Summary
Se describe una técnica experimental para el tratamiento de defectos osteocondrales en la articulación de la rodilla del conejo. La implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en defectos osteocondrales proporciona un desarrollo prometedor en el campo de la ingeniería de tejidos. La preparación de la fibrina por células coágulos
Protocol
A. Preparación de un conejo de Donantes para el aislamiento de células madre mesenquimales (Surgery Room)
- Las células se aíslan a partir Zealand White (NZW) conejos de Nueva masculinos en edad de 4 meses y aproximadamente 3 kg de peso corporal.
- Inducir la anestesia por el propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) y sacrificar con pentobarbital sódico (100 mg / kg de peso corporal iv).
- Afeitarse la piel de las extremidades posteriores, la espalda y el vientre con una maquinilla eléctrica y aspirar la piel.
- Desinfectar la zona de afeitado a fondo con etanol al 70%.
- El uso de fórceps romos, tijeras afiladas (o bisturí) y cortadores de huesos de tejidos y ligamentos.
- Hacer una incisión a lo largo de la superficie craneal de la pierna y la pantorrilla.
- Reflejar la piel y el tejido subcutáneo por cualquiera de disección cortante o contundente.
- Músculos separados y ligamentos de la tibia y el fémur. Mantenga los cortes lo más cerca al hueso de lo posible para hacer una disección limpia. No separar fémur de la tibia en este momento.
- Cortar THRough la articulación de la cadera para separar la cabeza del fémur del acetábulo.
- Eleve el complejo tibial-femoral.
- Utilice la hoja de bisturí para raspar el tejido blando restante de los huesos o frotar los huesos con los tejidos de tela estériles. En este punto, el fémur y la tibia están todavía conectados.
- Retire la rótula por el corte, y luego cortar los ligamentos de rodilla a los huesos separados finalmente.
- Vaporizador separa los huesos con etanol al 70%, dejar secar al aire y colocar cada hueso en un tubo de centrífuga de 50 ml con medio de cultivo celular (DMEM + 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep)) para mantener la humedad.
- Ahora cambie bajo una campana de flujo laminar cultura celular estéril.
B. Lavado de MSC Conejo de huesos y de expansión (cultivo celular Hood)
- Recoger los huesos de los tubos y colocarlos en placas de 150 mm con pinzas estériles.
- Retire ambos extremos con una sierra estéril y mover las piezas a nuevos platos de 150 mm de hueso.
- Llene una jeringa de 10 ml con medium (DMEM), conecte una aguja de calibre 18 y se insertan en la apertura de la médula ósea.
- Luego, enjuague la cavidad ósea con medio para eliminar la médula ósea en el plato. Después, enjuague desde el otro extremo, si es posible. Si es necesario, serrar más de los extremos. Si el hueso se rompe, simplemente enjuague el interior del hueso.
- Aspirar el medio de suspensión celular en la jeringa y enjuague la médula ósea varias veces hasta que la suspensión es de libre flotación a través de la cavidad de la médula ósea y el hueso aún no aparecen de médula coágulos.
- Una vez que la médula ósea ha sido recolectada de todos los huesos, interrumpir los grupos de médula al pasar a través de una aguja de calibre 18: Llene la jeringa con aguja incorporada y obligarlo a cabo en el medio.
- Después, filtrar la suspensión a través de un filtro de células en un tubo de 50 ml. Con el fin de prevenir la pérdida de células, lavar la cultura plato 2x con 10 ml de medio y filtrar así.
- Centrifugar la suspensión a 500 xg durante 5 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender células pelly en medio de 10 ml (DMEM + 1% penicilina / estreptomicina).
- Separa las células de la sangre de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células madre mesenquimales (MSC) utilizando una solución de separación Biocoll.
- Llenar 5 ml de solución de separación Biocoll en un tubo de 15 ml y añadir cuidadosamente 5 ml de suspensión celular en la parte superior y se centrifuga a 800 xg durante 20 min a TA (sin freno).
- Los posibles resultados ver la figura 1: Ser más denso que Biocoll, las células rojas de la sangre de sedimentos a la parte inferior, mientras que las células madre mesenquimales de PBMC y se mantienen en la interfaz.
- Retire con cuidado la interfaz en un tubo de 15 ml y lavar con 5 ml de PBS.
- Se centrifuga como se describe en el paso 22, resuspender en 5 ml de PBS y repetir 2 a 3 veces.
- A continuación, se centrifuga de nuevo a 350 xg durante 10 min a TA (con freno).
- Resuspender en 10 ml de medio y contar las células en un hemocitómetro.
- Células de la placa en una densidad inicial de siembra de aproximadamente 5 x 10 6 en platos de 150 mm.
- Después de 2-3 días, vuelva amover las células no adherentes. Puede que tenga que enjuagar con PBS primero con el fin de eliminar los restos celulares. Añadir medio completo fresco (DMEM + 10% suero de ternera fetal (FCS) + 1% Pen / Strep) después.
- Alimentar a las células cada 3-4 días (Figura 2).
- Después de 5-10 días, el paso de las células, por primera vez.
C. Preparación de coágulos de fibrina in vitro
- En el día de la implantación, liberar las células adherentes de matraces / platos por una exposición de 3 min-al 0,25% de tripsina-EDTA. Detener tripsinización mediante la adición de medio completo.
- Distribuir las células en un tubo de 50 ml Falcon y lavar dos veces con PBS.
- Determinar la viabilidad celular y números mediante tinción con azul tripán.
- Añadir 50,000 células / tubo de microcentrífuga y recoger gránulos mediante centrifugación a 500 xg durante 5 min a TA. Preparar una mezcla maestra para al menos un coágulo más según sea necesario.
- Resuspender el sedimento celular en 17 l de PBS y mezclar 25 l de la componente de fibrinógeno de TISSUCOL-Kit con esta suspensión MSC 17 l.
- Tome una placa estéril con agujeros pre-perforados (3x3.6 mm) de acuerdo a los agujeros de perforación en vivo (Figura 3).
- En primer lugar, inocular 4 l de solución de trombina (500 UI / ml) en un agujero, seguido de la adición inmediata de 42 l de fibrinógeno-suspensión de células y de nuevo 4 l de solución de trombina en la parte superior. No mezcle la suspensión para evitar la coagulación de la punta de la pipeta. En primer lugar, el volumen de 50 l del fibrinógeno-suspensión celular pipeteado sobresaldrá del borde de los agujeros previamente perforados sin fundir debido a la tensión superficial. Sin embargo, después de la coagulación completa (después de 60 min) el coágulo se contrae y se ajusta en el orificio previamente perforado.
- Retire el coágulo con cuidado unas pinzas romas y colocar en un tubo de microcentrífuga con PBS. Preparar 2 coágulos / animal.
- Tome los coágulos a la sala de cirugía.
D. La implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina
- Inducir la anestesia para conejo (NZW, macho, 3,5-4,0 kg de peso corporal, de 5-6 meses de edad) mediante inyección iv de propofol (10 mg / kg de peso corporal).
- Afeitado de la rodilla para ser operado con una maquinilla eléctrica y el vacío de la piel. Todos los procedimientos mencionados antes se llevan a cabo en una sala de preparación de la cirugía para evitar la contaminación del medio ambiente estéril de la sala de operaciones.
- Después de la intubación, mantener la anestesia con 1,5 mg / kg / min propofol y 0,05 mg / kg / min de fentanilo por vía intravenosa. Supervisar la anestesia mediante capnografía, pulsioximetría y el pulso.
- Desinfectar la rodilla afeitado a fondo y cubrir el resto de conejo con un apósito estéril.
- Palpar la rótula y realizar una incisión medial de la rótula.
- Abra la articulación de la rodilla por una artrotomía parapatelar medial en condiciones estériles. Trate de evitar el corte de los pequeños vasos sanguíneos superficiales.
- Plegar la rótula lateralmente (Figura 4).
- Después de Inspección de la articulación de la rodilla de las lesiones del cartílago concomitantes o anomalías conjuntas, crear dos defectos osteocondrales (3 mm de profundidad, la figura en forma de ocho) en el surco troclear con un taladro eléctrico operativo aire estéril (3,6 mm de diámetro) con un stop-dispositivo (Figura 5).
- Limpie los defectos y enjuague con solución salina estéril.
- Antes de la implantación, llenar 20 l de la cola de fibrina en los defectos y distribuirlas uniformemente sobre la parte inferior del defecto.
- Entonces implantar los coágulos ajustado a presión en el defecto de la figura en forma de ocho.
- Después de la coagulación, la ubicación de la rótula en el surco troclear y doblar y estirar la rodilla un par de veces.
- Desplazar la rótula lateralmente una vez más y comprobar si las células fibrinógeno-coágulos son todavía en su lugar.
- Vuelva a colocar la rótula de nuevo y terminar la operación con el cierre de heridas en capas con suturas solo botón (4-0 Vicryl) y una sutura cutánea continua (4-0 Monocryl) (ambos con sutura absorbiblemateriales).
- Por último, sellar la herida con un apósito de pulverización permeable al vapor de agua.
- Para el cuidado post-operatorio, la herida se comprueba al día durante 7 días. Los conejos reciben para la analgesia postoperatoria carprofeno 4 mg / kg por vía subcutánea cada 24 horas (durante 4 días) y buprenorfina 0,03 mg / kg sc cada 12 h (durante 2,5 días). Una estabilización de la rodilla (por ejemplo, vendaje) no es necesario.
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Representative Results
La técnica quirúrgica descrita permite un éxito en el aislamiento y la implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en un defecto osteocondral artificial. La configuración experimental dio como resultado una integración con éxito del implante en el cartílago circundante.
El defecto fue ocupado por tejido de reparación con propiedades biomecánicas similares y durabilidad similares en comparación con el cartílago circundante. La fibrina-célula-coágulo se preparó in vitro en una placa estéril con los agujeros previamente perforados, que tenían el mismo tamaño que el defecto osteocondral (Figura 3). Como resultado, no hubo hendiduras entre el coágulo de fibrina implantado y el cartílago circundante, lo que sería un factor de riesgo para la degeneración prematura o delaminación (Figura 6). Una curación basal del tejido de reparación se garantiza porque el hueso subcondral se penetró, y por lo tanto trabajó en contra de un cizallamiento. Otro aspecto importante fue la stiffness del tejido de reparación, que debe coincidir con el tejido sano que rodea el cartílago para evitar un aumento de la carga sobre el mismo y una posible degeneración prematura. En nuestros experimentos preliminares (datos no presentados), se demostró que después de 12 semanas ya se podría lograr una rigidez suficiente. Por otra parte, se encontró una superficie intacta y homogénea del trasplante, lo que reduce el estrés de cizallamiento y posible daño del implante (Figura 6).
Figura 1. La separación de células de la sangre y del plasma de las PBMC y las MSC usando Biocoll Solución separación.
Figura 2. Monocapa de células madre mesenquimales (conejo de Nueva Zelanda Blanco) después de 5 días en cultivo.
Figura 3. Placa estéril con agujeros pre-perforados (3x3.6 mm) de la parte superior que se está lleno de una fibrina por células coágulo.
La Figura 4. Inaugurado articulación de la rodilla después de parapatelar artrotomía medial.
Figura 5. Defectos osteocondrales (3 mm de profundidad, 3 mm de diámetro, la figura en forma de ocho) en el surco troclear.
La Figura 6. Abierto articulación de la rodilla 12 semanas después de la implantación de dos de fibrina por células coágulos en dos defectos osteocondrales perforados.
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Discussion
En los últimos años, la posibilidad de tratar complejas articulares defectos osteocondrales - tales como las derivadas de la osteocondritis disecante, osteonecrosis y trauma - con los enfoques de ingeniería de tejidos se hizo más y más atractivo. En las entidades patológicas mencionadas anteriormente, daño a los tejidos se extiende al hueso subcondral y consiste en dos tejidos que se caracterizan por diferentes capacidades curativas intrínsecas 1. Hay un creciente interés en el papel del hueso subcondral para los procesos patogénicos de daño articular osteocondral 11,23. Las condiciones funcionales del cartílago articular y el hueso de soporte están estrechamente conectados. Las lesiones de tejido ya sea afectan negativamente al medio ambiente mecánico, así como el equilibrio homeostático de toda la articulación 24. Las alteraciones en la unidad a través de osteocondral rotura mecánica del movimiento articular, formación de cuerpos sueltos, desgaste mecánico en el compartimento en cuestión y el desgaste desuperficies opuestas puede dar lugar a un inicio más temprano y el desarrollo de la osteoartritis 1,11. Por lo tanto, los enfoques de ingeniería de tejidos para la regeneración de defectos osteocondrales deben ir acompañadas de una restauración adecuada del hueso subcondral subyacente con el fin de mejorar la unión efectiva con los tejidos circundantes de acogida 2. Las células madre mesenquimales parecen ser una fuente ideal de células para proporcionar estos requisitos específicos de reparación osteocondral. El protocolo pone de relieve la promoción de hueso y la restauración de tejido de cartílago mediante la posibilidad de inducir la diferenciación selectiva de las células madre mesenquimales trasplantados en linajes osteogénicos y condrogénica.
En comparación con condrocitos, células madre mesenquimales tienen varias ventajas importantes: que pueden ser fácilmente aisladas de la médula ósea, y el tejido Synovialis grasa sin ningún mayor morbilidad lado de los donantes. Las células madre mesenquimales no diferencian durante la expansión in vitro ypor lo tanto, puede ser la cultura-ampliado en gran número para tratar grandes defectos del cartílago articular. Por otra parte, parecen ser inmunosupresor y - en respuesta a los estímulos apropiados - pueden diferenciarse en condrocitos y osteocitos 25,26. Otra ventaja notable de las células madre mesenquimales muestra su hypoimmunity, lo que significa que las células madre mesenquimatosas alogénicas pueden utilizarse sin ningún signo de reacción de rechazo 27. Por lo tanto, una célula-de la piscina de uno o dos animales donantes puede ser suficiente para todos los experimentos. Esto reduce el tiempo de funcionamiento y daños adicionales a los animales.
Varios experimentos mostraron resultados prometedores con cola de fibrina para la reparación osteocondral 19,20. Por lo general, la inoculación del fibrinógeno-suspensión celular con una solución de trombina ha sido descrito como un procedimiento que se realiza in situ, directamente en las lesiones osteocondrales artificiales. Después de un corto período de tiempo de pre-coagulación (después de unos pocos minutos) La operación es por lo general terminó mediante la reubicación de la rótula y el cierre de la herida.
En varias pruebas piloto, nos enteramos de que suficiente para la coagulación de la fibrina por células suspensión se tarda más de 60 minutos in situ -. Durante la operación - que casi no se puede esperar más de 60 minutos para la coagulación de la totalidad. Por otra parte, mediante el uso de una placa estéril con los agujeros previamente perforados que simulen las lesiones osteocondrales, fue posible mostrar que la cantidad de pegamento de fibrina, que se utilizó para llenar completamente el defecto, obviamente, no fue suficiente debido a la contracción del coágulo de endurecimiento . Esto requiere un mayor volumen de la cola de fibrina con antelación con el fin de conseguir un llenado congruente y completa del defecto. Realización de la preparación del coágulo in vitro es posible ajustar fácilmente la forma de construcción con el tamaño apropiado del defecto taladrado y por lo tanto, rellenar el defecto osteocondral totalmente y congruente.
Además, unan in vitro de preparación de los coágulos de células evita una fuga del adhesivo, pero (después de sólo unos pocos minutos) no totalmente endurecida de fibrina-suspensión celular. Por lo tanto, se puede garantizar que el volumen destinado inicialmente se quedará en el defecto y se iniciará con la integración del cartílago y remodelación.
La técnica descrita permite un método estandarizado para la investigación experimental de células madre en el campo de la reparación osteocondral. El protocolo proporciona una manera reproducible para aislar las células madre mesenquimales con el fin de volver a implantar posteriormente en defectos osteocondrales de cartílago de articulación de la rodilla del conejo. Condrocitos autólogos ya se han implantado en defectos osteocondrales en un fibrina-célula-modelo 19. El uso de un modelo in vitro de la preparación de coágulo, así como las células madre mesenquimales en lugar de condrocitos en que parece ser un nuevo enfoque más ventajoso y prometedor para la remodelación y reparación de lesiones osteocondrales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por la Asociación Alemana de Investigación (subvención Excmo 4578/3-1) y en parte por el FP7 de la UE-Proyecto "GAMBA" NMP3-SL-2010 hasta 245.993.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
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