En eksperimentel teknik til behandling af osteochondrale defekter i kaninens knæled beskrives. Implantation af allogene mesenkymale stamceller i osteochondrale defekter giver en lovende udvikling inden for tissue engineering. Fremstillingen af fibrin-celle-blodpropper<em> In vitro</em> Tilbyder en standardiseret metode til implantation.
Behandlingen af osteochondrale artikulær fejl har været en udfordring læger i mange år. En bedre forståelse af samspillet mellem ledbrusk og subchondral knogle i de senere år ført til en øget opmærksomhed på restaurering af hele osteochondralt enheden. I forhold til chondral læsioner regenerering af osteochondrale defekter er langt mere kompleks og et langt større kirurgisk og terapeutisk udfordring. Det beskadigede væv omfatter ikke kun den overfladiske brusk lag, men også den subchondral knogle. For dyb, osteochondralt skader, som det forekommer for eksempel med osteochondrose dissecans den fulde tykkelse af defekten skal udskiftes for at genoprette den fælles overflade 1. Kvalificerede terapeutiske procedurer nødt til at overveje disse to forskellige væv med deres forskellige iboende helbredende potentiale 2.. I de seneste årtier har flere kirurgiske behandlingsmuligheder opstået og har allerede blevet klinisk etableret 3 –6..
Autologe eller allogene osteochondrale transplantater består af ledbrusken og subchondral knogle og tillade udskiftning af hele osteochondralt enhed. Manglerne er fyldt med cylindriske osteochondrale podninger, der har til formål at give en kongruent hyalinbrusk dækket flade 3,7,8. Ulemperne er den begrænsede mængde af tilgængelige poder, donor site morbiditet (for autologe transplantationer), og inkongruens af overfladen og derved anvendelsen af denne metode er særligt begrænset til store defekter.
Nye tilgange inden for tissue engineering åbnet lovende muligheder for regenerativ osteochondral terapi. Implantation af autologe chondrocytter markerede den første celle baseret biologisk metode til behandling af fuld tykkelse brusklæsioner og er nu på verdensplan etableret med gode kliniske resultater, selv 10 og 20 år efter implantation 9,10. Men date, denne teknik er ikke egnet til behandling af alle typer af læsioner, såsom dybe defekter involverer subchondral knogle 11..
Sandwich-teknik kombinerer knogletransplantation med nuværende tilgange i Tissue Engineering 5,6. Denne kombination synes at være i stand til at overvinde de begrænsninger, set i osteochondrale transplantater alene. Efter autolog knogletransplantation til subchondral defekt område, er en membran podes med autologe chondrocytter sutureres ovenfor og letter at matche topologi af implantatet med den beskadigede sted. Selvfølgelig skal den tidligere knoglerekonstruktion ekstra kirurgisk tid og ofte endda en ekstra operation. Hertil kommer, at dato er langsigtede data mangler 12.
Tissue Engineering uden yderligere knogletransplantation formål at genoprette den komplekse struktur og egenskaber af nativ ledbrusk ved chondrogen og osteogene potentiale af de transplanterede celler. However, igen, er det normalt kun brusk væv, der er mere eller mindre regenereres. Yderligere osteochondral skade har brug for en specifik yderligere behandling. For at opnå en regenerering af flerlagsstruktur af osteochondrale defekter, tredimensionale manipuleret væv podet med autologe / allogene celler kan give en god regenerationskapacitet 11.
Udover autologe chondrocytter, synes mesenkymale stamceller (MSC) for at være et attraktivt alternativ til udvikling af en fuld tykkelse bruskvæv. I talrige prækliniske in vitro og in vivo studier har mesenkymale stamceller viste fremragende vævsregeneration potentiale 13,14. Den vigtigste fordel ved mesenkymale stamceller især til behandling af osteochondrale defekter er, at de har kapacitet til at differentiere i osteocytter samt chondrocytter. Derfor er de potentielt give et flerlaget revitalisering af dindvirket.
I de senere år har flere stilladser med osteochondral regenerativ potentiale derfor blevet udviklet og evalueret med lovende foreløbige resultater 1,15-18. Endvidere fibrinklæber som en celle bærer blev en af de foretrukne teknikker i eksperimentel brusk reparation og er allerede med held blevet anvendt i adskillige dyrestudier 19-21 og endda første menneskelige forsøg 22.
Følgende protokol vil demonstrere en eksperimentel teknik til isolering af mesenkymale stamceller fra en kanin knoglemarv, til efterfølgende proliferation i cellekultur og til fremstilling af en standardiseret in vitro-model for fibrin-Cell-blodpropper. Endelig vil en teknik til implantering af forud fastsatte fibrin-celle-blodpropper i kunstige osteochondrale defekter i kaninens knæled blive beskrevet.
I de seneste år, muligheden for at behandle komplekse artikulær osteochondrale defekter – blev med Tissue Engineering tilgange mere og mere attraktiv – såsom dem, der skyldes osteochondritis dissecans, osteonekrose og traumer. I de tidligere nævnte patologiske enheder, udvider vævsskader subchondral knogle og involverer to væv er kendetegnet ved forskellige iboende helbredende kapacitet 1.. Der er en stigende interesse i rollen som subchondral knogle for patogene processer osteochondral artikulær skade…
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af den tyske Research Association (tilskud HE 4578/3-1), og delvist af FP7 EU-projekt "GAMBA" nMP3-SL-2010 til 245.993.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
Propofol | Fresenius Kabi | ||
Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
Scissors | Aesculap | ||
Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
Pipettes research | Eppendorf | ||
Bone Cutter | Aesculap | ||
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
Sterile saw | Aesculap | ||
Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
Air operated power drill | Aesculap | ||
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |