Summary
उप सुक्ष्ममापी स्थानिक और उप millisecond अस्थायी समाधान के साथ झिल्ली संभावित परिवर्तनों की निगरानी के लिए एक इमेजिंग तकनीक वर्णित है. तकनीक, वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों के लेजर उत्तेजना, axons और collaterals अक्षतंतु टर्मिनल वृक्ष के समान शाखाओं, और व्यक्तिगत वृक्ष के समान spines संकेतों के मापन के आधार पर अनुमति देता है.
Protocol
1. उपकरण सेटअप
1.1 कदम. इमेजिंग सेटअप
वोल्टेज संवेदनशील डाई संकेतों रिकॉर्डिंग करने के लिए महत्वपूर्ण उचित सेटअप डिजाइन है. हम तीन कैमरों के साथ सुसज्जित एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (BX51WI ओलिंप या Zeiss AxioExaminer) का उपयोग करें. सेटअप महामारी प्रतिदीप्ति, व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी मोड में उत्तेजना प्रकाश द्वारा रोशन व्यक्तिगत मस्तिष्क स्लाइसें में न्यूरॉन्स या तो Nikon 60X/1.0 NA या Zeiss 63X/1.0 NA पानी की सूई उद्देश्यों का उपयोग करने के लिए बनाया गया है. हमारे सूक्ष्मदर्शी एक कंपन अलगाव तालिका bolted रहे हैं हैं और मोटर चालित चल चरणों के साथ सुसज्जित है. प्रत्येक खुर्दबीन तीन कैमरा बंदरगाहों के साथ सुसज्जित है. एक कैमरा बंदरगाह डीआईसी अवरक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी (IR-1000, Dage MTI, संयुक्त राज्य अमरीका) के लिए एक मानक उच्च स्थानिक संकल्प सीसीडी कैमरा है. 2 कैमरा बंदरगाह अपेक्षाकृत कम स्थानिक संकल्प (80 x 80 पिक्सल) लेकिन बकाया गतिशील रेंज (14 बिट) और असाधारण पढ़ने के कम के साथ एक तेजी से डाटा अधिग्रहण कैमरा (20 kHz फ्रेम दर)शोर (NeuroCCD एसएम, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). एक कताई डिस्क confocal स्कैनर (CSU-10, Yokogawa, जापान) के लिए confocal छवियों के z-ढेर इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया पर घुड़सवार, 3 कैमरा बंदरगाह उच्च स्थानिक संकल्प के साथ एक सीसीडी कैमरे (पीसीओ एजी, जर्मनी PixelFly, 1392x1024 पिक्सल) दाग सेल की विस्तृत morphological पुनर्निर्माण. एक आवृत्ति दोगुनी डायोड पंप एन डी: YVO4 निरंतर लहर (400 मेगावाट) 532 एनएम (MLL-III/400 मेगावाट, सीएनआई, चान्गचुन, चीन) में लेजर उत्सर्जन उत्तेजना प्रकाश का स्रोत है. 2 मिमी व्यास लेजर बीम एक शटर (LS6, विन्सेन्ट एसोसिएट्स) द्वारा gated एक epifluorescence एकल पोर्ट (फोटोनिक्स GmbH, Grafelfing तक, जर्मनी) संघनित्र के पीछे एपर्चर परिपूर्ण डिजाइन के माध्यम से एक प्रकाश माइक्रोस्कोप युग्मित गाइड को निर्देश दिया है उद्देश्य और वस्तु विमान की रोशनी वर्दी के पास प्रदान करते हैं. लेजर प्रकाश एक पारंपरिक क्सीनन द्वारा मीटर इमेजिंग V के संवेदनशीलता को अधिकतम आर्कलैंप की जगह में किया जाता है: (1) एक एकरंगा पूर्व का उपयोगअवशोषण स्पेक्ट्रम के लाल विंग वी मीटर डाई 9, 10 और (2) स्तर है कि एक आर्कलैंप द्वारा प्राप्त किया जा सकता है परे उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि की संवेदनशीलता को अधिकतम करने पर प्रशस्ति पत्र प्रकाश. उत्तेजना प्रकाश 560 एनएम और दर्ज प्रकाश प्रतिदीप्ति 610 एनएम बाधा फिल्टर (एक RG610 Schott) के माध्यम से पारित किया गया था के एक केंद्रीय तरंग दैर्ध्य के साथ एक dichroic दर्पण द्वारा तैयारी को परिलक्षित किया गया था. रोशनी की तीव्रता में वृद्धि हुई है और निकट इष्टतम एकरंगा उत्तेजना तरंगदैर्य के उपयोग के संयुक्त प्रभाव के बारे में 50 के एक पिछले 6 मापन के लिए तुलना कारक द्वारा एक वोल्टेज इमेजिंग की संवेदनशीलता में नाटकीय सुधार था.
