Summary
토끼의 무릎 관절 연골 결손의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포의 이식은 조직 공학 분야의 유망한 개발을 제공합니다. 섬유소 세포 혈전의 준비
Abstract
연골 관절 결함의 치료는 몇 년 동안 의사를 도전하고있다. 최근 몇 년 동안 관절 연골과 연골 하골의 상호 작용의 이해는 전체 연골 단위의 복원으로 증가 관심을 이끌어 냈다. chondral 병변에 비해 골 연골 결손의 재생은 훨씬 더 복잡하고 훨씬 더 큰 수술 및 치료 도전입니다. 손상된 조직은 표면 연골 층뿐만 아니라 연골 하골에 포함되지 않습니다. 이 osteochondrosis의 dissecans로 예를 들면 발생할 때 깊은 골 연골 손상, 결함의 전체 두께는 접합면을 복원하기 위해 교체해야합니다. 자격 치료 절차는 서로 다른 고유의 치유 잠재력 2이 두 개의 서로 다른 조직을 고려해야합니다. 지난 수십 년 동안 여러 가지 수술 적 치료 옵션이 등장하고 이미 임상 3 설립되었습니다 -6.
자가 또는 동종 골 연골 이식은 관절 연골과 연골 하골의 구성 및 전체 골 연골 장치의 교체를 할 수 있습니다. 결함 표면 3,7,8 덮여 합동 유리 모양의 연골을 제공하는 것을 목표로 원통형의 골 연골 이식으로 채워집니다. 단점 사용할 이식, 공여부 이환율 (자가 이식)과 표면의 부조화의 제한되며 따라서이 방법의 응용 프로그램은 특히 큰 결함이 제한됩니다.
조직 공학 분야에서 새로운 접근이 재생 연골 치료에 유망한 가능성을 열었다. 자가 연골 세포의 이식은 전층 연골 병변의 치료를위한 첫 번째 셀을 기준으로 생물학적 접근 방식을 표시하고 현재 전세계도 10~20년 주입 9,10 후에 좋은 임상 결과와 함께 설정됩니다. 그러나 다에테이 기술은 연골 뼈 11을 포함하는 깊은 결함으로 병변의 모든 종류의 치료에 적합하지 않습니다.
샌드위치 기술은 조직 공학 5,6에서 현재의 접근 방식에 이식 뼈를 결합합니다. 이 조합은 혼자 연골 이식에서 보이는 한계를 극복 할 수있을 것 같습니다. 연골 결손 영역에 이식자가 골 후,자가 연골 세포와 시드 막 위 봉합 및 부상 사이트에 이식 토폴로지에 맞게 용이합니다. 물론, 이전의 뼈 재건은 추가 수술 시간과 자주도 추가 수술이 필요합니다. 또한, 현재까지 장기간 데이터가 12이 없습니다.
이식 추가 골없이 조직 공학 이식 세포의 연골 및 골 형성 가능성 인디언 관절 연골의 복잡한 구조와 특성을 복원하는 것을 목표로하고있다. HoweveR은 다시, 그것은 일반적으로 더 많거나 적은 재생에만 연골 조직이다. 추가 골 연골 손상은 특정 추가 처리가 필요합니다. 동종 /자가 세포를 파종 골 연골 결손의 다층 구조의 재생을 달성하기 위하여, 입체 조직 설계 제품은 좋은 재생 능력 11 제공 할 수 있습니다.
자가 연골 옆에 중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 전층 연골 조직의 개발을위한 매력적인 대안이 될 것으로 보인다. 다수의 전임상 시험 관내 (in vitro)과 생체 내 연구에서, 중간 엽 줄기 세포는 뛰어난 조직 재생 가능성 13,14을 표시했다. 특히 연골 결손의 치료를위한 중간 엽 줄기 세포의 중요한 장점은 골 세포뿐만 아니라 연골 세포의 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. 따라서, 그들은 잠재적 D의 다중 재생을 허용EFECT.
최근 몇 년 동안, 연골 재생 잠재력을 가진 여러 비계 따라서 개발되어 예비 결과에게 1,15-18을 약속으로 평가. 또한, 휴대 캐리어와 같은 섬유소 접착제 실험 연골의 기본 기술 중 하나가되었고 이미 성공적으로 여러 동물 연구에서 19-21, 심지어 최초의 인간 실험 22 사용되었습니다.
