Summary
Klinisch relevante diermodellen van intracerebrale bloeding (ICH) zijn nodig om onze kennis van hemorragische beroerte te breiden en nieuwe therapeutische strategieën te onderzoeken. In deze studie beschrijven we twee ICH en beoordelen modellen die eenzijdig injecties van ofwel autoloog volbloed of bacteriële collagenase implementeren in de basale ganglia (corpus striatum) van muizen.
Abstract
Spontane intracerebrale bloeding (ICH) definieert een potentieel levensbedreigende neurologische ziekte die goed is voor 10-15% van alle CVA-gerelateerde ziekenhuisopnamen en waarvoor geen effectieve behandelingen beschikbaar zijn voor 1,2-date. Vanwege de heterogeniteit van ICH bij de mens, zijn verschillende preklinische modellen die nodig zijn om grondig te verkennen potentiële therapeutische strategieën 3. Experimental ICH wordt vaak geïnduceerd in knaagdieren door intraparenchymale injectie van ofwel autoloog bloed of bacteriële collagenase 4. De geschikte model is gekozen gebaseerd op de pathofysiologie van bloeding inductie en progressie schade. Het bloed injectie model bootst een snel voortschrijdende bloeding. U kunt ook bacteriële collagenase enzymatisch verstoort de basale lamina van de hersenen haarvaten, waardoor een actieve bloeding die in het algemeen evolueert gedurende enkele uren 5. Resulterende perihematomal oedeem en neuro-tekorten kunnen weer worden gekwantificeerdm beide modellen. In deze studie beschrijven we een gemodificeerde en geëvalueerd dubbele injectie model van autoloog volbloed 6 als een ICH injectie model van bacteriële collagenase 7, die beide gericht zijn op de basale ganglia (corpus striatum) van mannelijke CD-1 muizen. We neuro-tekorten en hersenoedeem na 24 en 72 uur vastgesteld na ICH inductie. Intrastriatal injectie van autoloog bloed (30 pl) of bacteriële collagenase (0.075U) veroorzaakt reproduceerbaar neuro tekorten in muizen aanzienlijk verhoogd hersenoedeem na 24 en 72 uur na de operatie (p <0,05). Kortom, beide modellen leveren consistente hemorrhagische infarcten en vertegenwoordigen basismethoden voor preklinisch ICH onderzoek.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite op Loma Linda University.
1. Pre-operatieve voorbereidingen
Aseptische technieken worden aanbevolen voor alle chirurgische ingrepen. Desinfecteer de stereotactische apparaat en alvorens te bereiden steriele chirurgische instrumenten aan de operatie. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) tijdens alle handling van dieren. Gebruik een verwarmingselement tijdens een operatie om het dier fysiologische lichaamstemperatuur.
- Weeg de 8-12 weken oude muis met behulp van een triple beam dier schaal.
- Co-injectie ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) intraperitoneaal laat vervolgens 7-10 min voor de anesthesie te voeren (monitor voor een voldoende sedatie).
- Plaats de muis op een thermische deken en scheren van de hoofdhuid.
- Breng oogzalf aan beide ogen.
- Zet deluchtwegen, door zachtjes bewegen van de tong lateraal, en zorgvuldig de muis het hoofd vast op de stereotactische apparaat. Opmerking: De kop horizontaal bevestigd aan de basis van het stereotactische frame.
- Desinfecteren chirurgische met Betadine en spoel met 70% ethanol. Herhaal afwisselende toepassingen van Betadine en 70% ethanol voor een totaal van drie keer. Wattenstaafje applicators kunnen worden gebruikt voor dit doel.
2. Bloed Injectiespuit Model
- Maak een 1 cm lange middellijn incisie van de hoofdhuid met een # 10 scalpel.
- Gebruik wattenstaafje applicators het opruimen van zacht weefsel dat de schedel, om de loodrechte snijpunt van de coronale en sagittale hechting (bregma) blootstellen.
- Monteer de Hamilton spuit (250 ul) op de injectiepomp, en stereotaxically Richt de naald (26 Gauge) over bregma.
- Stel vervolgens de stereotactische manipulator armen om de naald 0,2 mm positioneren anterior en 2mm lateraal naar rechts. Op deze coördinaten een kleine schedelinhoud boorgat met behulp van een variabele snelheid boormachine met een 1 mm boor.
- Hang het dier staart en desinfecteren zijn onderoppervlak met 70% ethanol.
- Prik het centrale staart ader met een steriele naald (bijv. 26 Gauge) en verzamel het arteriële bloed in een unheparinized capillair.
- Snel overbrengen van het bloed uit de capillaire buis in de glazen cilinder van de spuit Hamilton, plaats vervolgens de zuiger.
- Bevestig de nu 30 ul of meer van arterieel bloed met Hamilton spuit op de injectiepomp en steek de naald (met de schuine kant naar de pijlnaad) door het boorgat enkel tot haar bevel niet meer zichtbaar is.
- Vanaf dit punt vooraf de naald 3 mm ventraal en injecteer 5 pi van autoloog bloed bij een snelheid van 2 ul / min.
- Na voltooiing van de eerste injectie vooraf naald 0,7 mm verdere verdieping.
- Wacht5 min dan injecteren 25 pi van bloed in de juiste striatum.
- Na voltooiing van de tweede injectie, laat de naald in positie additionele 10 min, voor het trekken met een snelheid van 1 mm / min.
- Dicht het boorgat met been was en hechten van de huid.
- Voor postoperatieve analgesie subcutaan injecteren 0,05 mg / kg buprenorfine in voorverwarmde vloeistoffen (fysiologische zoutoplossing).
3. Collagenase injectiemodel
- Naar aanleiding van de pre-operatieve voorbereiding, herhaalt u stappen 1-4 zoals beschreven voor het bloed injectie model.
- Vul de Hamilton spuit (10 pl) met 0.075U van bacteriële (clostridium) collagenase VII-S opgelost in 0,5 pi zoutoplossing. Vermijd de vorming van luchtbellen.
- Bevestig de Hamilton spuit op de injectiepomp en steek de naald (26 Gauge), door het boorgat enkel tot haar bevel niet meer zichtbaar is.
- Ventraal voer de naald 3,7 mm en injecteer de 0.075U van collagenase into rechts striatum met een snelheid van 2 ul / min.
- Na voltooiing van de injectie het naald in positie additionele 10 min, voor het trekken met een snelheid van 1 mm / min.
- Dicht het boorgat met been was en hechten van de huid.
- Injecteer 0,05 mg / kg subcutaan buprenorfine in voorverwarmde postoperatieve vloeistoffen.
4. Schijnoperatiegroep
- Naar aanleiding van de pre-operatieve voorbereiding, herhaalt u stappen 1-4 zoals beschreven voor het bloed injectie model.
- Ventraal Steek de naald (26 Gauge) 3,7 mm door het boorgat. De naald moet blijven liggen gedurende 10 minuten voordat ze onttrokken met een snelheid van 1 mm / min.
- Dicht het boorgat met been was en hechten van de huid.
- Injecteer 0,05 mg / kg subcutaan buprenorfine in voorverwarmde postoperatieve vloeistoffen.
5. Representatieve resultaten
Experimentele intrastriatal bloeding oproept morfologische alsalsmede gedragsveranderingen bij knaagdieren. Deze veranderingen kunnen worden geëvalueerd om een goede uitvoering van de procedure te waarborgen of de effecten van mogelijke behandelingen onderzoeken. Het genereren van de bloeding in een gerichte hersengebied (bijv. basale ganglia) is het meest essentieel is voor een reproduceerbare aanpak, en kan nagegaan worden op bruto-of histologisch gekleurde hersenen secties (Figuur 1-2). Schade aan de basale ganglia resultaten in senso-motorische, die kan worden gekwantificeerd via verschillende gedragsstoornissen assessments. Resultaten van de bocht toonde aan dat na experimentele rechtszijdige ICH, muizen bleken significant vaker ipsilateraal en weg van de verminderde contralaterale (links), dan sham dieren uitgevoerd op 24 en 72 uur na de operatie (figuur 3 A). Bovendien de mogelijkheid om adequaat de verminderde (links) voorpoot op een oppervlak na vibrissae stimulatie geëvalueerd via de voorpoot te plaatsen test. 24 en 72 uur na de operatie, muizen subworpen aan rechts-zijdige ICH toonde significant minder plaatsingen dan sham geopereerde dieren. Meting van hersenoedeem wordt veelvuldig toegepast om de omvang van hersenletsel na experimentele ICH kwantificeren. Intracerebrale injectie van autoloog bloed (30 pl) of bacteriële collagenase (0,075 U) leidde tot een aanzienlijke toename van de hersenen watergehalte in de ipsilaterale cortex en basale ganglia bij 24 (figuur 4 A) en 72 uur (figuur 4 B) na de operatie ( in vergelijking met sham). Het resultaat van de gedragstesten (figuur 3) en de mate van hersenoedeem (figuur 4) toonde geen verschil tussen het bloed en collagenase injectie modellen bij gegeven volumes.
Figuur 1. Modeling ICH in muizen. (A) Het vereenvoudigde schema van een coronale doorsnede hersenen 0,2 mm anterior van bregma illustreert de proposed locatie van autoloog bloed of collagenase injectie. Het laterale ventrikel is gemarkeerd LV. CPU staat voor caudaat putamen-, een deel van het striatum en GP identificeert de globus pallidus. Zowel het striatum en de globus pallidus behoren tot een groep van sub-corticale kernen, ook bekend als basale ganglia. (B) Vertegenwoordiger microfoto van een coronale hersenen sectie 0.2mm anterior van bregma, verkregen bij 24 uur na intrastriatal injectie van autoloog volbloed.
Figuur 2. Histologische manifestatie van het hematoom. Representatieve hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd coronale cryosection (10 urn) van een muizenhersenen illustreert hematoom grootte op 24 uur na injectie van intrastriatal bacteriële collagenase (0,075 U). LH = linker hersenhelft, RH = rechter hersenhelft.
< img alt = "Figuur 3" src = "/ files/ftp_upload/4289/4289fig3.jpg" />
Figuur 3. Neuro na experimentele evaluaties ICH in muizen. Intrastriatal injectie van autoloog bloed (30 pl) of bacteriële collagenase (0,075 U) veroorzaakt reproduceerbaar neuro tekorten. (A) Muizen na experimentele ICH aanzienlijk meer rechtse bochten dan sham geopereerde dieren toonde op 24 en 72 uur na de operatie. (B) voorpoot plaatsen capaciteit van de linker ledematen werd verminderd na ICH op 24 en 72 uur na de operatie. Waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd met een Kruskal-Wallis variantieanalyse op Ranks, gevolgd door de Student-Newman-Keuls methode. AP waarde van <0,05 werd beschouwd als statistisch significant, n = 6-12 per groep, * P <0,05 in vergelijking met sham. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
igure 4 "src =" / files/ftp_upload/4289/4289fig4.jpg "/>
Figuur 4. Evaluatie van hersenen watergehalte na experimentele ICH in muizen. Intracerebrale injectie van autoloog bloed (30 pl) of bacteriële collagenase (0,075 U) tot een duidelijke stijging van de hersenen watergehalte in de ipsilaterale cortex en basale ganglia bij 24 (A) en 72 uur (B) na ICH-inductie. Waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd met One Way Analysis of Variance, gevolgd door Tukey post hoc test. AP waarde van <0,05 werd beschouwd als statistisch significant, n = 6-10 per groep, * P <0,05 in vergelijking met sham. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diermodellen van intracerebrale bloeding (ICH) dragen sterk bij aan een gevorderd begrip van de pathofysiologie van de ziekte, en worden vaak gebruikt voor het ontwikkelen en evalueren van nieuwe therapeutische strategieën in een preklinische setting. Intraparenchymateuze injecties van autoloog bloed of bacteriële collagenase zijn reeds lang gevestigde methoden om ICH bij knaagdieren te genereren. Beide methoden werden oorspronkelijk ontwikkeld in de rat, maar door de snel toenemende beschikbaarheid van transgene en knockout stammen muizen onmisbaar werd het verder verduidelijken mechanismen van hemorragische hersenletsel 8.
Bij de mens, basale ganglia bloeding goed is voor ongeveer 50% van alle hemorragische beroertes, en patiënten overleven van de initiële gebeurtenis ontwikkelen vaak schadelijke neuro-tekorten 1. Dienovereenkomstig, experimentele ICH bij knaagdieren, waarbij de basale ganglia, roept senso-motorische problemen in contralaterale van het dier extremiteiten. Naardate zijn verschillende gedrag assessments ontwikkeld die beperkingen karakteriseren in muizen en ratten 9,10.
