Summary
ウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。骨軟骨欠損に同種間葉系幹細胞の移植は、組織工学の分野で有望な開発を提供しています。フィブリン細胞塊の準備
Protocol
間葉系幹細胞の単離のためのドナーウサギのA.準備（手術室）
- 細胞はオス4ヶ月歳の時にニュージーランドホワイト（NZW）ウサギ、約3キロ体重から分離されています。
- プロポフォールで麻酔（10 mg / kg体重体重IV）を誘導し、ペントバルビタールナトリウム（100 mg / kg体重体重IV）を生け贄に捧げる。
- 電気クリッパー、真空毛皮で後肢、背中と腹から毛皮を剃る。
- 70％エタノールで完全に剃毛した領域を消毒する。
- 鈍鉗子、鋭いハサミ（またはメス）と組織や靭帯のための骨のカッターを使用してください。
- 足とふくらはぎの頭蓋の表面に沿って切開を行います。
- どちら鋭いまたは鈍的切開によって皮膚や皮下組織を反映しています。
- 脛骨と大腿骨とは別の筋肉や靭帯。きれいな解剖を行うことが可能のような骨の近くにカットしてください。この時点で脛骨から大腿骨を分離しないでください。
- THRをカットウワーッ寛骨臼から大腿骨頭を分離する股関節。
- 脛骨 - 大腿骨複合体を昇格。
- 骨から残りの軟部組織を掻きまたは滅菌布の組織と骨をこするように手術用メスの刃を使用します。この時点で、大腿骨および脛骨はまだ接続されている。
- 切断することにより膝蓋骨を外し、その後最終的に独立した骨に膝関節の靭帯を切った。
- スプレーは、空気が乾燥させ、70％エタノールで骨を分離し、それらの潤いを保つために、細胞培養培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン））で50 ml遠心チューブに各ボーンを配置。
- 今無菌細胞培養層流フードの下に切り替える。
骨と拡張からウサギMSCのフラッシュB.（細胞培養フッド）
- チューブからの骨を収集し、滅菌ピンセットを使用して150ミリメートル皿にそれらを配置します。
- 両方の骨を取り除き、新しい150ミリメートル皿に無菌のこぎり、移動部分で終わる。
- メディとを10mlの注射器を埋めるUM（DMEM）、18ゲージの針を取り付け、骨髄の開口部に挿入します。
- その後、皿に骨髄をフラッシュする媒体と骨髄腔をすすいでください。可能であればその後、もう一方の端からすすいでください。必要に応じて、両端から多くを見送った。骨が壊れるべき場合は、単に骨の内部をすすいでください。
- シリンジに細胞培地懸濁液を吸引除去し、サスペンションは骨髄腔と骨髄血栓が表示されない、さらに骨を通して自由に浮遊するまで繰り返し骨髄をすすいでください。
- 一度骨髄はすべて骨から収集された、18ゲージの針を通過することによって骨髄塊を乱す：針付属とシリンジを記入し、培地中に追い出す。
- その後、50ミリリットルチューブに細胞フィルターを通してサスペンションをフィルタリング。セル損失を防止するために10mlの培地で培養皿の2倍を洗浄し、同様にこむ。
- 室温で5分間、500×gでサスペンションを遠心分離。
- 清と再懸セルペルを削除らを10mlの培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）であった。
- Biocoll分離ソリューションを使用して、末梢血単核細胞（PBMC）及び間葉系幹細胞（MSC）から独立した血液細胞。
- を15mlチューブにBiocoll分離溶液5mlを記入し、慎重に室温で20分（ブレーキなし）のために800 xgで上部と遠心分離機に細胞懸濁液を5ミリリットルを追加します。
- PBMCと間葉系幹細胞は、界面でのままBiocoll、底まで赤血球堆積物よりも高密度であること：可能な結果は、 図1を参照してください。
- 慎重を15mlチューブにインターフェイスを削除し、5 mlのPBSで洗浄する。
- ステップ22で説明したように、遠心5ミリリットルのPBSに再懸と2〜3倍を繰り返す。
- その後、室温で10分（ブレーキ付）、350 xgで再び遠心。
- を10mlの培地に再懸濁し、血球のセルを数える。
- 150ミリメートルの皿で約5×10 6の初期の播種密度でプレート細胞。
- 2-3日後、再非接着細胞を移動します。あなたは、細胞の破片を除去するためにPBS最初ですすぎが必要になる場合があります。その後、新鮮な完全培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を追加する。
- 3〜4日ごとに（ 図2）の細胞を養う。
- 5-10日後、経過初めて細胞。
in vitroでフィブリン塊のC.の準備
- 移植の日には、0.25％トリプシン-EDTAに3分露出でフラスコ/皿から接着細胞を解放。完全培地を追加することで、トリプシン処理を停止します。
- 50ミリリットルファルコンチューブで細胞を配布し、PBSで2回、それらを洗ってください。
- トリパンブルー染色により細胞の生存と数字を決定します。
- 50,000細胞/マイクロ遠心チューブを追加し、室温で5分間、500×gで遠心分離によりペレットを収集します。必要に応じて、少なくとももう1つの塊のためにマスターミックスを準備します。
- 17μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、TISSUのフィブリノゲン成分を25μlのを混ぜてこの17μlのMSCサスペンションとCOL-キット。
- in vivoでのドリル穴（ 図3）に基づき、事前ドリル穴（3x3.6ミリ）で滅菌プレートを取る。
- まず、一番上に42μlのフィブリノゲン - 細胞懸濁し、再び4μlのトロンビン溶液の即時加え、続いて一つの穴の中に4μlのトロンビン溶液（500 IU / ml）を接種。ピペットチップ内凝固を避けるために、サスペンションを混在させないでください。まず、分取フィブリノーゲン細胞懸濁液50μlの体積は、表面張力により溶融せずにプレドリル穴の縁に突出します。しかし、完全に凝固した後（60分後）血栓は縮小していると事前ドリル穴に収まります。
- PBSでマイクロ遠心チューブに鈍鉗子と場所を使用して慎重に血栓を削除します。 2血栓/動物を準備します。
- 手術室に血栓を取る。
フィブリン塊における同種間葉系幹細胞のD.の移植
- プロポフォールの静脈注射（10 mg / kg体重）でウサギ（NZW、男性、3.5〜4.0キロの体重、5-6ヶ月）に麻酔を誘導する。
- 電気クリッパー、真空毛皮でログオン操作する膝を剃る。前に指定されたすべての手順は、手術室の無菌環境の汚染を避けるために手術の準備室で行われる。
- 挿管後、静脈内に1.5 mg / kg体重/分プロポフォール及び0.05 mg / kg体重/分フェンタニルで麻酔を維持します。カプノグラフィ、パルスオキシメトリと脈拍数を用いて麻酔を監視する。
- 徹底的に剃っているd膝を消毒、滅菌ドレッシングでウサギの残りの部分をカバーしています。
- 膝蓋骨を触診し、膝蓋骨に内側の皮膚切開を行います。
- 無菌条件下で内側parapatellar関節切開による膝関節を開きます。どんな小さな表在血管を切断しないようにしてください。
- （ 図4）横方向に膝蓋骨を置換。
- inspe後に任意の付随軟骨病変や関節の異常のために膝関節のctionは、ストップデバイスと無菌空気オペレーティングパワードリルと滑車溝に2つの骨軟骨欠損（ディープ3ミリメートル、8字型の図）（直径3.6ミリメートル）を作成（ 図5）。
- 欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水でそれらを洗い流してください。
- 移植の前に、欠陥にフィブリン糊の20μLを記入し、欠陥の底に均等に分配する。
- その後血栓フィギュア8字型欠陥に圧入植え込む。
- 凝固後、滑車溝内膝蓋骨を再配置し、数回曲げると膝を伸ばす。
- もう一度横膝蓋骨を置換し、フィブリノーゲン細胞塊の場所に残っているかどうかを確認します。
- 再び膝蓋骨を交換し、（両方吸収性縫合糸を持つ単一のボタン縫合（4-0 VICRYL）および連続皮膚縫合（4-0モノクリル）と層における創傷閉鎖で動作を終える材料）。
- 最後に、水蒸気透過性ドレッシングスプレーで傷を封印。
- 術後ケアのため、傷は7日間毎日チェックされます。ウサギは術後鎮痛カルプロフェン4 mg / kgを皮下毎24時間（4日間）とブプレノルフィン0.03 mg / kgを皮下毎12時間（2.5日間）のために受け取る。膝の安定化（ 例えばドレッシング）は必要ありません。
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Representative Results
記載の外科技術は、人工骨軟骨欠損部に同種間葉系幹細胞の単離及び移植の成功を可能にする。実験装置は、周囲の軟骨にインプラント統合の成功をもたらした。
欠陥が周囲の軟骨に比べて類似の生体力学的特性と類似した耐久性と修復組織で充填した。フィブリン血餅細胞が骨軟骨欠損（ 図3）と同じサイズを有していた事前ドリル穴を有する滅菌プレート上にインビトロで調製した。結果として、注入フィブリン塊、早期変性または層間剥離（ 図6）の危険因子であろう周囲の軟骨との間に裂け目はなかった。軟骨下骨を貫通し、したがって、せん断に対して働いていたので修復組織の基底治癒が確保されました。もう一つの重要な側面は、STIFだったその上に負荷が増大し、可能時期尚早変性を避けるために、健康な周囲の軟骨組織と一致している必要があり修復組織のfness。我々の予備実験（データは示していない）においては、12週間後に十分な剛性がすでに達成され得ることを示した。また、移植の無傷で均質表面をせん断応力と可能な注入損傷（ 図6）を低減する、発見された。
図1。 Biocoll分離ソリューションを使用したPBMCとMSCのから血液細胞と血漿の分離。
図2。文化の中で5日後の間葉系幹細胞（ニュージーランド白ウサギ）の単層。
図3。事前ドリル穴（3x3.6 mm）のフィブリン細胞塊で満たされている一番上のものと滅菌プレート。
図4。内側parapatellar関節切開後に膝関節を開いた。
図5。滑車溝に骨軟骨欠損（ディープ3ミリメートル、直径3mm、図8の形）。
図6。膝関節12週2掘削骨軟骨欠損に2フィブリン細胞塊の移植後に開かれた。
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Discussion
近年では、複雑な関節骨軟骨欠損治療の可能性 - そのような骨軟骨炎の離断、骨壊死や外傷に起因するものなどを - 組織工学的アプローチでは、ますます魅力的になりました。前述した病的なエンティティでは、組織の損傷は軟骨下骨に延びており、別の本質的な癒しの容量1によって特徴付けられる2組織が 含まれます。骨軟骨関節損傷11,23の病原性プロセスの軟骨下骨の役割に関心が高まっている。関節軟骨とそのサポート骨の機能的条件がしっかり接続されています。どちらの組織の損傷は機械的な環境だけでなく、全体のジョイント24の恒常性のバランスに悪影響を及ぼす。関節運動の機械的破壊、緩い体形成、関与コンパートメント内機械的摩耗や消耗を通じて骨軟骨単位の変化対向面には変形性関節症1,11以前の発症と発展につながる可能性があります。したがって、骨軟骨欠損の再生のための組織工学アプローチは、宿主組織2を包囲して効果的な組合を向上させるために、下地軟骨下骨の適切な修復を添付しなければならない。間葉系幹細胞は、骨軟骨修復、これらの特定の要件を提供するための理想的な細胞源と思われる。プロトコルは、潜在的に骨形成および軟骨系統における移植の間葉系幹細胞の選択的分化を誘導することによって、骨や軟骨組織修復の促進を強調しています。
軟骨細胞と比較して、間葉系幹細胞は、いくつかの大きな利点があり、それらは容易に大きいドナー側の合併症なし骨髄、滑膜および脂肪組織から単離することができる。間葉系幹細胞は、 インビトロにおける膨張時に分化していないしたがって、大きな関節軟骨欠損を治療するために大量に培養拡大することができる。また、彼らは免疫のように見えると-適切な刺激に応答して-軟骨細胞と骨細胞25,26に分化することができる。間葉系幹細胞の別の顕著な利点は、同種間葉系幹細胞が拒絶反応27の兆候なしに使用できることを意味し、そのhypoimmunityが表示されます。したがって、1つまたは2つのドナー動物からの細胞プールは、全ての実験のために十分であり得る。これは、動物への動作時間と追加の害を減らすことができます。
いくつかの実験では、骨軟骨修復19,20に対してフィブリン糊を使用して有望な結果を示した。通常、トロンビン、フィブリノゲン溶液で細胞懸濁液を接種は、人工骨軟骨病変に直接、 その場で行わ手順として記載されている。数分後（プレ凝固時間の短い期間の後）操作は通常、膝蓋骨と創傷閉鎖を再配置することによって終了する。
。運転中- -それは全体の凝固のために60分以上待つことはほとんど不可能である、いくつかのパイロットテストでは、フィブリン、細胞懸濁液を十分に凝固するため、それが60分以上かかるとその場で判明。また、骨軟骨病変をシミュレートするプリ掘削孔を有する滅菌プレートを使用することによって、それは明らかに完全に欠損を充填するために使用されたフィブリン糊、量が十分に硬化血餅の収縮によるものではないことを示すことができた。これは、欠陥の合同で完全な充填を達成するために、事前にフィブリン糊のより高い量を必要とする。 in vitroでの血栓の準備を実行すると、簡単に開けられた欠陥の適切なサイズに構造形状を調整しているので、全くと合同に骨軟骨欠損を埋める。することが可能である
さらに、nはin vitroで細胞血栓の準備はありません完全に硬化したフィブリン細胞懸濁物を接着剤の漏れを防ぐことができますが、（わずか数分後）。したがって、最初に意図されたボリュームが欠陥に滞在することを保証することができ、軟骨の統合と改造で始まります。
記載された技術は、軟骨修復の分野における実験幹細胞研究のための標準的な方法を可能にする。プロトコルが後ほどウサギの膝関節軟骨の軟骨欠損内に再注入するために、間葉系幹細胞を分離する再現可能な方法を提供する。自家軟骨細胞はすでにフィブリンセルモデル19における骨軟骨欠損に移植されました。血栓準備だけでなく、間葉系幹細胞の代わりに、軟骨細胞のインビトロ ·モデルを使用すると、骨軟骨病変の改造や修理のために、より有利な、有望な新しいアプローチであるように見えます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、ドイツ研究協会（助成HE 4578/3-1）で、部分的にFP7 EU-プロジェクト "GAMBA" NMP3-SL-2010から245993によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al. Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 28, 116-124 (2010).
- Hangody, L., et al. Autologous osteochondral grafting--technique and long-term results. Injury. 39, 32-39 (2008).
- Marcacci, M., et al. Arthroscopic autologous osteochondral grafting for cartilage defects of the knee: prospective study results at a minimum 7-year follow-up. The American Journal of Sports Medicine. 35, 2014-2021 (2007).
- Ochs, B. G., et al. Remodeling of articular cartilage and subchondral bone after bone grafting and matrix-associated autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee. The American Journal of Sports Medicine. 39, 764-773 (2011).
- Aurich, M., et al. Autologous chondrocyte transplantation by the sandwich technique. A salvage procedure for osteochondritis dissecans of the knee. Unfallchirurg. 110, 176-179 (2007).
- Williams, R. J. 3rd, Ranawat, A. S., Potter, H. G., Carter, T., Warren, R. F. Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 89, 718-726 (2007).
- Szerb, I., Hangody, L., Duska, Z., Kaposi, N. P.
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Gomoll, A. H., et al. The subchondral bone in articular cartilage repair: current problems in the surgical management. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 434-447 (2010).
- Steinhagen, J., et al. Treatment of osteochondritis dissecans of the femoral condyle with autologous bone grafts and matrix-supported autologous chondrocytes. Int. Orthop. 34, 819-825 (2010).
- Guo, X., et al. Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model. Tissue Eng. 10, 1818-1829 (2004).
- Centeno, C. J., et al. Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells. Pain Physician. 11, 343-353 (2008).
- Niederauer, G. G., et al. Evaluation of multiphase implants for repair of focal osteochondral defects in goats. Biomaterials. 21, 2561-2574 (2000).
- Nagura, I., et al. Repair of osteochondral defects with a new porous synthetic polymer scaffold. J. Bone. Joint Surg. Br. 89, 258-264 (2007).
- Schlichting, K., et al. Influence of scaffold stiffness on subchondral bone and subsequent cartilage regeneration in an ovine model of osteochondral defect healing. The American Journal of Sports Medicine. 36, 2379-2391 (2008).
- Schagemann, J. C., et al. Cell-laden and cell-free biopolymer hydrogel for the treatment of osteochondral defects in a sheep model. Tissue Engineering. Part A. 15, 75-82 (2009).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Schillinger, U., et al. A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors. Pharm. Res. 25, 2946-2962 (2008).
- Ahmed, T. A., Giulivi, A., Griffith, M., Hincke, M. Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute. Tissue Engineering. Part A. 17, 323-335 (2011).
- Haleem, A. M., et al. The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results. Cartilage. 1, 253-261 (2010).
- Pape, D., Filardo, G., Kon, E., van Dijk, C. N., Madry, H. Disease-specific clinical problems associated with the subchondral bone. Knee Surg Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 448-462 (2010).
- Shirazi, R., Shirazi-Adl, A. Computational biomechanics of articular cartilage of human knee joint: effect of osteochondral defects. Journal of Biomechanics. 42, 2458-2465 (2009).
- Jorgensen, C., Gordeladze, J., Noel, D. Tissue Engineering through autologous mesenchymal stem cells. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 406-410 (2004).
- Chen, F. H., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cells in arthritic diseases. Arthritis Res. Ther. 10, 223 (2008).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 31, 890-896 (2003).
