Mass cytometri: Protokoll for Daily Tuning og kjører celleprøver på en CyTOF Mass cytometer
Summary
De nødvendige skritt for daglig tuning og optimalisering av ytelsen til en CyTOF masse cytometer er beskrevet. Kommentarer til optimal prøveopparbeidelse og strømningshastighet er diskutert
Abstract
I de senere årene har den raske analyse av enkeltceller ofte blitt utført ved hjelp av flowcytometri og fluorescently-merkede antistoffer. Imidlertid har problemet med spektrale overlapping av fluorofor utslipp begrenset antallet samtidige sonder. I kontrast til nye CyTOF massen cytometer etter DVS Sciences par flytende encellet introduksjon system til en ICP-MS. 1 stedet fluoroforer er chelaterende polymerer inneholdende høyt anrikede isotoper metal koplet til antistoffer eller andre spesifikke sonder. 2-5 På grunn av metall renhet og masse oppløsning av massen cytometeret, er det ingen "spektral overlapping" fra nærliggende isotoper, og derfor ikke behov for kompensasjon matriser. Tillegg, på grunn av bruken av lantanid metaller, er det ingen biologisk bakgrunn og derfor ingen ekvivalent autofluorescens. Med en masse vindu spanning atommasse 103-203, teoretisk opptil 100 etiketter kunne skilles samtidig. I dag, Mer enn 35 kanaler er tilgjengelige via chelaterende reagenser tilgjengelig fra DVS Sciences, slik enestående disseksjon av den immunologiske profilen av prøver. 6-7
Ulemper for massen cytometri inkludere strenge nødvendig med en separat metall isotop pr probe (ingen tilsvarer fremover eller sidespredning), og det faktum at det er en destruktiv teknikk (ingen mulighet for sortering utvinning). Gjeldende konfigurasjon av massen cytometeret har også en celle overføringshastighet på bare ~ 25%, og dermed krever et høyere inngang antall celler.
Optimal daglig ytelse av massen cytometeret krever flere trinn. Grunnleggende mål av optimaliseringen er å maksimere den målte signalintensitet av de ønskede isotoper metal (M) samtidig minimere dannelsen av oksider (M 16) som vil redusere M signalintensitet og forstyrre ønsket signal på M 16. Det første trinnet er å varme opp maskinen slik at en varm, stabil jegCP plasma er etablert. Sekund, må innstillingene for strøm og make-up gass strømningshastighet bli optimalisert på en daglig basis. Under prøvetaking, er den maksimale celle hendelsesraten begrenset av detektoren effektivitet og prosesseringshastighet til 1000 celler / andre. Imidlertid, avhengig av prøven kvalitet, en langsommere celle hendelsesrate (300-500 celler / sekund) er vanligvis ønskelig for å tillate bedre oppløsning mellom celler hendelser og dermed maksimere intakte singlets løpet dubletter og rusk. Slutt hjelper tilstrekkelig rengjøring av maskinen ved slutten av dagen minimere bakgrunnssignal grunnet materialovergang.
Protocol
Representative Results
Discussion
For de siste tiårene, har fluorescens flowcytometri vært en arbeidshest metode for å analysere enkeltceller, både i form av overflate uttrykk og i funksjonelle analyser. Imidlertid har problemene med spektrale overlapping av de fluorescerende fargestoffer begrenset antallet samtidige markører. Mens forsøk med mer enn 12 samtidige markører er rapportert, gjør erstatningsbeløpet nødvendig dette teknisk vanskelig.
Istedenfor fluoroforer, masse cytometri utviklet av DVS Sciences bruker…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke dr. Evan Newell og Dr. Sean Bendall for tilbakemelding. Vi vil også takke DVS Sciences og Dr. Sean Bendall for et utvalg av Multi-lanthanid-holdige polystyren perler. Vi er takknemlige for støtte fra NIH stipend to U19 AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
References
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