In deze studie beschrijven we een gemodificeerde en geëvalueerd dubbele injectie model van autoloog volbloed 6 als een ICH injectie model van bacteriële collagenase 7, beide gericht op de basale ganglia (corpus striatum) in muizen. We evalueerden afwijkend gedrag via de hoek draai-en voorpoot het plaatsen van testen 9,11 en waargenomen verhoogde sensorimotorische stoornissen in beide modellen bij 24 en 72 uur na de operatie (figuur 3). Op deze tijdstippen werden geen significante verschillen gevonden tussen de ICH groepen, maar eerdere studies suggereerden een langdurige blessure progressie na collagenase injectie, waardoor het een meer geschikte model voor de lange termijn uitkomst studies 5. Hersenoedeem (brain watergehalte) werd gemeten met de methode wet-weight/dry-weight zoals eerder gerapporteerd 12,13.Onze resultaten toonden een significante toename in perihematomal hersenoedeem na 24 en 72 uur na inductie ICH (figuur 4). Alle muizen blootgesteld aan experimentele ICH of sham-operatie overleefde tot dag van het offer (sterfte = 0%).
De twee beschreven ICH-modellen maken gebruik van een stereotactisch-geassisteerde chirurgie om nauwkeurige en reproduceerbare injecties van bloed of collagenase in de beoogde hersenen gebied te waarborgen. Een kleine craniotomie (1 mm boorgat) nodig voor dit doel. Het is essentieel om perforatie van de dura voorkomen dat de boor, aangezien deze onnauwkeurigheid zou resulteren in schade en terugstroom van bloed of collagenase verergeren tijdens de injectie.
In eerste instantie werd het bloed injectie model ontwikkeld als een enkele intracerebrale injectie 14, maar zij vaak leidt tot inconsistente resultaten als gevolg van terugstroom van bloed langs de naald-darmkanaal 15. Om deze complicatie te minimaliseren, werd een dubbele injectie methode ontwikkeld, Waarin een kleine hoeveelheid bloed wordt geïnjecteerd recht boven de beoogde hersengebied, gevolgd door een tweede injectie van bloed in de basale ganglia 6. Gestold bloed van de eerste injectie voorkomt terugstroming langs de naald darmkanaal. Dit model imiteert een zich snel ontwikkelende hematoom, maar geeft geen inductie van de feitelijke breuk van cerebrale bloedvaten. Een groot voordeel van de autoloog bloed injectie model is dat er geen storende factoren, zoals exogene eiwitten, worden gebruikt om ICH induceren. Alternatief de bacteriële collagenase model bootst een spontane intracerebrale bloeding die ontstaat gedurende verscheidene uren, zoals getoond in ongeveer 30% van alle patiënten ICH 5. Bacteriële collagenase is een protease dat de extracellulaire matrix in de cerebrale capillairen lyseert en verzwakt deze, waardoor vaartuig scheuren en daaruit bloed extravasatie 16. Dit model wordt algemeen gebruikt om mechanismen te onderzoeken hematoom uitbreiding alsmede prospect ontwikkelingive behandelingen die homeostase beïnvloeden. Een bacteriële collagenase kan versterken de ontstekingsreactie en presenteren neurotoxische effecten bij hoge doses 3. Bovendien kunnen uitgebreide bloedingen na intracerebrale injectie collagenase te produceren - in tegenstelling tot menselijke ICH pathologie een ischemisch hersenletsel.
Interessant, vrouwelijke muizen blootgesteld aan experimentele ICH toonde een significant sneller herstel van neuro-tekorten dan mannelijke dieren 8. Soortgelijke bevindingen zijn gegeven in ischemische beroerte en geeft aldus mannelijke knaagdieren worden vaker toegepast voor studies van beroerte pathologie en behandeling evaluatie 17.
In deze experimenten gebruikten we intraperitoneale co-injectie van de anesthetica ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) voor beide modellen ICH, maar eerdere studies hebben de incidentie van acute hyperglycemie in verdoofde knaagdieren, te beginnen binnen 20 minuten na kEtamine en xylazine injectie 18. Bovendien kan ketamine, een N-methyl d-aspartaat (NMDA) receptor antagonist, eventueel verminderen NMDA receptor-afhankelijke excitotoxiciteit en dus resultaten verbeteren in hersenletsel modellen. Vluchtige anesthetica, zoals isofluraan, worden door elkaar gebruikt in preklinische ICH onderzoek en houd unieke voordelen ten opzichte van injecteerbare middelen, met inbegrip van de snelle verandering van de anesthesie diepte en korte hersteltijden 19. Het grootste nadeel van gas anesthesie is de noodzaak van uitgebreide apparatuur (verdamper stromingsmeter masker ademhalingscircuit) en de kans op menselijke gasblootstelling. Bovendien is gemeld dat isofluraan apoptotische celdood verminderen na hemorragische beroerte in muizen 20. De optimale anesthesie moet worden aangepast afhankelijk van chirurgie, diersoorten of stam, en de resultaten metingen plaats.
We beschreven en aangetoond twee ICH modellen die uniqu hebbene sterke en zwakke punten, terwijl die specifieke ICH eigenschappen. Elke modellen 'representatieve kenmerken moet rekening worden gehouden met, indien gebruikt in preklinische ICH onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie RO1NS053407 aan JH Zhang. Wij willen de heer Damon Klebe bedanken voor zijn waardevolle bijdragen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Head Frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Nanomite Syringe Pump | Harvard Apparatus | PY2 70-2217 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton Company | 1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl) |
26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes. |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Microdrill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | 0.9 mm diameter |
| Collagenase Type VII-S | Sigma-Aldrich | C2399 | |
| Microhematocrit Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | unheparinized |
| Bone Wax | Ethicon | W31 | |
| Suture | Ethicon | 1676G | |
| Ketamine | JHP Pharmaceuticals | 42023-115-10 | Ketalar |
| Xylazine | LLOYD Laboratories | 139-236 | AnaSed |
References
- Broderick, J. P. Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage: A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 30, 905-915 (1999).
- Qureshi, A. I., Mendelow, A. D., Hanley, D. F. Intracerebral haemorrhage. Lancet. 373, 1632-1644 (2009).
- MacLellan, C. L., Silasi, G., Auriat, A. M., Colbourne, F. Rodent models of intracerebral hemorrhage. Stroke. 41, 95-98 (2010).
- James, M. L., Warner, D. S., Laskowitz, D. T. Preclinical models of intracerebral hemorrhage: a translational perspective. Neurocrit Care. 9, 139-152 (2008).
- MacLellan, C. L. Intracerebral hemorrhage models in rat: comparing collagenase to blood infusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 516-525 (2008).
- Belayev, L. Experimental intracerebral hemorrhage in the mouse: histological, behavioral, and hemodynamic characterization of a double-injection model. Stroke. 34, 2221-2227 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline treatment for experimental intracerebral hemorrhage in mice. Stroke. 29, 2136-2140 (1998).
- Nakamura, T. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 487-494 (2004).
- Schallert, T. Behavioral tests for preclinical intervention assessment. NeuroRx. 3, 497-504 (2006).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. 1280, 148-157 (2009).
- Hua, Y. Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- Tang, J. Mmp-9 deficiency enhances collagenase-induced intracerebral hemorrhage and brain injury in mutant mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 1133-1145 (2004).
- Ma, Q. Vascular adhesion protein-1 inhibition provides antiinflammatory protection after an intracerebral hemorrhagic stroke in mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2010).
- Bullock, R., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M., Graham, D. I. Intracranial haemorrhage induced at arterial pressure in the rat. Part 1: Description of technique, ICP changes and neuropathological findings. Neurol Res. 6, 184-188 (1984).
- Yang, G. Y., Betz, A. L., Chenevert, T. L., Brunberg, J. A., Hoff, J. T. Experimental intracerebral hemorrhage: relationship between brain edema, blood flow, and blood-brain barrier permeability in rats. J. Neurosurg. 81, 93-102 (1994).
- Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21, 801-807 (1990).
- Alkayed, N. J. Gender-linked brain injury in experimental stroke. Stroke. 29, 159-165 (1998).
- Saha, J. K., Xia, J., Grondin, J. M., Engle, S. K., Jakubowski, J. A. Acute hyperglycemia induced by ketamine/xylazine anesthesia in rats: mechanisms and implications for preclinical models. Exp Biol Med. (Maywood). 230, 777-784 (2005).
- Fujiwara, N. Effect of normobaric oxygen therapy in a rat model of intracerebral hemorrhage. Stroke. 42, 1469-1472 (2011).
- Khatibi, N. H. Isoflurane posttreatment reduces brain injury after an intracerebral hemorrhagic stroke in mice. Anesth Analg. 113, 343-348 (2011).
