Использование времени Lapse микроскопии для визуализации Anoxia вызванных Подвесные анимации в<em> C. Элеганс</em> Эмбрионы
Summary
Описанные здесь<em> В естественных условиях</em> Техника для изображения субклеточных структур у животных, подвергшихся гипоксии помощью потока газа через microincubation камеры в сочетании с вращающимся диском конфокальной микроскопии. Этот метод прост и достаточно гибкой, чтобы удовлетворить различные параметры эксперимента и модельных системах.
Abstract
Caenorhabdits Элеганс широко используется при исследовании устойчивости к стрессу, который способствует прозрачности взрослых и эмбрион стадии, а также наличие генетических мутантов и трансгенных линий выразить множество гибридных белков 1-4. Кроме того, динамические процессы, такие как деление клетки может быть просмотрен с помощью флуоресцентно меченых белков репортер. Исследование митоза может быть облегчен за счет использования покадровой экспериментов в различных системах, включая нетронутыми организмов, поэтому рано C. Элеганс эмбрионов хорошо подходит для данного исследования. Представленный здесь метод, с помощью которого в естественных изображений субклеточных структур в ответ на бескислородных (99,999% N 2; <2 частей на миллион O 2) напряжение можно с помощью простой поток газа через установку на мощный микроскоп. Microincubation камере используется в сочетании с азотом поток газа через и вращающийся диск конфокальной микроскопииДля создания контролируемой среды, в которой животные могут быть отображены в естественных условиях. Использование GFP с метками тубулина гамма-и гистонов, динамики и арест клеточного деления, можно контролировать до, во время и после воздействия лишенной кислорода среде. Результаты этой техникой высокого разрешения, подробные видео и изображения клеточных структур в бластомеров эмбриона подвергаются кислородное голодание.
Protocol
Representative Results
Discussion
Лишение кислорода и подвесные Анимация
Хотя воздействие тяжелых лишений кислорода может быть фатальным для некоторых организмов, некоторые организмы способны выживать воздействия кислородное голодание. В случае C. Элеганс, выживание воздействия гипоксии зависит о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы выразить нашу признательность за вход и комментарии от членов Падилья Lab. Нематоды деформаций в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр, который финансируется за счет NIH Национальный научно-исследовательский центр ресурсов (NCRR). Мы признаем и поблагодарить д-ра Lon Тернбулл для оказания технической помощи с конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана грантом от Национального научного фонда (NSF-IOS, карьеры), чтобы PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
