Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.
Het begrijpen van de biofysische eigenschappen en functionele organisatie van enkele neuronen en hoe ze informatie verwerken is essentieel om te begrijpen hoe de hersenen werken. De primaire functie van een zenuwcel is om elektrische signalen te verwerken, gewoonlijk uit meerdere bronnen. Elektrische eigenschappen van neuronale processen buitengewoon complex dynamisch en, in het algemene geval, onmogelijk te voorspellen in afwezigheid van gedetailleerde metingen. Om een dergelijke meting zou worden verkregen, ideaal, wil graag in staat zijn om, monitoren op meerdere plaatsen, subdrempel gebeurtenissen als ze reizen van de sites van de oorsprong op de neuronale processen en summate op bepaalde locaties te actiepotentiaal initiatie beïnvloeden. Dit doel is niet bereikt in een neuron als gevolg van technische beperkingen van metingen die elektroden gebruiken. Te overwinnen dit nadeel is het zeer wenselijk om de patch-elektrode benadering vullen met beeldvormingstechnieken die uitgebreide parallel staan recordings uit alle delen van een neuron. We beschrijven een dergelijke techniek – optische registratie van membraanpotentiaal transiënten met organische spanningsgevoelige kleurstoffen (V m-imaging) – gekenmerkt door een milliseconde en sub-micrometer resolutie. De methode is gebaseerd op pionierswerk op spanningsgevoelige moleculaire probes 2. Veel aspecten van de initiële technologie zijn er continu verbeteringen over meerdere decennia 3, 5, 11. Bovendien eerder werk beschreven twee essentiële kenmerken van V m-imaging. Ten eerste fluorescentiesignalen zijn recht evenredig met membraanpotentiaal over het gehele fysiologische bereik (-100 mV tot +100 mV, 10, 14, 16). Ten tweede wordt geladen neuronen met de spanningsgevoelige kleurstof hier gebruikte (JPW 3028) geen detecteerbare farmacologische effecten. De opgenomen verbreding van de piek tijdens de kleurstof laden is volledig omkeerbaar 4, 7. Bovendien experimenten is aangetoond dat het mogelijk is te verkrijgeneen groot aantal (tot honderden) opnames vóór elke detecteerbare fototoxische effecten 4, 6, 12, 13. Er profiteren van de uitstekende helderheid en stabiliteit van een laser lichtbron met nagenoeg optimale golflengte de gevoeligheid van de V-m beeldvormingstechniek maximaliseren. De huidige gevoeligheid maakt het mogelijk meerdere locaties optische opnamen van V m transiënten uit alle delen van een neuron, met inbegrip van axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines. De verkregen gegevens over interacties signaal kwantitatief worden als direct gevisualiseerd in de vorm van een film geanalyseerd.
Dit artikel beschrijft een spanningsgevoelige kleurstof registreerwerkwijze voor Electrical activiteit van individuele neuronen met sub-micrometer en een milliseconde spatiotemporele resolutie. Laserexcitatie bij vrijwel optimale golflengte (over signaalgrootte) verbeterde de gevoeligheid van opname met een factor ~ 50 over eerdere benaderingen. De huidige gevoeligheid maakt de controle elektrische signalen uit alle delen van individuele neuronen, met inbegrip van dendrieten, axonen, axon collateralen en axon terminals …
The authors have nothing to disclose.
Wij danken onze medewerkers Knut Holthoff, Arthur Konnerth en Marco Canepari die in de initiële ontwikkeling van deze techniek alsook aan Leslie M. Loew deelgenomen voor vriendelijk het verstrekken van kleurstoffen. Ondersteund door NSF subsidie IOS-0817969, NIH beurzen NS068407 en M136043 en door Kavli Instituut voor Neurowetenschappen aan de Yale University.
Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Setup components | |||
Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
Specific reagents | |||
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |