적으로 결정됩니다.
5. 데이터 분석
5.1 단계. 알려진 오류에 대한 원시 데이터를 수정
데이터의 분석 및 디스플레이 IDL (ITT 영상 정보 Solut로 작성된 NeuroPlex 프로그램 (RedShirtImaging)를 사용하여 수행되었다이온, 볼더, 콜로라도) 및 사용자 정의 비주얼 베이직 루틴. 낮은 조명 수준의 조건에서 배경 형광은 ΔF / F 신호 크기의 중요한 결정자가된다. 원시 데이터가 먼저 슬라이스에 흠없는 지역에서 결정된 평균 배경 형광 강도를 차감하여이 효과 수정되었습니다. 그 후, 신호 정렬 소프트웨어는 AP 개시의 시간적 지터에 대한뿐만 아니라 평균 동안 준비의 가능한 작은 움직임에 대한 해결하기 위해 사용되었다. 시간적 도메인에서 AP의 신호 평균화의 시작 (그림 1B)에 인수 기준 신호 각 재판에서 전기적으로 기록 된 APS의 교차 상관 관계에 의해 정렬되었습니다. 공간 도메인에서 이미지는 준비의 가능한 작은 측면 움직임을 보상하기 위해 이미지 간 상관 관계에 의해 2 차원 오프라인으로 정렬되었습니다. Z-차원의 이미지의 정확한 초점은 각각의 재판 전에 확인했습니다, smal 난 조정은 종종 필요했다. 그림 1b에 도시 된 바와 같이 spatially과 시간적으로 정렬 신호를 평균했다. 염료의 표백에 의한 빛의 세기에 느린 변경 사항은 더 자극 (그림 1B)를 기록 재판에서 파생 적절한 이중 지수 함수로 데이터를 나누어 해결되었습니다. AP 신호의 파형은 큐빅 스플라인 보간, 각 데이터 포인트를 통과 piecewise 연속 곡선을 사용하여 데이터 포인트의 세트에서 복원되었습니다. 전압에 민감한 염료 신호가 밀리 초 시간 규모에서 큰 왜곡없이 막 잠재력을 추적 확인하려면 소마에서 전기 AP 신호는 그림 3B와 같이 인접한 축삭의 소구에서 광학 AP 신호에 비해되었다. 두 신호는 광학 녹음의 샷 잡음을 허용하는 매우 밀접하게 비교하십시오.
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1 그림. 데이터 분석 (애니메이션). (A) 상단 패널 : 기록 위치에 축삭과 스테인드 신경 세포의 고해상도 공 촛점 이미지입니다. 기록 전극 소마와 개략적으로 표시 기저 dendrite 옆에있는 세포 자극 전극에 부착. 액션 잠재력은 세포, 신경 자극에 의해 evoked. 낮은 패널 :. V m 이미징에 사용 (B) 소마 (검은 흔적)에서 전극 녹음, AIS (빨간색 흔적)에서 광학 녹음하고, Ranvier의 노드 (녹색 흔적)에서 CCD에 의해 얻은 축삭의 낮은 공간 해상도 형광 이미지 . 인기 흔적 : AP 개시의 관자놀이 지터를 보여 9 평가판에서 원시 데이터입니다. 트레이스의 두 번째 행 : 시간적으로 신호를 정렬. 흔적의 셋째 줄 : 평균 신호. 흔적 번째 행 : 표백제를 수정. 하단 트레이스 : 일시적으로 스무딩 중 하나를 패스 입방 스플라인 보간.
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Representative Results
성공적인 공 촛점 현미경은 슬라이스의 표면에 인접 해 있으며, 초점 중 하나가 비행기에있는 그대로 neuronal 프로세스의 명확한 식별을 허용해야합니다. 전에 전압에 민감한 염색 로딩에 전압 이미징에 적합한 신경 세포의 선택은 중요합니다. 대뇌 피질의 슬라이스 (Crym 유전자 변형 마우스 라인)에서 EGFP을 표현 L5 피라미드 뉴런의 공 촛점 이미지의 예는 그림 2에 표시됩니다. 개별 뉴런의 Axons 명확하게 볼 수 있습니다. 슬라이스의 표면에 가까운 초점 중 하나가 비행기에서 긴 그대로 axons (흰색 화살표)로 셀이 선택되었습니다.
그림 2. axons의 AP 신호의 V m 이미징을위한 L5 대뇌 피질의 뉴런의 선택. 동일한 슬라이스 지역의 낮은 (왼쪽)와 고 (오른쪽) 확대 이미지, 488 나노 미터 여기 요코를 사용하여디스크 스캐너를 회전.
축삭 초기 세그먼트의 구명 채널 클러스터링의 공간 패턴 (AIS)은 축삭에 neuronal 소성의 소설 양식을 중재하기 위해 표시되었습니다 neuronal 계산 및 구명 채널 유통의 변화를 조정에서 중요한 역할을합니다. 그러나, 채널 배포 immunocytochemical 데이터는 직접 행동 잠재력 개시의 spatiotemporal 특성을 예측할 수 있으며, 이전에 electrophysiological 조치 중 하나 간접적합니다 (세포) 또는 직접 스파이크 트리거 영역 (TZ)를 특성화하기에 충분한 공간 해상도 (세포) 부족합니다. 여기에 설명 된 막 잠재적 인 이미징 기술의 감도에있는 중요한 방법론 개선 기능 약관에 정의 된대로 스파이크 TZ의 위치와 길이 직접 결정 할 수 있습니다. 높은 공간과 시간적 해상도에서 AP 신호를 녹음의 예는 그림 3에 표시됩니다. 그림 3B 그를 보여줍니다V m - 이미지의 사용 가능한 감도는 재생 AP 신호를 이전 subthreshold의 탈분극의 정확한 모니터링을위한 충분했다. 또한, 소마 / 축삭 소구에서와 Ranvier의 더 말초 노드에서 광학 AP 신호의 비교 APS이 두 위치 8, 15에서 뚜렷이 다른 역학을 가지고 있다는 것을 확인하고, 위쪽으로 그은 획과 AP의 downstroke 모두에 빠르 더라 Ranvier의 노드. 스파이크 TZ의 크기와 위치 측정에 spatiotemporal 해상도 제한에 대한 자세한 내용은도 3 및도 Popovic 5 외. (2011)을 참조하십시오.
축삭의 그림 3. 액션 잠재적 인 신호. (A) 상단 패널 : 기록 위치에 축삭과 전압에 민감한 염료로로드 L5 대뇌 피질의 신경 세포의 고해상도 공 촛점 이미지, 프로젝션 FR톰 공 촛점 이미지의 Z-스택. 녹음 / 소마에 부착 된 패치 전극을 자극. 낮은 패널 : V m-이미징에 사용되는 CCD 얻은 축삭의 낮은 공간 해상도 형광 이미지입니다. (B) AP 관련 신호는 10 kHz에서의 프레임 속도로 기록. 오른쪽에있는 성분이 세 위치에서 AP가 과도 : 소마에서 1 전극 녹음, 축삭 소구에서 2 광 기록, Ranvier의 첫 번째 노드에서 3 광학 녹음. 하단 트레이스 : 같은 세 위치에서 신호를 겹쳐.
LTP의 유도를 담당하는 수석의 흥분성의 postsynaptic 잠재력 (EPSPs)와 bAPs 사이의 비선형 상호 작용은 완전히 이해되지 않습니다. 이 상호 작용이 두 신호의 진폭이 매우 의존하고, 따라서, spatially nonuniform해야합니다. 작은 직경의 수지상 가지 않기 때문에이 예측 실험 시험은 수행되지 않은 spatially 잘 해결 측정이 필요전극 측정에 ccessible. 그림 4와 같이 여기에 설명 된 막 잠재적 인 이미징 기술은 전체 수지상의 아버의 여러 위치에서 전기 신호의 모니터링을 할 수 있습니다. 수지상 아버에있는 BAP 활동의 패턴은 말초 수석에서 이벤트를 depolarizing 지배 점진적으로 현재의 장기간 칼슘으로 변경 인접 지역에서 나트륨 현재 지배 스파이크에 의해 특징입니다.
그림 4. L5 대뇌 피질의 신경 세포의 수지상 아버의 여러 위치에서 액션 잠재적 인 신호. 왼쪽 패널 : 전압에 민감한 염료로로드 L5 대뇌 피질의 신경 세포의 고해상도 이미지, 공 촛점 이미지의 Z-스택에서 프로젝션입니다. 오른쪽 패널 : 소마에게 전달 짧은 depolarizing 현재 펄스 (아래 추적)까지 100 Hz에서 시작 네 AP의 버스트. 를 Backpropagating꼭대기와 경사 수석을 따라 여섯 선택한 위치 (1-6)에서 ction 잠재적 인 신호. 3 일 흔적 1 하나의 시험 기록에서 얻은되었습니다. 흔적 5 6 십육 시험 평균하는 동안 추적 4, 네 시험 평균입니다.
쪽은 underlies 소성 그리고 아마도 학습 및 메모리 메커니즘은 최근 때문에 뇌 기능을위한 중요한 의미 (Yuste, 2010)의 상당한 주목을받은 신경 효능을 수정의 전기 역할을하는 가설. 찬성 또는이 가설에 대한 거의 직접 실험 증거 그러나,이 있습니다. 간접적 결과의 해석 및 수지상 쪽의 전기적 문제에 대한 직접적인 증거의 부족의 불확실성은 주로 방법론 제한으로 인해 아르 - 쪽은 작은 전기 생리학의 통상적 인 방법으로 액세스 할 수 없습니다. 따라서,에 의존 실험 데이터의 부재에서이 문제를 조사하려고전기 매개 변수의 추정과 컴퓨터 시뮬레이션은 척추 형태와 척추 목의 diffusional 특성에 따라. 여기에 설명 된 전압 이미징 접근 방식은 고감도 개별 수지상의 쪽의 공간 규모 조치 가능성 신호와 신경 잠재적 인 신호를 모니터링 할 수있게. 실험은 이제 직접 수지상 쪽의 전기 문제에 대한 근본적인 이론적 예측을 테스트하도록 설계 할 수 있습니다. 개인 수지상의 척추와 부모 dendrite에 backpropagating APS에 관한 광 신호의 예는 그림 5에 표시됩니다.
