Summary
Een experimentele techniek voor de behandeling van osteochondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van allogene mesenchymale stamcellen in osteochondrale defecten heeft een veelbelovende ontwikkeling op het gebied van weefsel engineering. De voorbereiding van fibrine-cel-stolsels
Protocol
A. Bereiding van een Donor Konijn voor de isolatie van mesenchymale stamcellen (Chirurgie Kamer)
- Cellen geïsoleerd uit mannelijke New Zealand White (NZW) konijnen op de leeftijd van 4 maanden en ongeveer 3 kg lichaamsgewicht.
- Induceren anesthesie met propofol (10 mg / kg lichaamsgewicht iv) en offeren met natrium pentobarbital (100 mg / kg lichaamsgewicht iv).
- Scheren bont van achterste ledematen, rug en buik met een elektrische tondeuse en stofzuigen van de vacht.
- Ontsmet het geschoren gebied grondig met 70% ethanol.
- Gebruik stompe tang, scherpe schaar (of scalpel) en bot snijders voor weefsels en ligamenten.
- Maak een insnijding langs het craniale oppervlak van het been en kuit.
- Weerspiegelen de huid en onderhuids weefsel door een scherpe of stompe dissectie.
- Afzonderlijke spieren en ligamenten van scheenbeen en dijbeen. Houd delen zo dicht mogelijk bij de bot mogelijk een schone dissectie maken. Heb femur niet scheiden van tibia op dit moment.
- Snijd thrdoorgedreven het heupgewricht van de kop van het dijbeen te scheiden van het acetabulum.
- Verheffen de scheenbeen-dijbeen complex.
- Gebruik de scalpel af te schrapen de resterende zacht weefsel uit de botten of wrijf de botten met een steriele doek weefsels. Op dit punt worden femur en tibia nog aangesloten.
- Verwijder de patella door snijden, snijd kniegewricht ligamenten aan afzonderlijke botten eindelijk.
- Spray gescheiden botten met 70% ethanol, laten drogen aan de lucht en leg elk bot in een centrifugebuis van 50 ml met celkweek medium (DMEM + 1% penicilline / streptomycine (Pen / Strep)) om ze vochtig te houden.
- Schakel nu onder een steriele celkweek laminaire stroming kap.
B. Spoelen van Konijn MSC uit Bones en Expansion (Cell Culture Hood)
- Verzamel botten van buizen en plaats ze in 150 mm gerechten met een steriel pincet.
- Verwijder beide bot eindigt met een steriele zaag en beweging stukken om nieuwe 150 mm gerechten.
- Vul een 10 ml spuit met medium (DMEM), bevestig een 18 gauge naald en steek in de opening van het beenmerg.
- Vervolgens afspoelen mergholte met medium tot het beenmerg te spoelen in de schaal. Spoel daarna aan de andere kant, indien mogelijk. Indien nodig, zag meer af van de uiteinden. Als het bot breekt, net spoel de binnenkant van het bot.
- Aspireren cel medium suspensie in de injectiespuit en spoel het beenmerg herhaaldelijk tot schorsing is vrij zwevend door het beenmerg holte en geen verdere beenmerg-stolsels verschijnen.
- Zodra beenmerg is verzameld uit alle beenderen, verstoren het merg bosjes door het passeren door een 18 gauge naald: vul spuit met naald bevestigd en dwingen uit in medium.
- Daarna, filteren de suspensie door een cel filter in een 50 ml buis. Om cel verlies te voorkomen, wast cultuur schotel 2x met 10 ml medium en filteren ook.
- Centrifugeer suspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder supernatant en resuspendeer cellen Pellet in 10 ml medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Afzonderlijke bloedcellen uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en mesenchymale stamcellen (MSC) met een Biocoll scheiden oplossing.
- Vul 5 ml Biocoll scheiden oplossing in een 15 ml buis en voorzichtig 5 ml van de celsuspensie geplaatst en centrifugeer bij 800 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (zonder rem).
- Mogelijke resultaten zie Figuur 1: Being dichter dan Biocoll, rode bloedcellen sediment op de bodem, terwijl PBMC en mesenchymale stamcellen blijven op de interface.
- Verwijder voorzichtig interface in een 15 ml buis en was met 5 ml PBS.
- Centrifuge zoals beschreven in stap 22, resuspendeer in 5 ml PBS en opnieuw 2-3x.
- Vervolgens Centrifugeer opnieuw bij 350 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur (met rem).
- Resuspendeer in 10 ml medium en cellen tellen in een hemocytometer.
- Plaat cellen op een eerste seeding dichtheid van ongeveer 5 x 10 6 in 150 mm gerechten.
- Na 2-3 dagen, opnieuwbewegen niet-hechtende cellen. Je zou kunnen hebben om te spoelen met PBS als eerste in om cel vuil te verwijderen. Voeg vers compleet medium (DMEM + 10% foetaal kalf serum (FCS) + 1% Pen / Strep) achteraf.
- Voeden cellen om de 3-4 dagen (Figuur 2).
- Na 5-10 dagen, passage van de cellen voor het eerst.
C. Bereiding van fibrine stolsels in vitro
- Op de dag van implantatie los hechtende cellen uit flessen / borden door een 3 min blootstelling aan 0,25% trypsine-EDTA. Stoppen door toevoeging van trypsine volledig medium.
- Verdeel cellen in een 50 ml Falcon buis en tweemaal wassen met PBS.
- Bepalen levensvatbaarheid van de cellen en getallen door trypaanblauw kleuring.
- Voeg 50.000 cellen / microcentrifugebuis en laat pellets door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid een mastermix gedurende minstens een stolsel als nodig.
- Resuspendeer de cel pellet in 17 ul PBS en meng 25 pl van het fibrinogeen component van TISSUCOL-kit met deze 17 pi MSC schorsing.
- Neem een steriele plaat met voorgeboorde gaten (3x3.6 mm) in overeenstemming met de boorgaten in vivo (figuur 3).
- Eerst inoculeren 4 pi trombine-oplossing (500 IU / ml) in een gat, gevolgd door onmiddellijke toevoeging van 42 pi fibrinogeen-celsuspensie weer 4 ul trombine-oplossing geplaatst. Gebruik de suspensie om stolling in de pipet tip vermijden door elkaar. Eerst zal de 50 gl volume van het pipetted fibrinogeen-celsuspensie de rand van de voorgeboorde gaten steken zonder te smelten door de oppervlaktespanning. Echter, na volledige stolling (na 60 min) het stolsel krimpt en past in het voorgeboorde gat.
- Verwijder het stolsel voorzichtig met een stompe pincet en plaats in een microcentrifugebuis met PBS. Bereid 2 stolsels / dier.
- Neem de stolsels op de operatie kamer.
D. Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels
- Induceren anesthesie konijn (NZW, mannetje, 3,5-4,0 kg lichaamsgewicht, 5-6 maanden oud) door iv injectie van propofol (10 mg / kg lichaamsgewicht).
- Scheer de knie te worden geopereerd met een elektrische tondeuse en vacuüm de vacht. Alle genoemde voordat procedures worden uitgevoerd in een operatie voorbereiding kamer om contaminatie van de steriele omgeving van de operatiekamer te voorkomen.
- Na intubatie onderhouden anesthesie met 1,5 mg / kg / min propofol en 0,05 mg / kg / min intraveneus fentanyl. Monitor anesthesie met behulp van capnografie, pulsoxymetrie en hartslag.
- Ontsmet de geschoren knie grondig en hebben betrekking op de rest van konijn met een steriel verband.
- Palperen de knieschijf en het uitvoeren van een huid incisie mediaal van de patella.
- Open het kniegewricht door een mediale parapatellaire arthrotomie onder steriele omstandigheden. Probeer te vermijden dat eventuele kleine oppervlakkige bloedvaten.
- Verplaats de knieschijf lateraal (figuur 4).
- Na InSpectie van het kniegewricht voor enige gelijktijdige kraakbeenletsels of gezamenlijke afwijkingen, maken twee osteochondrale defecten (3 mm diep, cijfer acht-vormige) in de trochlear groef met een steriele lucht werkende boormachine (3,6 mm diameter) met een stop-apparaat (Figuur 5).
- Reinig de gebreken en spoel ze met een steriele zoutoplossing.
- Vóór implantatie vullen 20 gl fibrinelijm in de gebreken en gelijkmatig op de bodem van het defect te distribueren.
- Implanteren dan de stolsels perspassing in het cijfer acht-vormige defect.
- Na stolling, verplaats de patella in de trochlear groove en buigen en strekken van de knie een paar keer.
- Verplaats de knieschijf lateraal nogmaals en kijk of fibrinogeen-cell-stolsels zijn nog steeds op hun plaats.
- Vervang de knieschijf weer en eindigen de bediening met wondsluiting in lagen met enkele knop hechtingen (4-0 Vicryl) en een continue cutane hechting (4-0 Monocryl) (beide met absorbeerbare hechtdraadmateriaal).
- Ten slotte sluit de wond met een spray dressing waterdampdoorlatend.
- Voor post-operatieve zorg, wordt de wond dagelijks gecontroleerd gedurende 7 dagen. De konijnen krijgen voor post-operatieve analgesie Carprofen 4 mg / kg sc elke 24 uur (4 dagen) en buprenorfine 0.03 mg / kg sc elke 12 uur (2,5 dagen). Een stabilisering van de knie (bijv. dressing) niet nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven chirurgische techniek maakt een succesvolle isolatie en implantatie van allogene mesenchymale stamcellen in een kunstmatige osteochondrale defecten. De experimentele opstelling geleid tot een succesvolle integratie van het implantaat in de omringende kraakbeen.
Het defect werd opgevuld door herstelweefsel met gelijkaardige biomechanische eigenschappen en soortgelijke duurzaamheid in vergelijking met de omliggende kraakbeen. De fibrine-stolsel cel werd bereid in vitro op een steriele plaat met voorgeboorde gaten, die dezelfde afmeting heeft als de osteochondrale defecten (figuur 3). Dientengevolge, waren er geen spleten tussen de geïmplanteerde fibrine klonter en het omringende kraakbeen, die een risicofactor voor premature degeneratie of delaminatie (figuur 6) zijn. Een basale genezing van het herstelweefsel is gewaarborgd doordat het subchondrale bot doorgedrongen en dus werkte tegen afschuiving. Een ander belangrijk aspect was de stiffness van de reparatie weefsel, dat moet overeenkomen met het omliggende gezonde kraakbeenweefsel tot een verhoogde belasting op het en een eventuele voortijdige degeneratie te voorkomen. In onze inleidende experimenten (gegevens niet getoond) werd aangetoond dat na 12 weken een voldoende stijfheid kan reeds worden bereikt. Bovendien is een intact en homogeen oppervlak van het transplantaat werd gevonden, dat afschuifspanning en mogelijke schade implantaat (Figuur 6) verminderd.
Figuur 1. Scheiding van bloedcellen en plasma uit PBMC's en MSC's met Biocoll scheiden Solution.
Figuur 2. Monolaag van mesenchymale stamcellen (New Zealand White rabbit) na 5 dagen in kweek.
Figuur 3. Steriele plaat met voorgeboorde gaten (3x3.6 mm) boven een wordt gevuld met een fibrine-cel-stolsel.
Figuur 4. Geopend kniegewricht na mediale parapatellaire arthrotomie.
Figuur 5. Osteochondrale defecten (3 mm diep, 3 mm in diameter, cijfer acht-vormige) in de trochlear groef.
Figuur 6. Geopend kniegewricht 12 weken na de implantatie van twee fibrine-cell-stolsels in twee geboorde osteochondrale gebreken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren, de mogelijkheid van behandeling van complexe articulaire osteochondrale gebreken - zoals die welke voortvloeien uit osteochondritis dissecans, osteonecrose en trauma - met Tissue Engineering aanpak werd steeds aantrekkelijker. In de eerder genoemde pathologische entiteiten, weefselschade uitstrekt tot het subchondrale bot en omvat twee weefsels gekenmerkt door verschillende intrinsieke vermogen om te genezen 1. Er is een toenemende belangstelling voor de rol van het subchondrale bot voor de pathogene processen van osteochondraal articulaire beschadigingen 11,23. De functionele voorwaarden van het gewrichtskraakbeen en de ondersteunende bot zijn nauw verbonden. Letsel van weefsel hetzij negatieve invloed op de mechanische omgeving en de homeostatische balans van het gehele gewricht 24. Wijzigingen in de osteochondraal unit door mechanische verstoring van de gezamenlijke ontwerpresolutie, losse body vorming, mechanische slijtage in het betrokken compartiment en het verloop vantegenoverliggende oppervlakken kan leiden tot een vroeger begin en de ontwikkeling van osteoartritis 1,11. Daarom moet tissue engineering benaderingen voor de regeneratie van osteochondrale gebreken gepaard gaan met een adequaat herstel van het onderliggende subchondrale bot om de effectieve unie te versterken met omringende gastheerweefsels 2. Mesenchymale stamcellen lijkt een ideale celbron deze specifieke vereisten van osteochondrale herstel verschaffen. Het protocol benadrukt de promotie van bot-en kraakbeenweefsel restauratie door potentieel induceren van de selectieve differentiatie van de getransplanteerde mesenchymale stamcellen in osteogene en chondrogene geslachten.
In vergelijking met chondrocyten, mesenchymale stamcellen aantal belangrijke voordelen: ze gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd uit beenmerg, synovialis en vetweefsel zonder meer donorkant morbiditeit. Mesenchymale stamcellen niet differentiëren tijdens in vitro expansie enkan derhalve cultuur geëxpandeerd in grote aantallen grote kraakbeenletsels te behandelen. Bovendien, ze lijken te zijn immunosuppressieve en - in reactie op de juiste stimuli - kunnen differentiëren tot chondrocyten en osteocyten 25,26. Een ander opmerkelijk voordeel van mesenchymale stamcellen toont de hypoimmunity, waardoor allogeneïsche mesenchymale stamcellen kunnen worden gebruikt zonder enig teken van afstotingsreactie 27. Daarom kan een cel-pool van een of twee donordieren voldoende voor alle experimenten. Dit vermindert werkingsduur en andere schade aan de dieren.
Verschillende experimenten toonden veelbelovende resultaten met behulp van fibrine lijm voor osteochondrale reparatie 19,20. Gewoonlijk is de enting van de fibrinogeen-cel-suspensie met trombine oplossing is beschreven als een werkwijze uitgevoerd in situ, direct in de kunstmatige osteochondrale lesies. Na een korte tijd van de pre-stolling (na enkele minuten) De operatie wordt meestal afgewerkt door de verplaatsing van de patella en wondsluiting.
In een aantal proefprojecten, kwamen we erachter dat voor voldoende stolling van de fibrine-cel-suspensie duurt het meer dan 60 min In situ -. Tijdens de operatie - het nauwelijks mogelijk is om te wachten meer dan 60 minuten voor de hele bloedstolling. Bovendien, door gebruik van een steriele plaat met voorgeboorde gaten simuleert de osteochondrale lesies was het mogelijk aan te tonen dat de hoeveelheid fibrine lijm, die werd gebruikt om duidelijk volledig vullen van het defect was niet voldoende vanwege krimpen van de uitharding stolsel . Dit vereist een groter volume fibrinelijm vooraf om een congruent en volledige vulling van het defect bereikt. Het uitvoeren van de bereiding van het stolsel in vitro is het mogelijk om het construct shape gemakkelijk aanpassen om de juiste grootte van de geboorde gebrek en daarom komt de osteochondrale gebrek totaal en congruent.
Bovendien, eenn in vitro bereiding van de cel bloedstolsels voorkomt lekkage van de kleefstof maar (na enkele minuten) niet volledig verharde fibrine-celsuspensie. Daarom kan worden gegarandeerd dat de oorspronkelijk beoogde volume blijft in het defect en zal beginnen met het kraakbeen integratie en remodeling.
De beschreven techniek maakt het mogelijk een gestandaardiseerde methode voor experimentele stamcel onderzoek op het gebied van osteochondrale reparatie. Het protocol voorziet in een reproduceerbare manier om mesenchymale stamcellen te isoleren, om opnieuw te implanteren ze later in osteochondral kraakbeenletsels van het konijn kniegewricht. Autologe chondrocyten zijn al geïmplanteerd in osteochondraal defecten in een fibrine-cell-model 19. Met behulp van een in vitro-model van stolsel voorbereiding als mesenchymale stamcellen plaats van chondrocyten lijkt een voordeliger en veelbelovende nieuwe benadering voor renovatie en reparatie van osteochondrale laesies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de Duitse Research Association (subsidie HE 4578/3-1) en deels door het FP7 EU-Project "GAMBA" NMP3-SL-2010-245993.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al. Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 28, 116-124 (2010).
- Hangody, L., et al. Autologous osteochondral grafting--technique and long-term results. Injury. 39, 32-39 (2008).
- Marcacci, M., et al. Arthroscopic autologous osteochondral grafting for cartilage defects of the knee: prospective study results at a minimum 7-year follow-up. The American Journal of Sports Medicine. 35, 2014-2021 (2007).
- Ochs, B. G., et al. Remodeling of articular cartilage and subchondral bone after bone grafting and matrix-associated autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee. The American Journal of Sports Medicine. 39, 764-773 (2011).
- Aurich, M., et al. Autologous chondrocyte transplantation by the sandwich technique. A salvage procedure for osteochondritis dissecans of the knee. Unfallchirurg. 110, 176-179 (2007).
- Williams, R. J. 3rd, Ranawat, A. S., Potter, H. G., Carter, T., Warren, R. F. Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 89, 718-726 (2007).
- Szerb, I., Hangody, L., Duska, Z., Kaposi, N. P. Mosaicplasty: long-term follow-up. Bull. Hosp. Jt. Dis. 63, 54-62 (2005).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Gomoll, A. H., et al. The subchondral bone in articular cartilage repair: current problems in the surgical management. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 434-447 (2010).
- Steinhagen, J., et al. Treatment of osteochondritis dissecans of the femoral condyle with autologous bone grafts and matrix-supported autologous chondrocytes. Int. Orthop. 34, 819-825 (2010).
- Guo, X., et al. Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model. Tissue Eng. 10, 1818-1829 (2004).
- Centeno, C. J., et al. Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells. Pain Physician. 11, 343-353 (2008).
- Niederauer, G. G., et al. Evaluation of multiphase implants for repair of focal osteochondral defects in goats. Biomaterials. 21, 2561-2574 (2000).
- Nagura, I., et al. Repair of osteochondral defects with a new porous synthetic polymer scaffold. J. Bone. Joint Surg. Br. 89, 258-264 (2007).
- Schlichting, K., et al. Influence of scaffold stiffness on subchondral bone and subsequent cartilage regeneration in an ovine model of osteochondral defect healing. The American Journal of Sports Medicine. 36, 2379-2391 (2008).
- Schagemann, J. C., et al. Cell-laden and cell-free biopolymer hydrogel for the treatment of osteochondral defects in a sheep model. Tissue Engineering. Part A. 15, 75-82 (2009).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Schillinger, U., et al. A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors. Pharm. Res. 25, 2946-2962 (2008).
- Ahmed, T. A., Giulivi, A., Griffith, M., Hincke, M. Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute. Tissue Engineering. Part A. 17, 323-335 (2011).
- Haleem, A. M., et al. The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results. Cartilage. 1, 253-261 (2010).
- Pape, D., Filardo, G., Kon, E., van Dijk, C. N., Madry, H. Disease-specific clinical problems associated with the subchondral bone. Knee Surg Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 448-462 (2010).
- Shirazi, R., Shirazi-Adl, A. Computational biomechanics of articular cartilage of human knee joint: effect of osteochondral defects. Journal of Biomechanics. 42, 2458-2465 (2009).
- Jorgensen, C., Gordeladze, J., Noel, D. Tissue Engineering through autologous mesenchymal stem cells. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 406-410 (2004).
- Chen, F. H., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cells in arthritic diseases. Arthritis Res. Ther. 10, 223 (2008).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 31, 890-896 (2003).