다음 프로토콜은 세포 배양의 후속 증식과 섬유소 세포 혈전에 대한 체외 모델에서 표준을 준비, 토끼의 골수에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하는 실험 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 토끼의 무릎 관절의 인공 연골 결손에 미리 설정된 섬유소 세포 혈전 주입하는 기술을 설명한다.
Protocol
중간 엽 줄기 세포의 분리에 대한 기증자 토끼의 A. 준비 (수술실)
- 세포는 남성 4개월의 나이에 뉴질랜드 화이트 (NZW) 토끼와 약 3kg의 체중에서 격리됩니다.
- 프로포폴 (10 ㎎ / ㎏ 체중 IV)로 마취를 유도하고 나트륨 pentobarbital (100 ㎎ / ㎏ 체중 IV)를 희생.
- 전기 어선과 뒷다리, 뒤 및 아랫배의 털을 면도 모피를 진공.
- 70 % 에탄올로 깨끗이 면도 영역을 소독.
- 조직과 인대에 대한 무딘 집게, 날카로운 가위 (또는 메스)과 뼈 절단기를 사용합니다.
- 다리와 종아리의 두개골 표면을 따라 절개를합니다.
- 하나 날카 롭거나 무딘 절개하여 피부와 피하 조직을 반영합니다.
- 별도의 근육과 경골과 대퇴골의 인대. 깨끗한 절개를 만들기 위해 가능한 한 뼈에 가깝게 커트를 유지합니다. 이 시점에서 경골에서 대퇴골을 분리하지 마십시오.
- THR 컷ough 비구에서 대퇴골의 머리를 분리하는 고관절.
- 경골 - 대퇴골 복합 상승.
- 뼈에 남아있는 연부 조직을 긁어 또는 멸균 천 조직과 뼈를 문질러 메스 블레이드를 사용합니다. 이 시점에서, 대퇴골 및 경골은 여전히 연결되어 있습니다.
- 절단에 의해 슬개골을 제거한 후 마지막으로 별도의 뼈 무릎 관절 인대를 잘라.
- 스프레이 70 % 에탄올과 뼈를 분리, 공기가 건조 세포 배양 배지 (DMEM +는 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep의)) 그 축축한 유지하기로 50 ML의 원심 분리기 튜브에 각각 골을 배치 할 수 있습니다.
- 지금 무균 세포 배양 층류 후드 아래에서 전환합니다.
B.는 (세포 배양 후드) 뼈와 확장에서 토끼 MSC의 플러싱
- 관에서 뼈를 수집하고 멸균 집게를 사용하여 150mm 접시에 배치합니다.
- 두 뼈 새로운 150mm 접시에 무균 본 및 이동 조각 끝을 제거합니다.
- 메디와 함께 10 ML의 주사기를 채우십시오음 (DMEM), 18 게이지 바늘을 연결하고 골수 구멍에 삽입합니다.
- 그런 다음 접시에 골수를 플러시 매체와 골수 구멍을 씻어. 가능하면 그 후, 다른 쪽 끝에서 린스. 필요한 경우, 끝에서 더를 보았다. 뼈가 파손되었을 경우에, 다만 뼈의 내부를 씻어.
- 주사기로 세포 매체 현탁액을 기음과 서스펜션 골수 구멍과 골수 혈전이 나타납니다 더 이상 뼈를 통해 무료로 부동 때까지 반복적으로 골수를 씻어.
- 일단 골수는 골수 대단히 짧은 시간이 18 게이지 바늘을 통과하여 중단, 모든 뼈에서 수집 된 기능 : 바늘 부착 된 주사기를 작성하고 중간에 강제로.
- 그 후, 50 ML 튜브에 세포의 필터를 통해 현탁액을 필터링합니다. 세포의 손실을 방지하기 위해, 10 ㎖의 배지로 배양 접시에 배를 세척뿐만 아니라 필터링합니다.
- RT에서 5 분 500 XG에 현탁액을 원심 분리기.
- 뜨는을 Resuspend 세포 펠를 제거등 10 ㎖ 배지에서 (DMEM + 1 % 펜 / Strep의).
- Biocoll 분리 솔루션을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 별도의 혈액 세포.
- Biocoll는 15 ML 튜브에 솔루션을 분리 5 mL를 입력하고 조심스럽게 RT에서 20 분 (브레이크없이)에 대한 800 XG에 상단과 원심 분리기에 세포 현탁액의 5 ML을 추가합니다.
- PBMC 및 중간 엽 줄기 세포가 인터페이스에 남아있는 동안 Biocoll, 아래로 적혈구 침전 이상이기 때문에 밀도 : 가능한 결과는 그림 1을 참조하십시오.
- 조심스럽게 15 ML 튜브에 인터페이스를 제거하고 5 ML PBS로 세척한다.
- 로 22 단계에 설명 된 5 ML PBS에 resuspend을 원심 분리하고 2 배를 반복합니다.
- 그런 다음, 실온에서 10 분 (브레이크) 350 XG에서 다시 원심 분리기.
- 10 ML 매체에 resuspend을하고 혈구의 세포를 계산합니다.
- 150mm 요리 약 5 × 10 6의 초기 시딩 밀도에 플레이트 세포.
- 2~3일 후, 다시비 부착 세포를 이동합니다. 당신은 세포 파편을 제거하기 위해 PBS 먼저 씻어해야 할 수도 있습니다. 신선한 완전 배지를 추가 (DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FCS) + 1 % 펜 / Strep의) 후.
- 세포에게 매 3-4 일 (그림 2)를 공급합니다.
- 후에 5-10 일 처음으로 통과 세포.
체외에서 섬유소 혈전의 C. 준비
- 이식 날에, 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 3 분 노출에 의해 플라스크 / 접시에서 자기편 세포를 놓습니다. 완전 배지를 추가하여 트립신을 중지합니다.
- 50 ML 팔콘 튜브에 세포를 배포하고 PBS로 두 번 씻어 내십시오.
- 판 블루 염색에 의한 세포 생존과 번호를 확인합니다.
- 50,000 세포 / microcentrifuge 관을 추가하고 RT에서 5 분 500 XG에서 원심 분리하여 펠렛을 수집합니다. 필요에 따라 적어도 하나 이상의 혈전에 대한 mastermix를 준비합니다.
- 17 μl의 PBS에 세포 펠렛을 resuspend을하고 TISSU의 피브리노겐 구성 요소의 25 μl를 혼합이 17 μL MSC 서스펜션이 장착 된 COL-KIT.
- 생체 내에서 드릴 구멍 (그림 3)에 따라 사전 뚫고 구멍 (3x3.6 mm)와 멸균 플레이트를 가져 가라.
- 첫째, 42 μL 피브리노겐-세포 현탁액와 상단에 다시 4 μl의 트롬빈 용액을 즉시 첨가하여 하나의 구멍에 4 μL 트롬빈 용액 (500 IU / ㎖) 접종. 피펫 팁의 응고를 방지하기 위해 정지를 혼용하지 마십시오. 첫째, 피펫 피브리노겐-세포 현탁액의 50 μl의 볼륨이 표면 장력으로 인해 녹는없이 사전 뚫고 구멍의 가장자리를 돌출됩니다. 그러나 완전한 응고 후 (60 분 후) 응고가 계약하고 사전 뚫고 구멍에 맞습니다.
- 조심스럽게 PBS와 microcentrifuge 관에 무딘 포셉과 장소를 사용하여 혈전을 제거합니다. 2 혈전 / 동물을 준비합니다.
- 수술 방에 혈전을 가져 가라.
섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 D.의 주입
- 프로포폴의 정맥 주사 (10 mg / kg 체중)에 의해 토끼 (5-6 개월 NZW, 남성, 3.5-4.0 kg 체중)로 마취를 유도.
- 전기 어선 및 진공 모피에서 운영되는 무릎을 면도. 전에 이름이 모든 절차는 수술실 무균 환경의 오염을 방지하기 위해 수술 준비실에서 수행됩니다.
- 삽관 후 1.5 ㎎ / ㎏ / min의 propofol의 0.05 ㎎ / ㎏ / 정맥 분 펜타닐로 마취를 유지합니다. 호 기말 이산화탄소 분압, 산소 포화도와 맥박수를 사용하여 마취를 모니터링합니다.
- 철저하게 면도 무릎을 소독 및 멸균 드레싱 토끼의 나머지 부분을 커버한다.
- 슬개골을 만져 및 슬개골 내측 피부 절개를 수행합니다.
- 무균 조건 하에서 중간 parapatellar arthrotomy하여 무릎 관절을 엽니 다. 어떤 작은 표재성 혈관을 절단하지 않도록하십시오.
- (그림 4) 측면 슬개골을 치환.
- inspe 후모든 수반 연골 병변이나 관절 이상을위한 무릎 관절의 ction의가 정지 장치 살균 공기 작동 전원 드릴 활차 홈에서 두 골 연골 결손 (깊이 3mm, 여덟 모양의 그림) (직경 3.6 mm)를 생성 (그림 5).
- 결함을 청소하고 멸균 생리 식염수로 헹구어.
- 주입에 앞서, 결함에 섬유소 접착제의 20 μl를 작성하고 결함의 바닥에 균등하게 배포 할 수 있습니다.
- 그런 혈전을 이식 압입 그림 8 - 모양의 결함에.
- 응고 후, 활차 홈에서 슬개골의 위치를 변경하고 몇 번을 구부리고 무릎 스트레칭.
- 옆으로 다시 한번 슬개골을 치환하고 피브리노겐-세포 혈전은 아직도 그 자리에 있는지 확인합니다.
- 다시 슬개골을 교체하고 (모두 흡수 봉합사로 하나의 버튼 봉합사 (4-0 Vicryl)와 지속적인 피부 봉합 (4-0 Monocryl)와 레이어 상처 폐쇄 작업을 완료자료).
- 마지막으로, 수증기 침투성 드레싱 스프레이로 상처를 밀봉하십시오.
- 수술 후 케어, 상처은 7 일 동안 매일 검사합니다. 토끼는 수술 후 진통제 Carprofen 4 밀리그램 / kg SC 매 24 시간 (4 일)와 Buprenorphin 0.03 ㎎ / kg SC 매 12 시간 (2.5 일)에 대해받을 수 있습니다. 무릎의 안정화 (예 : 드레싱)가 필요하지 않습니다.
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Representative Results
설명 수술 기술은 인공 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포를 성공적으로 분리 및 주입을 허용합니다. 실험 장치는 주변 연골에 임플란트의 성공적인 통합 결과.
결함 주변의 연골에 비해 유사한 역학적 특성과 유사한 내구성 수리 조직에 의해 채워졌다. 섬유소 셀 리넨은 연골 결손 (그림 3)과 같은 크기를 가지고 사전 뚫고 구멍을 가진 살균 접시에 체외에서 제조 하였다. 그 결과로, 이식 섬유소 응고 및 조기 변성 또는 박리 (그림 6)에 대한 위험 요소가 될 것입니다 주변 연골 사이에 갈라진 틈이 없었다. 수리 조직의 기초 치료는 연골 뼈에 침투했기 때문에 보장하고, 따라서 전단에 근무했습니다. 또 다른 중요한 측면은 스티 플러했다수리 조직의 fness는 어떤 그것에 부하가 증가하고 가능한 조기 변성을 피하기 위해 건강한 주변의 연골 조직과 일치해야합니다. 우리의 예비 실험 (데이터 표시되지 않음)에서, 우리는 12 주 후 충분한 강성이 이미 달성 될 수 있다고했다. 또한, 이식의 손상 및 균일 한 표면 전단 응력 가능한 임플란트의 손상 (그림 6)를 감소하는 발견되었다.
그림 1. Biocoll 분리 솔루션을 사용하여 말초 혈액 및 중간 엽 줄기 세포에서 혈액 세포와 혈장의 분리.
그림 2. 문화 5 일 후에 중간 엽 줄기 세포 (뉴질랜드 화이트 토끼)의 단일 층.
그림 3. 사전 뚫고 구멍 (3x3.6 mm) 위에 하나 섬유소 세포 응고 충만과 멸균 플레이트.
그림 4. 중간 parapatellar arthrotomy 후 무릎 관절을 열었다.
그림 5. 활차 홈에서 골 연골 결손 (직경, 그림 8 모양에 깊이 3mm, 3mm).
그림 6. 무릎 관절 12주 두 드릴 골 연골 결손에 두 섬유소 세포 혈전 주입 후 열었다.
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Discussion
최근 몇 년 동안, 복잡한 관절 연골 결손 치료의 가능성 - 같은 osteochondritis의 dissecans, 괴사와 외상으로 인한 것과 같은이 - 조직 공학 방법으로는 더 매력적되었다. 앞서 언급 한 병리 기관에서 조직 손상은 연골 뼈까지 확장 서로 다른 고유의 치유 능력 1 특징으로 두 개의 조직을 포함한다. 연골 관절 손상 11,23의 병원성 프로세스 연골 하골의 역할에 대한 관심이 증가가 있습니다. 관절 연골 및 지원 뼈의 기능 조건은 밀접하게 연결되어 있습니다. 어느 조직의 부상에 악영향 기계뿐만 아니라 환경 전체 공동 24의 항상성 균형에 영향을 미칩니다. 관절 운동의 기계적 장애, 성체 형성, 참여 구획 기계 마모 및 마멸을 통해 연골 단위 변경표면을 반대하는 것은 골관절염 1,11의 초기 발병과 발전으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 골 연골 결손의 재생을위한 조직 공학 방법은 호스트 조직 2를 주변에 효과적인 조합을 강화하기 위해 기본 연골 뼈의 적절한 복원을 동반되어야한다. 중간 엽 줄기 세포는 연골 수선이 특정 요구 사항을 제공하는 이상적인 세포의 원천이 될 것으로 보인다. 프로토콜은 잠재적으로 조골 세포와 연골 세포 계보에서 이식 된 중간 엽 줄기 세포의 선택적 분화를 유도하여 뼈와 연골 조직 복원의 추진을 강조 표시합니다.
연골 세포에 비해, 중간 엽 줄기 세포는 몇 가지 주요 장점이 있습니다 : 그들은 쉽게 큰 기증자 측 병적없이 골수 synovialis 및 지방 조직에서 분리 할 수 있습니다. 중간 엽 줄기 세포는 체외 확장의 과정 구분하지 않고,그러므로이 될 수 문화 확장 큰 관절 연골의 결함을 치료하는 많은있다. 또한, 그들은 면역 것으로 보인다 - 그리고 적절한 자극에 대한 응답으로 - 연골 세포와 골 세포 25,26로 분화 할 수있다. 중간 엽 줄기 세포의 또 다른 주목할만한 장점은 동종 중간 엽 줄기 세포가 거부 반응 27의 부호없이 사용할 수 있다는 것을 의미 자신의 hypoimmunity를 표시합니다. 따라서 하나 또는 두 개의 기증자 동물에서 세포 수영장은 모든 실험에 대한 충분한 될 수 있습니다. 이 동물의 가동 시간과 추가 피해를 줄일 수 있습니다.
여러 실험 연골 수리 19,20 위해 섬유소 접착제를 사용하여 유망한 결과를 보여 주었다. 보통, 트롬빈 용액으로 피브리노겐-세포 현탁액 접종 인공 연골 병변에 직접, 현장에서 수행 절차로 설명하고있다. 몇 분 후 사전 응고 시간 (의 짧은 기간 후에) 작업은 일반적으로 슬개골과 상처 폐쇄를 재배치하여 완료됩니다.
여러 파일럿 테스트에서, 우리는 섬유소 세포 현탁액의 충분한 응고 것이 60 분 이상이 걸립니다 발견 현장에서 -. 운전 중 - 그것은 전체의 응고를 위해 60 분 이상을 기다려야 거의 불가능합니다. 또한, 골 연골 병변을 시뮬레이션 사전 뚫고 구멍 멸균 플레이트의 사용에 의해, 그것은 분명히 완전히 결함을 채우는 데 사용 된 피브린 접착제의 양이 충분히 경화 응고의 감소로 인해 아니었다 표시하는 것이 가능했다 . 이 결함의 합동과 완전한 충전을 달성하기 위해 사전에 피브린 접착제의 높은 볼륨이 필요합니다. 관내 응고의 준비 공연 그것은 쉽게 드릴 결함의 적절한 크기로 구조 형태를 조정하고, 따라서 완전히 그리고 congruently 연골 결함을 채울 수 있습니다.
또한,N 체외에서 세포 혈전의 준비가되지 완전 경화 섬유소 세포 현탁액을 접착제의 누설을 방지하지만 (몇 분). 따라서, 처음에 의도 한 볼륨이 결함에 머물 것이라고 보장 할 수 있으며, 연골 통합 및 리모델링으로 시작됩니다.
설명 기술은 연골 수리 분야의 실험 줄기 세포 연구를위한 표준화 된 방법을 허용합니다. 프로토콜은 나중에 토끼의 무릎 관절의 연골 연골 결손에서이를 다시 이식하기 위해 중간 엽 줄기 세포를 분리하는 재생 방법을 제공합니다. 자가 연골 세포는 이미 섬유소 세포 모델에서 19 골 연골 결손에 이식되었다. 응고 준비뿐만 아니라, 대신에 연골 세포의 중간 엽 줄기 세포의 체외 모델에서 사용 개장 및 골 연골 병변의 수리를 위해 더 유리하고 유망한 새로운 접근 방식이 될 것으로 보인다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 프로젝트는 독일 연구 협회 (부여 HE 4578/3-1)에 의해 부분적으로 FP7 유럽 연합 (EU) 프로젝트 "감바"NMP3-SL-2010-245993에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
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