그림 5. 개인 수지상의 척추에서 액션 잠재적 인 신호. 왼쪽 패널 : 상단 micrographs - 회전 디스크 공 촛점 이미지 스택에서 얻은 해부 reconstructions. 낮은 micrographs - 층같은 지역의 uorescence 이미지는 V m-이미징을위한 CCD 카메라로 획득. 오른쪽 패널 : 형광 강도는 1-3 CCD 이미지에 명시된 위치에서 BAP에 해당하는 흔적. 9 재판의 시간적 평균. 아래 추적 : 소마의 전극 녹음. 척추가없는 지역에서 추적 3 슬라이스의 얕은 층에 빛이 분산의 낮은 수준을 나타내는 detectible 신호가 더 있습니다 없습니다.
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Discussion
이 문서는 하위 마이크로 미터와 하위 밀리 초 spatiotemporal 해상도 개별 뉴런의 전기 활동을 모니터링하기위한 전압에 민감한 염료 기록 방법을 설명합니다. 가까운 최적의 파장 (신호 크기에 관한)에 레이저 여기가 ~ 50 이전 방법여의 비율에 의해 녹음의 감도를 향상되었습니다. 현재 감도는 수석, axons, 축삭의 민간인 피해와 축삭 터미널뿐만 아니라 개인 수지상의 쪽 등의 개인 뉴런의 모든 부분에서 전기 신호를 모니터링 할 수 있습니다. 현재 감도로 막전위의 과도의 녹음 최대 20 kHz에서까지의 프레임 속도로 수행 할 수 있습니다. 겸손한 신호 평균 (4-25 시험)은 쉽게 2-5의 비율에 의해 신호 대 잡음 비율로 표시 기록의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 전압 이미지의 주요 제한은 절대 전압 규모의 여러 위치에서 광 신호의 간단한 보정이 없다는 것입니다. 어떤 준비S이 모든 위치에서 알려진 진폭을 가진 막전위 신호를 검색하여 해결 할 수 있습니다. 축삭의 일부 완벽하게 고르기 수석 6 AP 신호는 훌륭한 보정 표준을 제공합니다.
이 방법의 응용 프로그램에서 중요한 단계는 다음과 같습니다
- 급성 두뇌 슬라이스 (<30 μm)의 표면 근처에 위치한 뉴런에 녹음을 제한함으로써 빛의 분산 효과를 최소화. 이 슬라이스 1의 상위 레이어에 건강한 뉴런의 높은 비율을 얻기 위해 썰기 절차를 최적화 필요합니다.
- 뉴런의 빠른 로딩을 확보하기 위해 염료를 전달하기위한 전극의 끝에서 맑은 용액의 양을 최적화.
- 광학 녹음의 초과 소음의 원천이 될 수있는 준비를 기계적 진동을 제거.
- 진폭의 RMS 노이즈와 채용 저소음 연속 파 (CW) 레이저 <열차의 소스로 0.5 %서지 정보 빛.
- 녹화 기간의 기간에 비해 적절한 여기 광도를 선택하여과 어두운 점으로 연속 녹화를 구분하여 photodynamic 손상을 제어. 긴 녹음 기간은 photodynamic 손상을 방지하기 위해 낮은 조명 강도를 필요로합니다.
위에 표시된 녹음 예제는 척추와 축삭의 생리학의 전환점을 나타냅니다. 이 음반은 직접은 과거의 이론적 근거를 분석 할 수 전기 이벤트를 기록 할 수있는의 놀라운 힘을 보여준다.
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Disclosures
노래 부를 Zecevic 그는 LLC를 RedShirtImaging의 공동 소유자., 전압에 민감한 염료 녹음에 사용되는 고속, 낮은 소음 CCD 카메라 전문 회사입니다 함을 선언합니다. 다른 모든 저자는 금융 관심사 나 현재 연구에 관한 관심의 잠재적 인 충돌을보고하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 우리의 공동 친절 염료를 제공하기 위해이 기술의 초기 개발에뿐만 아니라 레슬리 M. 로우에 참가 Knut Holthoff, 아서 Konnerth와 마르코 Canepari에 감사하고 있습니다. NSF 부여 IOS-0817969, NIH 보조금 NS068407와 M136043 의해 예일 대학에서 신경 과학을위한 Kavli 연구소에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
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