Summary

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em> באתר</em> הכלאה

Published: December 10, 2012
doi:

Summary

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם ניאון<em> באתר</em> הכלאה (דגים) כדי להעריך את עיתוי שכפול של כרומוזומים יונקים. טכניקה זו מאפשרת להשוואה הישירה של הכרומוזומים עצבו מחדש, ובטל מחדש-בתוך אותו התא.

Abstract

שכפול הדנ"א יונקים יוזם באתרים מרובים לאורך הכרומוזומים בזמנים שונים במהלך שלב S, בעקבות תכנית שכפולה של זמן. המפרט של עיתוי שכפול הוא חשב להיות תהליך דינמי מוסדר על ידי רמזי רקמות ספציפיות והתפתחותית המגיבים לשינויי epigenetic. עם זאת, המנגנונים המסדירים היכן ומתי שכפול הדנ"א יוזם יחד הכרומוזומים נשארו הבינו היטב. הומולוגי כרומוזומים בדרך כלל לשכפל סינכרוני, עם זאת יש יוצאים מן הכלל בולט לכלל זה. לדוגמה, בתאי יונקים ממין נקבה אחד משני כרומוזומי X הופך מאוחר משכפל באמצעות תהליך המכונה איון X 1. יחד עם זה עיכוב בעיתוי שכפול, מוערך 2-3 שעות, הרוב המכריע של גנים הופכים השתיק תעתיק על כרומוזום X אחד. בנוסף, מוקד דיסקרטי cis טווח, ידוע כמרכז איון X, מסדיר תהליך איון X זה, לרבות האינדוקצית דואר של עיתוי שכפול מתעכב על כרומוזום X הפעיל כולו. בנוסף, שחלופי כרומוזום מסוימים הנמצאים בתאים סרטניים ותאים שנחשפו לקרינה מייננת להציג עיכוב משמעותי בעיתוי שכפול של> 3 שעות שמשפיעה על כל כרומוזום 2,3. העבודה אחרונה מהמעבדה שלנו מצביעה על שיבוש זה של דיסקרטי cis-מתנהג תוצאת לוקוסים אוטוזומלית בפנוטיפ משכפל מאוחר מאוד המשפיע על 4 כרומוזום השלמים. מחקרים 'הנדסי כרומוזום' נוספת מצביעים על כך ששחלופי כרומוזום מסוימים המשפיעים על תוצאת כרומוזומים שונות רבה בפנוטיפ הנורמלי זה שכפול עיתוי, מצביעים על כך שכל הכרומוזומים היונקים מכילים לוקוסים בדידים cis-הפועלים ששולטים עיתוי שכפול תקין של כרומוזומים בודדים 5.

כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח כמותי של עיתוי שכפול כרומוזום בשילוב עם ניאון כלאה באתר. זהשיטה מאפשרת השוואה ישירה של עיתוי שכפול בין כרומוזומים הומולוגיים באותו התא, והותאמה מ 6. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי חד המשמעי של שחלופי כרומוזומליות הקשורים לשינויים בעיתוי שכפול המשפיעים על כל כרומוזום. לשיטה זו יש יתרונות על פני מערך מייקרו תפוקה גבוה פתח לאחרונה או רצף פרוטוקולים שלא מבחינים בין האללים הומולוגיים להציג מחדש ובבטלו מחדש-כרומוזומים. בנוסף, בגלל השיטה המתוארת כאן מעריכה תאים בודדים, זה יכול לזהות שינויים בעיתוי שכפול כרומוזום בשחלופים בכרומוזומים שנמצאים רק בחלק מהתאים באוכלוסייה.

Protocol

1. התאגדות BrdU (סימון מסוף) תאי פלייט לכ 70% במפגש 24 שעתי 150 מ"מ רקמת תרבות צלחת לפני התוספת של BrdU. החלף תקשורת עם תקשורת מלאה טריה המכילה 20 מיקרוגרם / המ"ל BrdU (סיגמא) בנקודתי זמן מתאימות לפני ה…

Representative Results

דוגמה לניתוח תזמון השכפול לכרומוזום אנושי 6 מוצגת באיור 2. תאים המכילים מחיקה של ASAR6 הגן 4, הממוקם ב6q16.1, נחשפו לBrdU במשך 5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד לדגים עם בדיקת כרומוזום 6 צבע (Vysis) וכן שילוב BrdU. שים לב שיש הבדל משמעותי בדפוס פסי BrdU בין 6 של שניים, שעולה ב?…

Discussion

הכנת ממרחי כרומוזום היא שלב קריטי להצלחת בדיקת שכפול עיתוי שתואר כאן. הכללתו של צעד מקדים colcemid לפני טיפול hypotonic עשויה לסייע בתדירות ובהפצה של תאי mitotic. אנחנו בדרך כלל לחשוף תאים לcolcemdi עבור 1-3 שעות לפני הקציר, ולהשתמש colcemid בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. עם זאת, הכללתו …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן, CA131967.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue Number Comments (optional)
Anti-BrdU-FITC Roche Millipore 11202593001 MAB326F 50 μg/μl
Nick Translation Kit Abbott Molecular (Vysis) 07J00-0001  
Spectrum Orange dUTP Abbott Molecular (Vysis) 02N33-050  
CEP Abbott Molecular (Vysis) Varies  
LSI/WCP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 06J67-011  
CEP hybridization buffer Abbott Molecular (Vysis) 07J36-001  
Chromosome paints MetaSystems Group D-14NN-050-TR  
Olympus BX61 Fluorescent Microscope Olympus BX61TRF-1-5  
Microscope imaging software system Applied Imaging Cytovision 3.93.1  
Digital Camera Olympus UCMAD3  
     

IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES
Formamide Solutions
70% Formamide/2x SSC

35 ml Formamide* (Sigma)
10 ml 10x SSC
5 ml d2H20
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

* It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low.

50% Formamide/2x SSC

25 ml formamide (Sigma)
10 ml 10x SSC
15 ml dH2O
pH to 7.0 with HCl (Sigma)

20x SSC, 4 L

702 g NaCl (Sigma)
358 g Na Citrate (Sigma)
dH2O to volume

PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)]

Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots).

0.1 M NaH2P04 , 1 L

13.8 g NaH2P04 (Sigma):
dH2O to volume

0.1 M NaH2P04 1 L

14.2 g NaH2P04 (Sigma)
dH2O to volume.

PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40.

PNM 50 ml

1.25 g Non-fat dry milk (Sigma)
25 ml PN buffer (Recipe above)

Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation. Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).
  3. Smith, L., Plug, A., Thayer, M. Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).
  4. Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression. Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).
  5. Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).
  6. Camargo, M., Cervenka, J. Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model. Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).
  7. Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).
  8. Diaz-Perez, S., et al. The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse. Genetics. 171, 663-672 (2005).
  9. Diaz-Perez, S. V., et al. A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes. Genetics. 174, 1115-1133 (2006).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  11. Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. Allelic inactivation of rDNA loci. Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).
  12. Branzei, D., Foiani, M. The checkpoint response to replication stress. DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).

Play Video

Cite This Article
Smith, L., Thayer, M. Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (70), e4400, doi:10.3791/4400 (2012).

View Video