Beskrivs här är ett<em> In vivo</em> Teknik att avbilda subcellulära strukturer i djur som exponerats för anoxi användning ett gasflöde genom microincubation kammare i samband med en roterande skiva konfokalmikroskop. Denna metod är enkel och tillräckligt flexibel för att passa en mängd olika experimentella parametrar och modellsystem.
Caenorhabdits elegans har använts i stor utsträckning i studier av stresstålighet, vilket underlättas av öppenheten i den vuxna och embryo stadier samt av tillgången av genetiska mutanter och transgena stammar som uttrycker en myriad av fusionsproteiner 1-4. Dessutom kan dynamiska processer såsom celldelning visas med fluorescensmärkta reporter proteiner. Studien av mitos kan underlättas genom användning av time-lapse experiment i olika system inklusive intakta organismer, alltså den tidiga C. elegans embryo väl lämpad för denna studie. Presenteras här är en teknik med vilken in vivo avbildning av sub-cellulära strukturer som svar på anoxiska (99,999% N 2, <2 ppm O 2) stress är möjligt med en enkel gasflöde genom installationen på en kraftfull mikroskop. En microincubation kammare används i kombination med kvävgas flöde genom och en roterande skiva konfokalmikroskopatt skapa en kontrollerad miljö där djur kan avbildas in vivo. Använda GFP-märkta gamma tubulin och histon, kan den dynamik och gripandet av celldelning övervakas före, under och efter exponering för en syre-berövade miljö. Resultaten av denna teknik är högupplösta, detaljerade videor och bilder av cellulära strukturer inom blastomerer av embryon utsätts för syrebrist.
Syrebrist och skendöd
Även exponering för svår syrebrist kan vara dödlig för vissa organismer, vissa organismer kan överleva exponering för anoxi. I fallet av C. elegans, beroende överlevnad anoxi exponering på utvecklingsstadiet och svar på syrebrist är inträde i en reversibel tillstånd av skendöd i vilken ett antal observerbara biologiska processer arresteras. Celldelning, utveckling, rörelse, kost och reproduktiva processer upphöra tills syre återinförs i miljön …
The authors have nothing to disclose.
Vi vill framföra vår uppskattning för de synpunkter och kommentarer från medlemmar i Padilla Lab. Nematoder stammar i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Vi erkänner och tackar Dr Lon Turnbull för tekniskt bistånd med konfokalmikroskopi. Detta arbete har fått stöd av ett stipendium från National Science Foundation (NSF-IOS, karriär) till PAP
Reagents/Equipment | Composition | ||
Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |