Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı
Summary
Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.
Abstract
Biyofiziksel özellikleri ve tek nöronların fonksiyonel organizasyon anlama ve nasıl işlem bilgileri beynin nasıl çalıştığını anlamak için esastır. Herhangi bir sinir hücresinin temel işlevi, genellikle birden fazla kaynaktan gelen elektrik sinyalleri, işlemek için. Nöronal süreçlerin elektriksel özellikleri detaylı ölçümler yokluğunda tahmin etmek için olağanüstü, kompleks dinamik ve genel durumda, imkansızdır. Biri olur böyle bir ölçüm elde etmek için, ideal, onlar nöronal süreçleri ve aksiyon potansiyeli inisiyasyon etkileme belirli yerlerde summate ilgili menşe sitelerinden giderken, birçok bölgeden, eşikaltı olayları izlemek edebilmek istiyorum. Bu hedef elektrotlar istihdam ölçümleri teknik sınırlamaları nedeniyle herhangi bir nöron elde edilmemiştir. Bu dezavantajı ortadan kaldırmak için, bu geniş paralel recordin izin görüntüleme teknikleri ile yama elektrot yaklaşımı tamamlayıcı çok arzulanan bir durumdurBir nöronun her yerinden gs. Alt-milisaniye ve alt-mikrometre çözünürlük ile karakterize – Organik voltaj duyarlı boyalar (V m-görüntüleme) ile membran potansiyeli Transientlerin optik kayıt – İşte, biz böyle bir tekniği tanımlar. Bizim metodumuz voltaj duyarlı moleküler problar 2 öncü çalışmalarına dayanmaktadır. İlk teknolojinin birçok yönü sürekli onlarca yıl 3, 5, 11 den fazla geliştirilmiştir. Ayrıca, daha önceki çalışmaları V m-görüntülemenin iki temel özellikleri belgelenmiştir. Öncelikle, floresan sinyalleri tüm fizyolojik aralığı (; 10, 14, 16 +100 mV -100 mV) üzerinde membran potansiyeli doğrusal orantılıdır. İkincisi, burada kullanılan voltaj duyarlı boya (JPW 3028) ile yükleme nöronlar saptanabilir farmakolojik etkisi yoktur. Kaydedilen boya yükleme sırasında başak genişletilmesi, 7 4 tamamen düzelir. Buna ek olarak, deneysel kanıtlar elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedirherhangi bir tespit fototoksik etkilerini 4 öncesinde kayıt önemli bir sayısını (yüz), 6, 12, 13. Şu anda, biz V m-görüntüleme tekniğinin hassasiyetini maksimize etmek için yakın uygun dalga boyunda bir lazer ışık kaynağı parlaklık ve istikrar yararlanmak. Yürürlükteki duyarlılık akson ve akson teminatlar, terminal dendritik dalları ve bireysel dendritik dikenler içeren bir nöronun her yerinden gelen V m Transientlerin birden fazla site optik kayıtları verir. Sinyal etkileşimleri Elde edilen bilgiler, aynı zamanda, bir film şeklinde doğrudan doğruya görselleştirildiği gibi nicel olarak analiz edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, alt-mikrometre ve alt milisaniyelik zamanmekansal çözünürlük ile bireysel nöronların elektriksel aktivitesini izlemek için bir voltaj duyarlı boya kayıt yöntemi açıklanır. Yakın optimum dalgaboyu (sinyal boyutu ile ilgili) de Lazer uyarılma ~ 50 önceki yaklaşımlar üzerinde bir faktör tarafından kayıt hassasiyeti artırıldı. Yürürlükteki duyarlılık dendritler, akson, akson teminatlar ve akson terminallerinin yanı sıra bireysel dendritik dikenler dahil bireysel nöronlar, her y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz işbirlikçileri nazik boyalar sağlamak için bu tekniğin ilk geliştirme yanı sıra Leslie M. Loew katıldı Knut Holthoff, Arthur Konnerth ve Marco Canepari minnettarız. NSF hibe IOS-0817969, NIH hibe NS068407 ve M136043 tarafından ve Yale Üniversitesi Nörobilim Kavli Enstitüsü tarafından desteklenir.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).
- Yuste, R. . Dendritic Spines. , (2010).
