Summary

Mass cytometri: Protokoll for Daily Tuning og kjører celleprøver på en CyTOF Mass cytometer

Published: November 02, 2012
doi:

Summary

De nødvendige skritt for daglig tuning og optimalisering av ytelsen til en CyTOF masse cytometer er beskrevet. Kommentarer til optimal prøveopparbeidelse og strømningshastighet er diskutert

Abstract

I de senere årene har den raske analyse av enkeltceller ofte blitt utført ved hjelp av flowcytometri og fluorescently-merkede antistoffer. Imidlertid har problemet med spektrale overlapping av fluorofor utslipp begrenset antallet samtidige sonder. I kontrast til nye CyTOF massen cytometer etter DVS Sciences par flytende encellet introduksjon system til en ICP-MS. 1 stedet fluoroforer er chelaterende polymerer inneholdende høyt anrikede isotoper metal koplet til antistoffer eller andre spesifikke sonder. 2-5 På grunn av metall renhet og masse oppløsning av massen cytometeret, er det ingen "spektral overlapping" fra nærliggende isotoper, og derfor ikke behov for kompensasjon matriser. Tillegg, på grunn av bruken av lantanid metaller, er det ingen biologisk bakgrunn og derfor ingen ekvivalent autofluorescens. Med en masse vindu spanning atommasse 103-203, teoretisk opptil 100 etiketter kunne skilles samtidig. I dag, Mer enn 35 kanaler er tilgjengelige via chelaterende reagenser tilgjengelig fra DVS Sciences, slik enestående disseksjon av den immunologiske profilen av prøver. 6-7

Ulemper for massen cytometri inkludere strenge nødvendig med en separat metall isotop pr probe (ingen tilsvarer fremover eller sidespredning), og det faktum at det er en destruktiv teknikk (ingen mulighet for sortering utvinning). Gjeldende konfigurasjon av massen cytometeret har også en celle overføringshastighet på bare ~ 25%, og dermed krever et høyere inngang antall celler.

Optimal daglig ytelse av massen cytometeret krever flere trinn. Grunnleggende mål av optimaliseringen er å maksimere den målte signalintensitet av de ønskede isotoper metal (M) samtidig minimere dannelsen av oksider (M 16) som vil redusere M signalintensitet og forstyrre ønsket signal på M 16. Det første trinnet er å varme opp maskinen slik at en varm, stabil jegCP plasma er etablert. Sekund, må innstillingene for strøm og make-up gass strømningshastighet bli optimalisert på en daglig basis. Under prøvetaking, er den maksimale celle hendelsesraten begrenset av detektoren effektivitet og prosesseringshastighet til 1000 celler / andre. Imidlertid, avhengig av prøven kvalitet, en langsommere celle hendelsesrate (300-500 celler / sekund) er vanligvis ønskelig for å tillate bedre oppløsning mellom celler hendelser og dermed maksimere intakte singlets løpet dubletter og rusk. Slutt hjelper tilstrekkelig rengjøring av maskinen ved slutten av dagen minimere bakgrunnssignal grunnet materialovergang.

Protocol

Alle celleprøver for CyTOF må være fast og permeabilized. Dette muliggjør større oppføring av iridium-holdige DNA intercalator, og forhindrer også cellelyse under MilliQ vannvask og resuspendering trinnene umiddelbart før injisering inn i massen cytometeret. 1. Oppstart av Mass cytometeret Åpne CyTOF programmet. Velg Instrument Setup. På kortet Cage kategorien, går du til nedre høyre hjørne og klikk Heater "ON"-knappen. Slå på varmeapparatet minst 15 min f…

Representative Results

Etter ovennevnte protokoll skal oppnå fire ting. Først, vil tillate tilstrekkelig oppvarmingstid for massen cytometeret produsere en varm, stabil plasma nødvendig for en optimal signal og minimal oksyddannelse. Sekund, tilstrekkelig vasking av massen cytometer med MilliQ vann og DVS vaskeoppløsning (figur 9) vil bidra til å redusere nivåene av metall adsorpsjon til slangen og andre deler av maskinen, bidrar til å redusere bakgrunnen under prøvetagning (Figur 8). Det vil også bi…

Discussion

For de siste tiårene, har fluorescens flowcytometri vært en arbeidshest metode for å analysere enkeltceller, både i form av overflate uttrykk og i funksjonelle analyser. Imidlertid har problemene med spektrale overlapping av de fluorescerende fargestoffer begrenset antallet samtidige markører. Mens forsøk med mer enn 12 samtidige markører er rapportert, gjør erstatningsbeløpet nødvendig dette teknisk vanskelig.

Istedenfor fluoroforer, masse cytometri utviklet av DVS Sciences bruker…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi ønsker å takke dr. Evan Newell og Dr. Sean Bendall for tilbakemelding. Vi vil også takke DVS Sciences og Dr. Sean Bendall for et utvalg av Multi-lanthanid-holdige polystyren perler. Vi er takknemlige for støtte fra NIH stipend to U19 AI057229.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
CyTOF mass cytometer DVS Sciences    
Wash solution DVS Sciences 201071 0.05% hydrofluoric acid in water
Tuning solution DVS Sciences 201072 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid
Eu-containing polystyrene beads DVS Sciences 201073 Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml
Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads DVS Sciences Not yet commercially-available Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides
Nitric acid (concentrated) Fisher Scientific A467-500 Optima trace-metal pure ICP-MS grade
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml BD 352235 used to filter cell samples before injection
Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml Henke Sass Wolf 4010-200V0 silicone-free, latex-free
Norm-Ject syringe-3 ml Henke Sass Wolf 4010.000V0 silicone-free, latex-free
MilliQ water     18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present).
Citranox Sigma-Aldrich Z273236 acid detergent
Argon gas Praxair AR 5.0UH-T 99.999% Ultra-high purity

Play Video

Cite This Article
Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer. J. Vis. Exp. (69), e4398, doi:10.3791/4398 (2012).

View Video