1.2 कदम. वर्दी रोशनी के लिए समायोजित
एक प्रतिदीप्ति स्लाइड मानक (हरी उत्तेजना / लाल उत्सर्जन) का प्रयोग करें. लेजर किरण पथ में उचित तटस्थ घनत्व फिल्टर इतना है कि सीसीडी संतृप्त नहीं है डालें. की सतह पर उद्देश्य फोकसस्लाइड. लेजर लांचर उद्देश्य के सामने में क्वार्ट्ज प्रकाश गाइड प्राप्त करने के अंत की स्थिति को समायोजित करने के लिए, और प्रकाश महामारी प्रतिदीप्ति संघनित्र पर उपयुक्त actuators का उपयोग को प्राप्त करने की खुर्दबीन से जुड़ी गाइड के उत्पादन के अंत की स्थिति को समायोजित केंद्रित है और वर्दी देखने के क्षेत्र की रोशनी.
1.3 कदम. कंपन शोर निर्धारित
प्रतिदीप्ति स्लाइड की सतह पर एक छोटी सी काली स्याही चिह्न रखें. रिकार्ड सतत रिकॉर्डिंग मोड में NeuroCCD साथ प्रकाश तीव्रता. काली स्याही के निशान के एक अंधेरे बढ़त पर उद्देश्य ध्यान दें. रिकार्ड के बारे में 100 2 kHz फ्रेम दर पर मिसे के लिए प्रकाश की तीव्रता. ~ 20 पिक्सल से आंशिक प्रकाश की तीव्रता (/ ΔF एफ) निशान समान रूप से प्रबुद्ध क्षेत्र से प्रकाश और स्याही के निशान की बढ़त के साथ 20 पिक्सल से प्राप्त की स्थानिक औसत प्रदर्शित करें. रिकॉर्डिंग में उच्च विपरीत किनारों के साथ पिक्सल से अधिक शोर में कंपन शोर को दर्शाता हैप्रणाली.
1.4 कदम. कंपन अलगाव
यह प्रकाश प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग शर्तों के बराबर तीव्रता में शॉट शोर के नीचे एक स्तर के लिए एक मेज कंपन अलगाव का उपयोग करके कंपन को कम करने के लिए अनिवार्य है. कंपन अलगाव तालिका समायोजित करें जब तक प्रकाश की तीव्रता में छवि की तेज धार को कवर पिक्सल से कंपन शोर नगण्य है. चलती भागों (यांत्रिक बंद, प्रशंसकों) के साथ उपकरणों की कोई भी मेज पर रखा जा सकता है. अन्य घटक है कि कंपन से अलग नहीं कर रहे हैं संलग्न करने के लिए मेज पर उपकरणों से केबल ढीले तो हो सकता है कि वे यांत्रिक कंपन माइक्रोस्कोप को हस्तांतरित नहीं करना चाहिए.
2. एक उपयुक्त न्यूरॉन मीटर इमेजिंग V के लिए चयन
2.1 कदम. न्यूरॉन्स का चयन
मानक प्रक्रियाओं के अनुसार मस्तिष्क स्लाइसें बनाओ. एक माउस मैं व्यक्तिगत तंत्रिका कोशिकाओं में EGFP व्यक्त लाइन का प्रयोग करेंnterest. एक कताई डिस्क confocal प्रणाली के साथ, टुकड़ा में EGFP लेबल न्यूरॉन्स कल्पना. बरकरार / वृक्ष के समान axonal पेड़ों साथ मीटर इमेजिंग V के लिए न्यूरॉन्स का चयन करें, और समानांतर प्रक्रियाओं और टुकड़ा की सतह के करीब चल रहा है के साथ. इस प्रकार के जंगली चूहों में पूरा नहीं किया जा क्योंकि axons और पतली dendrites, सबसे अधिक भाग के लिए, डीआईसी माइक्रोस्कोपी मोड में दिखाई नहीं कर सकते हैं.
3. वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई के साथ लोड न्यूरॉन्स
3.1 कदम. पैच विंदुक भरना
डाई मुक्त intracellular समाधान के साथ नोक से नकारात्मक दबाव लागू करने के बारे में 15 के लिए इलेक्ट्रोड शंकु के 2/3 से कांच पैच pipettes भरें. टिप में डाई मुक्त समाधान टुकड़ा है जो पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है और नाटकीय रूप से शोर अनुपात करने के लिए संकेत को कम कर देता है पर डाई फैल को रोकने के लिए आवश्यक है. झिल्ली impermeant वोल्टेज संवेदनशील डाई JPW3028 भंग युक्त समाधान के साथ इलेक्ट्रोड वापस भरनेintracellular समाधान में (0.8 मिमी).
Lipophilic styryl रंगों के ANEP श्रृंखला है कि अभी भी पर्याप्त पानी है microinjection के लिए इस्तेमाल किया जा घुलनशील के JPW3028, intracellular आवेदन के लिए सबसे सफल वोल्टेज जांच, एक एनालॉग दोगुना सकारात्मक आरोप लगाया है. di-एथिल इस डाई के अनुरूप व्यावहारिक रूप से समान विशेषताओं (वोल्टेज संवेदनशीलता सहित) और व्यावसायिक रूप JPW1114 (1 टेबल देखें) के रूप में उपलब्ध है. हम आसुत एच 2 ओ में 20 मिमी स्टॉक समाधान तैयार शेयर समाधान के 50 μl aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखा जाता है 0.8 मिमी की अंतिम डाई एकाग्रता के लिए, शेयर समाधान के 2 μl प्रयोग के दिन intracellular समाधान के 50 μl में भंग कर रहा है. शेयर डाई समाधान स्थिर है और कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है. इस प्रकार, हम कमरे के तापमान पर एक 50 μl अशेष भाजक रखना जब तक यह प्रयोग किया जाता है.
3.2 कदम. एक giga मुहर जल्दी से स्थापित
3.3 कदम. धुंधला हो जाना के स्तर की निगरानी
विन्यास पूरे सेल में डाई प्रसार के दौरान, वर्तमान दबाना मोड में कार्रवाई की क्षमता पैदा की रिकॉर्डिंग से न्यूरॉन की शारीरिक स्थिति पर नजर रखने के. इसके अतिरिक्त, सेल सोमा से 2 कश्मीर के एक फ्रेम दर पर आराम प्रकाश की तीव्रता (RLI) रिकॉर्डिंग से धुंधला हो की राशि की निगरानी हर्ट्ज और पूर्ण प्रकाश की तीव्रता का एक अंश तटस्थ घनत्व फिल्टर (हम एक 400 मेगावाट लेजर से लेजर प्रकाश की तीव्रता का 0.04% का उपयोग) के साथ समायोजित. डाई लोड करने की प्रक्रिया जारी है जब तक कार्रवाई संभावित 20-40 मिनट के बाद आम तौर पर व्यापक, इलेक्ट्रोड आकार और प्रतिरोध के आधार पर शुरू होता है.
कील का विस्तार पूरी तरह से प्रतिवर्ती और सबसे दैहिक झिल्ली में डाई के संतृप्त एकाग्रता का capacitive लोड प्रभाव के कारण होने की संभावना है. स्पाइक के तरंग पूरी तरह से बाद डाई एकाग्रता न्यूरॉन भर equilibrated है बहाल है.
3.4 कदम. डाई इलेक्ट्रोड निकालें
धुंधला अवधि के अंत में, ध्यान से पैच विंदुक दूर वोल्टेज क्लैंप विन्यास में यह सुनिश्चित करना है कि पूरे सेल से बाहर बाहर पैच विन्यास के लिए संक्रमण की प्रक्रिया में उपलब्ध हो जाता है सोमा से खींच.
3.5 कदम. डाई प्रसार के लिए इंतजार
ent "> वोल्टेज के प्रति संवेदनशील neuronal प्रक्रियाओं में फैल डाई के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 1.5-2 घंटे के लिए सेते टुकड़ा. दूर डाई diffuses का एक महत्वपूर्ण वृक्ष के समान और axonal प्रक्रियाओं की तरंग में सोमा से राशि के बाद एपी पूरी तरह से बहाल किया है.4. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग
4.1 कदम. इमेजिंग के लिए एक सेलुलर डिब्बे का चयन करें
कम प्रकाश के स्तर प्रतिदीप्ति और एक मानक (नहीं डाई) के तहत डीआईसी पैच इलेक्ट्रोड के साथ फिर से पैच न्यूरॉन के तहत दाग न्यूरॉन सोमा पता लगाएँ. Neuronal प्रक्रियाओं कल्पना वोल्टेज इमेजिंग के लिए सीसीडी के सतत रिकॉर्डिंग मोड में 10-40 हर्ट्ज की एक फ्रेम दर पर कम रोशनी के स्तर के नीचे. ब्याज की वस्तु कल्पना करने के लिए आवश्यक न्यूनतम करने के लिए तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ प्रकाश के स्तर को कम. हम दाग न्यूरॉन की स्थिति के दौरान 400 मेगावाट लेजर तीव्रता के 0.01% का उपयोग करें. एक XY मंच का उपयोग, टी में ब्याज की neuronal प्रक्रिया की स्थितिवह इमेजिंग क्षेत्र के बीच है. उत्तेजना प्रकाश माइक्रोस्कोप के आंशिक रूप से बंद कर दिया क्षेत्र बंद परितारिका का उपयोग कर से सोम की रक्षा. उच्च तीव्रता उत्तेजना प्रकाश से सोमा को बचाने में काफी रिकॉर्डिंग के दौरान photodynamic नुकसान कम हो जाएगा.
4.2 रिकार्ड ऑप्टिकल झिल्ली संभावित यात्रियों से संबंधित संकेतों कदम
ऑप्टिकल व्यक्तिगत वृक्ष के समान शाखाओं में backpropagated APs संबंधित संकेतों रिकार्ड. ऑप्टिकल अक्षतंतु में APs से संबंधित संकेतों रिकार्ड. ऑप्टिकल वृक्ष के समान spines में APs backpropagating से संबंधित संकेतों रिकार्ड. फ्रेम संकेत तरंग का सटीक पुनर्निर्माण के लिए उचित दरों का प्रयोग करें और विरंजन डाई और photodynamic क्षति को कम करने के लिए रिकॉर्डिंग समय और उच्च तीव्रता उत्तेजना प्रकाश के लिए जोखिम के रूप में संभव के रूप में कम रखने के लिए. उदाहरण के लिए, अक्षतंतु में दीक्षा और एकल कार्रवाई की क्षमता के प्रसार के क्रम की जांच 5-10 मिसे के रिकॉर्डिंग अवधि की आवश्यकता है. उत्तेजना प्रकाश intensity रिकॉर्डिंग के दौरान एक हाथ पर संकेत करने वाली शोर अनुपात और डाई की डिग्री विरंजन और दूसरे हाथ पर photodynamic क्षति के बीच एक समझौता है. हम 400 मेगावाट लेजर रिकॉर्डिंग में जब व्यास में 300 मीटर के एक क्षेत्र है प्रबुद्ध axons की लंबी वर्गों से की तीव्रता के 100% का उपयोग करें. जब उत्तेजना प्रकाश वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग के लिए एक 30 सुक्ष्ममापी व्यास क्षेत्र के लिए ध्यान केंद्रित किया है, हम लेजर प्रकाश की तीव्रता का 10-25% का उपयोग करें. रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक अवधि इष्टतम उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, कम रिकॉर्डिंग समय उच्च प्रकाश तीव्रता अनुमति देते हैं. इष्टतम रोशनी की तीव्रता प्रत्येक तैयारी और माप सेटिंग्स के लिए सबसे अच्छा है empirically निर्धारित की.
5. डेटा विश्लेषण
5.1 कदम. ज्ञात त्रुटियों के लिए कच्चे डेटा सही
और आंकड़ों के विश्लेषण के प्रदर्शन किए गए NeuroPlex (RedShirtImaging) कार्यक्रम आईडीएल (ITT दृश्य सूचना Solut में लिखा का उपयोगआयनों, बोल्डर, कोलोराडो) और कस्टम Visual Basic दिनचर्या. कम प्रकाश के स्तर की शर्तों के तहत, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत / ΔF एफ आकार का एक महत्वपूर्ण निर्धारक हो जाता है. कच्चे डेटा 1 टुकड़ा पर एक अस्थिर क्षेत्र से निर्धारित औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता subtracting द्वारा इस आशय के लिए सही है. बाद में, संकेत संरेखण सॉफ्टवेयर एपी दीक्षा में अस्थायी घबराना के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औसत दौरान संभव छोटे तैयारी के आंदोलनों के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अस्थायी डोमेन में, एपी संकेत संदर्भ औसत की शुरुआत (चित्रा 1 बी) में अधिग्रहण संकेत प्रत्येक परीक्षण में विद्युत दर्ज APs के पार सहसंबंध से गठबंधन किया गया. स्थानिक डोमेन में, छवियों में दो आयाम ऑफ़लाइन पार सहसंबंध छवि से गठबंधन किया गया संभव तैयारी के छोटे पार्श्व आंदोलनों के लिए क्षतिपूर्ति. z आयाम में छवि का सही ध्यान प्रत्येक व्यक्ति के परीक्षण से पहले सत्यापित किया गया था, smal एल समायोजन अक्सर आवश्यक थे. चित्रा 1B में spatially और अस्थायी गठबंधन संकेतों के रूप में दिखाया औसत थे. प्रकाश तीव्रता में डाई विरंजन के कारण धीमी गति से परिवर्तन एक उपयुक्त दोहरी घातीय समारोह द्वारा कोई उत्तेजना (चित्रा 1 बी) के साथ रिकॉर्डिंग परीक्षणों से प्राप्त डेटा को विभाजित करके सही थे. एपी संकेत के तरंग डेटा घन तख़्ता प्रक्षेप, एक piecewise निरंतर प्रत्येक डेटा बिंदु के माध्यम से गुजर वक्र का उपयोग अंक का एक सेट से पुनर्निर्मित किया गया. पुष्टि करते हैं कि वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई संकेत millisecond समय के पैमाने पर महत्वपूर्ण विरूपण के बिना झिल्ली क्षमता पटरियों, सोमा से बिजली एपी संकेत आसन्न अक्षतंतु पहाड़ी से ऑप्टिकल एपी संकेत के रूप में चित्रा 3B में दिखाया की तुलना में किया गया था. दो संकेतों को बहुत बारीकी से मिलाना, ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग में शॉट शोर के लिए अनुमति देता है.
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चित्रा 1. डेटा विश्लेषण (एनिमेशन). (ए) ऊपरी पैनल: रिकॉर्डिंग स्थिति में अक्षतंतु साथ एक दाग न्यूरॉन के उच्च संकल्प confocal छवि. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सोमा और कोशिकी उत्तेजक बेसल dendrite schematically दिखाया अगले इलेक्ट्रोड संलग्न है. ऐक्शन पोटेंशिअल कोशिकी, synaptic उत्तेजना के द्वारा पैदा की हैं. लोअर पैनल: कम वी मीटर इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है (बी) से सोम (काला निशान) इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग, AIS (लाल निशान) से ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग, और Ranvier के नोड (हरी निशान) से सीसीडी द्वारा प्राप्त अक्षतंतु के स्थानिक संकल्प प्रतिदीप्ति छवि . शीर्ष निशान: 9 एपी दीक्षा में अस्थायी घबराना दिखा परीक्षणों से कच्चे डेटा. निशान की दूसरी पंक्ति: अस्थायी संकेतों गठबंधन. निशान की तीसरी पंक्ति: औसत संकेत. निशान की चौथी पंक्ति: ब्लीच सुधार. अस्थायी चौरसाई के एक पास के साथ घन तख़्ता प्रक्षेप: नीचे निशान.
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Representative Results
सफल confocal माइक्रोस्कोपी जो टुकड़ा की सतह के करीब हैं और ध्यान के एक विमान में स्थित बरकरार neuronal प्रक्रियाओं की स्पष्ट पहचान की अनुमति चाहिए. तंत्रिका कोशिकाओं जो वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई लोड करने के लिए पहले वोल्टेज इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं का चयन महत्वपूर्ण है. L5 पिरामिड EGFP एक cortical टुकड़ा (Crym ट्रांसजेनिक माउस लाइन) में न्यूरॉन्स व्यक्त की confocal छवियों का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के axons स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. टुकड़ा की सतह के करीब ध्यान के एक विमान में बरकरार axons (सफेद तीर) के साथ कोशिकाओं के चयन किया गया था.
चित्रा 2 axons से L5 cortical एपी संकेतों के मीटर इमेजिंग वी के लिए न्यूरॉन्स का चयन. एक ही टुकड़ा क्षेत्र के कम (बाएं) और उच्च (दाएं) बढ़ाई छवियों, 488 एनएम उत्तेजना Yokogawa का उपयोगकताई डिस्क स्कैनर.
अक्षतंतु प्रारंभिक खंड में ना चैनल क्लस्टरिंग के स्थानिक पैटर्न (एआईएस) neuronal संगणना और ना चैनल के वितरण में परिवर्तन ट्यूनिंग अक्षतंतु में neuronal plasticity के उपन्यास रूपों मध्यस्थता दिखाया गया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हालांकि, चैनल वितरण पर immunocytochemical डेटा सीधे कार्रवाई संभावित दीक्षा के spatiotemporal विशेषताओं की भविष्यवाणी नहीं, हो सकता है और पहले electrophysiological उपाय या तो अप्रत्यक्ष कर रहे हैं (कोशिकी) या पर्याप्त स्थानिक (intracellular) संकल्प सीधे स्पाइक ट्रिगर क्षेत्र (TZ) विशेषताएँ की कमी है. झिल्ली संभावित इमेजिंग तकनीक यहाँ वर्णित की संवेदनशीलता में एक महत्वपूर्ण methodological सुधार और कील TZ के रूप में कार्यात्मक संदर्भ में परिभाषित के स्थान लंबाई के प्रत्यक्ष निर्धारण की अनुमति देता है. उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प में एपी संकेत रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण चित्रा 3 में दिखाया गया है चित्रा 3B कि दिखाता है.उपलब्ध मीटर इमेजिंग V के संवेदनशीलता subthreshold पुनर्योजी एपी संकेत पूर्ववर्ती विध्रुवण की सही निगरानी के लिए पर्याप्त था. इसके अतिरिक्त, सोम / अक्षतंतु गिरिका से और Ranvier का एक अधिक डिस्टल नोड से ऑप्टिकल एपी संकेतों की तुलना पुष्टि की है कि APs इन दो 8 स्थानों, 15 में स्पष्ट रूप से अलग गतिशीलता है, दोनों शिरोरेखा और एपी के downstroke में तेजी से गया था Ranvier के नोड. 3 आंकड़े लिए कील TZ के आकार और स्थिति के मापन में spatiotemporal संकल्प सीमा के बारे में विवरण और Popovic में एट अल. 5 (2011) देखें.
चित्रा 3 अक्षतंतु से कार्रवाई संभावित संकेतों. (ए) ऊपरी पैनल: एक L5 cortical रिकॉर्डिंग स्थिति में अक्षतंतु साथ वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई के साथ लोड न्यूरॉन के उच्च संकल्प confocal छवि, प्रक्षेपण frओम confocal छवियों के z-ढेर. रिकॉर्डिंग / पैच सोम संलग्न करने के लिए इलेक्ट्रोड उत्तेजक. निचले पैनल: कम सीसीडी द्वारा प्राप्त अक्षतंतु मीटर इमेजिंग V के लिए इस्तेमाल की स्थानिक संकल्प प्रतिदीप्ति छवि. (बी) एपी संबंधित संकेतों 10 kHz के एक फ्रेम दर पर दर्ज की गई है. सही पर निशान: तीन स्थानों से यात्रियों एपी: सोम से 1-इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग, अक्षतंतु गिरिका से 2 ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग, Ranvier की 1 नोड से 3 ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग. नीचे निशान: ही तीन स्थानों से संकेत आरोपित.
गैर रेखीय उत्तेजक postsynaptic (EPSPs) dendrites जो LTP के शामिल होने के लिए जिम्मेदार है में और क्षमता bAPs के बीच बातचीत पूरी तरह से नहीं समझा गया है. यह बातचीत दोनों संकेतों के आयाम पर निर्भर करता है और इसलिए, spatially nonuniform. इस भविष्यवाणी के प्रायोगिक परीक्षण spatially अच्छी तरह से हल माप है कि बाहर नहीं किया है की आवश्यकता है क्योंकि छोटे व्यास के वृक्ष के समान शाखाओं नहीं कर रहे हैंइलेक्ट्रोड माप ccessible. झिल्ली संभावित इमेजिंग तकनीक यहाँ वर्णित पूरे वृक्ष के समान कुंज में कई स्थानों से बिजली के सिगनल की निगरानी की अनुमति देता है के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है. वृक्ष के समान कुंज में BAP गतिविधि के पैटर्न सोडियम समीपस्थ क्षेत्रों में वर्तमान प्रभुत्व spikes जो धीरे - धीरे लंबे समय तक वर्तमान कैल्शियम बदल डिस्टल dendrites में depolarizing घटनाओं का प्रभुत्व है के द्वारा होती है.
चित्रा 4 एक L5 cortical न्यूरॉन के वृक्ष के समान कुंज पर कई स्थानों से कार्रवाई संभावित संकेतों. वाम पैनल: एक वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई के साथ भरी हुई एक L5 cortical न्यूरॉन के उच्च संकल्प छवि, confocal छवियों के z-ढेर से प्रक्षेपण. सही पैनल: 4 100 हर्ट्ज पर कम depolarizing वर्तमान (नीचे ट्रेस) दालों सोमा करने के लिए दिया द्वारा शुरू एपी के एक फट. एक Backpropagatingction शिखर और परोक्ष dendrites साथ छह चयनित स्थानों (1-6) से संभावित संकेत है. 1 से 3 निशान एक एकल परीक्षण रिकॉर्डिंग से प्राप्त किया गया. 4 ट्रेस एक चार परीक्षण औसत है, जबकि 5 और 6 निशान सोलह परीक्षण औसत हैं.
परिकल्पना है कि कांटा synaptic प्रभावकारिता को संशोधित कि plasticity और संभवतः सीखने और स्मृति तंत्र underlies हाल ही में मस्तिष्क समारोह के लिए इसके गंभीर निहितार्थ (Yuste, 2010) की वजह से काफी ध्यान दिया है एक बिजली भूमिका है. वहाँ है, तथापि, बहुत कम के पक्ष में या इस परिकल्पना के खिलाफ सीधे प्रयोगात्मक सबूत है. अप्रत्यक्ष परिणामों की व्याख्या और वृक्ष के समान spines के बिजली के व्यवहार के बारे में प्रत्यक्ष सबूत के अभाव में अनिश्चितताओं मुख्य रूप से एक methodological सीमा की वजह से कर रहे हैं - कांटा छोटे और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के पारंपरिक तरीकों के लिए सुलभ नहीं हैं. इस प्रकार, प्रयोगात्मक पर भरोसा है डेटा के अभाव में इस सवाल की जांच करने का प्रयासबिजली के मानकों के अनुमान के साथ कंप्यूटर सिमुलेशन रीढ़ morphology और रीढ़ गर्दन के diffusional गुणों पर आधारित है. वोल्टेज इमेजिंग दृष्टिकोण यहाँ वर्णित यह उच्च संवेदनशीलता के साथ अलग - अलग वृक्ष के समान spines के स्थानिक पैमाने पर कार्रवाई संभावित संकेतों और synaptic संभावित संकेतों की निगरानी करने के लिए संभव बनाता है. प्रयोगों अब सीधे वृक्ष के समान spines के बिजली के व्यवहार के बारे में मौलिक सैद्धांतिक भविष्यवाणियों का परीक्षण करने के लिए तैयार किया जा सकता है. ऑप्टिकल एक व्यक्ति के वृक्ष के समान रीढ़ और अपने माता पिता के dendrite backpropagating APs से संबंधित संकेतों के एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है.
5 चित्रा एक व्यक्ति के वृक्ष के समान रीढ़ से कार्रवाई संभावित संकेतों. वाम पैनल: ऊपरी micrographs - कताई डिस्क confocal छवियों के एक ढेर से प्राप्त संरचनात्मक पुनर्निर्माण. लोअर micrographs - flमीटर इमेजिंग V के लिए सीसीडी कैमरा के साथ ही क्षेत्र के uorescence छवियों प्राप्त की. सही पैनल: प्रतिदीप्ति तीव्रता 1-3 सीसीडी छवियों पर उल्लिखित स्थानों से BAP करने के लिए इसी निशान. 9 परीक्षणों के टेम्पोरल औसत. नीचे ट्रेस: सोम से इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग. ध्यान दें कि एक रीढ़ की हड्डी के बिना एक क्षेत्र से 3 ट्रेस नहीं detectible टुकड़ा के सतही परत में प्रकाश बिखरने का निम्न स्तर का संकेत संकेत है.
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Discussion
इस अनुच्छेद के उप सुक्ष्ममापी और उप millisecond spatiotemporal संकल्प के साथ व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की विद्युत गतिविधि की निगरानी के लिए एक डाई वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रिकॉर्डिंग विधि का वर्णन करता है. निकट इष्टतम तरंगदैर्ध्य (आकार के बारे में संकेत) में लेजर उत्तेजना ~ दृष्टिकोण पिछले 50 का एक पहलू से रिकॉर्डिंग की संवेदनशीलता में सुधार. वर्तमान संवेदनशीलता dendrites, axons, अक्षतंतु collaterals और अक्षतंतु टर्मिनलों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत वृक्ष के समान spines सहित व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के सभी भागों से विद्युत संकेतों की निगरानी के लिए सक्षम बनाता है. वर्तमान संवेदनशीलता के साथ, झिल्ली क्षमता यात्रियों की रिकॉर्डिंग 20 kHz की फ्रेम दर पर बाहर किया जा सकता है. मामूली संकेत औसत (4-25 परीक्षण) आसानी से 2-5 का एक कारक द्वारा संकेत करने वाली शोर अनुपात के रूप में व्यक्त रिकॉर्डिंग की संवेदनशीलता में सुधार कर सकते हैं. वोल्टेज इमेजिंग की प्रमुख सीमा एक निरपेक्ष वोल्टेज पैमाने पर कई स्थानों से ऑप्टिकल संकेतों के सरल अंशांकन की कमी है. कुछ तैयारी मेंएस यह एक झिल्ली संभावित संकेत है कि सभी स्थानों पर एक ज्ञात आयाम खोजने के द्वारा हल किया जा सकता है. अक्षतंतु में और कुछ पूरी तरह से उत्तेजनीय 6 dendrites में एपी संकेतों एक उत्कृष्ट अंशांकन मानक प्रदान करते हैं.
इस पद्धति के आवेदन में महत्वपूर्ण कदम हैं:
- तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें (<30 सुक्ष्ममापी) की सतह के निकट स्थित न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग सीमित द्वारा प्रकाश बिखरने प्रभाव को कम से कम. यह टुकड़ा करने की प्रक्रिया का अनुकूलन 1 टुकड़ा की ऊपरी परत में स्वस्थ न्यूरॉन्स के एक उच्च प्रतिशत प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
- डाई देने के न्यूरॉन्स की जल्दी लोड बीमा के लिए इलेक्ट्रोड की नोक में स्पष्ट समाधान की राशि का अनुकूलन.
- तैयारी है जो ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग में अतिरिक्त शोर का एक स्रोत हो सकता है के यांत्रिक कंपन को खत्म करने.
- रोजगार कम शोर आयाम के RMS शोर के साथ निरंतर तरंग (CW) पराबैंगनीकिरण <पूर्व के एक स्रोत के रूप में 0.5%प्रशस्ति पत्र प्रकाश.
- उपयुक्त उत्तेजना प्रकाश रिकॉर्डिंग अवधि की अवधि के लिए रिश्तेदार तीव्रता का चयन करके और अंधेरे अवधि के द्वारा लगातार रिकॉर्डिंग को अलग करके photodynamic क्षति नियंत्रण. अब रिकॉर्डिंग अवधि कम प्रकाश तीव्रता की आवश्यकता photodynamic नुकसान को रोकने के.
रिकॉर्डिंग ऊपर दिखाए गए उदाहरण रीढ़ और अक्षतंतु शरीर क्रिया विज्ञान में एक महत्वपूर्ण मोड़ का संकेत मिलता है. इन रिकॉर्डिंग को सीधे बिजली के जो केवल अतीत में सैद्धांतिक आधार पर विश्लेषण किया जा सकता है घटनाओं को रिकॉर्ड करने में सक्षम होने की उल्लेखनीय शक्ति प्रकट करते हैं.
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Disclosures
Dejan Zecevic वाणी कि वह LLC RedShirtImaging के सह मालिक, एक उच्च गति, कम शोर वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई रिकॉर्डिंग में इस्तेमाल सीसीडी कैमरों में विशेष कंपनी है. अन्य सभी लेखकों कोई वित्तीय हितों या ब्याज के संभावित संघर्ष वर्तमान अध्ययन से संबंधित रिपोर्ट.
Acknowledgments
हम हमारे Knut Holthoff, आर्थर Konnerth और मार्को Canepari जो कृपया रंजक प्रदान करने के लिए इस तकनीक का प्रारंभिक विकास में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भाग लिया Leslie एम. Loew सहयोगियों के लिए आभारी हैं. NSF IOS 0817969 अनुदान, NIH NS068407 और M136043 अनुदान द्वारा और Kavli येल विश्वविद्यालय में तंत्रिका विज्ञान के लिए संस्थान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M.
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
