Hier wird beschrieben ein<em> In vivo</em> Technik zur Bilder subzellulären Strukturen in Tieren, die mit Anoxie einen Gasstrom durch microincubation Kammer in Verbindung mit einer drehenden Scheibe Konfokalmikroskop. Dieses Verfahren ist einfach und flexibel genug, um eine Vielzahl von experimentellen Parameter und Modellsystemen anzupassen.
Caenorhabdits elegans wurde ausgiebig in der Studie der Stressresistenz, die durch die Transparenz des adulten Stadien und Embryo als auch durch die Verfügbarkeit von genetischen Mutanten und transgenen Linien Expression einer Vielzahl von Fusionsproteinen 1-4 erleichtert wird. Darüber hinaus können dynamische Prozesse wie Zellteilung Darstellung unter Verwendung von fluoreszierend markierten Reporter-Proteine werden. Das Studium der Mitose kann durch den Einsatz von Zeitrafferexperimente in verschiedenen Systemen einschließlich intakten Organismen erleichtert; somit der frühen C. elegans Embryo wird auch für diese Studie geeignet. Präsentiert hier ist eine Technik, mit der in vivo Bildgebung von sub-zellulären Strukturen in Reaktion auf Sauerstoffmangel (99,999% N 2; <2 ppm O 2) Stress ist möglich, mit einem einfachen Gasfluss durch Setup auf einem High-Power-Mikroskop. Ein microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop verwendetum eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden können. Verwendung GFP-markierten Gamma-Tubulin und Histon, kann die Dynamik und Verhaftung der Zellteilung kontrolliert werden, bevor, während und nach der Einwirkung von einer sauerstoffarmen Umgebung. Die Ergebnisse dieser Technik sind hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder von zellulären Strukturen innerhalb Blastomeren von Embryonen ausgesetzt Sauerstoffmangel.
Sauerstoffmangel und Suspended Animation
Obgleich das Engagement in schweren Sauerstoffmangel kann tödlich sein für einige Organismen, sind einige Organismen, um die Exposition gegenüber Anoxie überleben. Im Falle von C. elegans, hängt Überleben von Anoxie Belichtung auf Entwicklungsstadium und ist ansprechend auf Anoxie Eintritt in einen Zustand der reversiblen suspendiert Animation in dem eine Anzahl von beobachtbaren biologische Prozesse werden verhaftet. Zellteilung, Entwickl…
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten unsere Wertschätzung für die Eingabe und Kommentare von Mitgliedern des Padilla Lab vermitteln. Nematode Stämme in dieser Arbeit wurden von der Caenorhabditis Genetics Center, das von der NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert ist. Wir anerkennen und danken Dr. Lon Turnbull für technische Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (NSF-IOS, CAREER) an PAP unterstützt
Reagents/Equipment | Composition | ||
Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |