Summary
兔子的膝关节中，用于治疗骨软骨缺损的实验技术进行说明。植入异体骨髓间充质干细胞成骨软骨缺损的组织工程领域的发展提供了一个很有前途的。编制纤维蛋白细胞凝块
Abstract
治疗关节软骨缺损已具有挑战性医师多年。更好地理解，在最近几年的关节软骨和软骨下骨的相互作用导致了越来越多的关注，恢复整个骨软骨单元。相比，软骨损伤的再生骨软骨缺损是更加复杂和大得多的手术和治疗的挑战。受损组织不仅包括表面的软骨层，软骨下骨。对于深，骨软骨破坏，因为它会发生与骨软骨病炎例如，需要被替换的缺陷的整个厚度恢复关节面1。合资格的治疗程序必须考虑这两个不同的组织，不同的内在愈合潜力2。在过去的几十年中，一些手术治疗方案已经出现，临床上已经建立了3 -6。
包括关节软骨和软骨下骨的自体或异体骨软骨移植，并允许整个骨软骨单元更换。充满缺陷与的圆柱形软骨移植，旨在提供一个一致的透明软骨覆盖面3,7,8。的缺点是对有限数量的可移植，供体部位的发病率（自体移植）和不协调的表面，从而应用了该方法的特别的限制，大的缺陷。
在组织工程领域的新方法开辟了前途再生软骨治疗的可能性。自体软骨细胞植入标记的第一个单元为基础的生物全层软骨病变的治疗方法，现在世界范围内建立了良好的临床效果，甚至10至20年后植入9,10。然而，达特，这种技术是不适合用于治疗所有类型的病变，如涉及软骨下骨11的深的缺陷。
夹心技术结合植骨与目前的方法在组织工程中5,6。这样的组合似乎是能够克服的局限性，仅见于骨软骨移植。软骨下缺损区域的自体骨移植后，膜与自体软骨细胞接种上述缝合，并促进与损伤部位的拓扑结构相匹配的接枝。当然，以前的骨重建需要额外的手术时间，甚至常常是额外的手术。此外，日期，长期数据丢失12。
无需额外的骨移植的组织工程旨在恢复天然关节软骨的软骨细胞和成骨潜能的移植细胞的复杂结构和性能。 HoweveR中，再次，它通常仅是多还是少再生的软骨组织。额外的软骨损伤，需要一个具体的进一步的治疗。为了实现再生的多层结构的骨软骨缺损，三维组织工程与自体/异体细胞接种的产品可能会提供一个很好的再生能力11。
除了自体软骨细胞，间充质干细胞（MSC）似乎是一个有吸引力的替代全层软骨组织的发展。间充质干细胞在体外和体内研究，在众多的临床前已经显示了出色的组织再生潜能13,14。特别是用于治疗骨软骨缺损的骨髓间充质干细胞的一个重要的优点是它们具有骨细胞和软骨细胞的分化能力。因此，它们可能允许的d的多层再生EFECT。
因此，近年来，一些支架与软骨的再生潜能开发和评估与前景的初步结果1,15-18。此外，纤维蛋白胶作为细胞载体成为实验软骨修复的首选技术之一，已经成功地被用来在多次动物研究19-21，甚至是人类第一次试验22。
以下协议证明隔离从兔子的骨髓间充质干细胞的实验技术，随后在细胞培养增殖，并准备一个标准化的体外模型中的纤维蛋白细胞凝块。最后，将描述一种技术，用于预先建立的血纤维蛋白 - 细胞血栓兔子的膝关节为人造骨软骨缺损的植入。
Protocol
A.捐助者兔间充质干细胞的分离制备（手术室）
- 细胞分离雄性新西兰白（NZW）兔岁4个月，体重约3公斤。
- 异丙酚（10毫克/公斤体重IV）麻醉用戊巴比妥钠（100毫克/公斤体重IV）和牺牲。
- 剃须毛皮后肢，背部和腹部，用电动推剪和真空皮草。
- 剃了彻底消毒，用70％乙醇。
- 使用钝钳，锋利的剪刀（或解剖刀）组织及韧带和骨刀。
- 做一个切口沿面颅的腿和小腿。
- 反映尖锐或钝性分离皮肤和皮下组织。
- 独立的胫骨和股骨的肌肉和韧带。保持尽可能靠近骨尽可能地使一个干净的夹层剪切。不要单独股骨胫骨在这个时候。
- 切THRough分离股骨头的髋臼的髋关节。
- 提升胫骨股骨复杂。
- 使用手术刀刀片刮去任何剩余的从骨骼或软组织擦骨头用无菌布组织。在这一点上，股骨和胫骨仍连接。
- 删除髌骨切割，再切分开的骨头终于膝关节韧带。
- 喷雾用70％的乙醇，骨头分离，让空气干燥，到50毫升离心管中，将每个骨细胞培养基（DMEM + 1％青霉素/链霉素（PEN /链球菌）），以保持湿润。
- 现在切换无菌的细胞培养层流罩下。
B.法拉盛兔MSC从骨骼和扩展（细胞培养罩）
- 管和收集骨头，将它们放置到150毫米的菜肴，用无菌镊子。
- 卸下两个骨端用无菌锯和移动件新的150 mm培养皿。
- 填充10毫升注射器中位数嗯（DMEM），附加18号针，插入骨髓开幕。
- 然后，冲洗骨髓腔介质冲洗骨髓入菜。之后，从另一端冲洗，如果可能的话。如果有必要，送行的两端。如果骨破裂，只用清水冲洗里面的骨头。
- 细胞培养基中悬浮液进入注射器吸出，反复冲洗骨髓，直到悬浮液是通过骨髓腔中的自由浮动的，并没有进一步的骨骨髓凝块出现。
- 一旦骨髓已收集所有的骨头，破坏骨髓团块通过18号针：填充注射器针连接到培养基中逼出来的。
- 之后，通过细胞过滤器过滤悬浮液到50毫升管。为了防止细胞的损失，洗培养皿用10毫升培养基的2倍，以及过滤。
- 以500×g离心悬浮液在RT下5分钟。
- 删除上清，重悬细胞佩尔等在10毫升培养基（DMEM + 1％PEN /链球菌）。
- 独立的血细胞从外周血单个核细胞（PBMC）和间充质干细胞（MSC）使用一个Biocoll分离解决方案。
- 填写5毫升到15毫升管中的分离解决方案Biocoll，并小心地加入5毫升细胞悬浮液的顶部，以800×g离心20分钟，在RT（不带制动器）。
- 可能的结果，请参阅图1：依据密度比Biocoll，红血细胞的底部沉积物而外周血单个核细胞和骨髓间充质干细胞的界面处保留。
- 到15毫升管小心地取出接口，并用5毫升PBS冲洗。
- 离心机中所描述的步骤22中，重悬在5ml PBS，并重复2到3倍。
- 然后，以350×g再次离心10分钟，在RT（带制动器）。
- 重悬在10毫升培养基和血球细胞计数。
- 板细胞最初的接种密度约为5×10 6 150毫米的菜肴。
- 2-3天之后，重新移动非贴壁细胞。您可能需要先用PBS冲洗，以去除细胞碎片。加入新鲜的完全培养基（DMEM + 10％小牛血清（FCS）+ 1％笔/链球菌）之后。
- 喂饱细胞每3-4天（ 图2）。
- 5-10天之后，通过细胞的第一次。
C. 在体外制备的纤维蛋白凝块
- 在植入的日子，3分钟暴露于0.25％胰蛋白酶-EDTA释放贴壁细胞培养瓶/餐盘。停止胰蛋白酶加入完全培养基。
- 分发在50毫升隼管细胞，并用PBS清洗两次。
- 确定由台盼蓝染色的细胞活力和数字。
- 新增50,000个细胞/ 500 XG为5分钟，在室温的离心管和离心收集颗粒。根据需要，准备一个在盒子的至少一个或多个血块。
- 17微升PBS重悬细胞沉淀和混合纤维蛋白原成分布甲25微升胶原与这17微升MSC悬挂套件。
- 径与预钻孔（3x3.6月）根据在体内的钻孔（ 图3）的无菌板。
- 首先，4微升的凝血酶溶液（500国际单位/毫升）接种到一个洞，随后立即加入42微升的血纤维蛋白原的细胞悬浮液，再加入4μl的凝血酶溶液的顶部。请勿混用暂停，以避免凝血枪头。首先，将50μl体积的移液的纤维蛋白原的细胞悬浮液，将凸出的预钻孔的边缘不熔化，由于表面张力的情况下。然而，凝血完成后（60分钟后）血块收缩和装入预钻孔。
- 小心使用钝钳，并放入离心管中，用PBS取出血块。准备2凝块/动物。
- 以血栓手术房。
D.植入异体骨髓间充质干细胞的纤维蛋白凝块
- 麻醉兔（NZW，男，体重3.5-4.0公斤，5-6月龄），通过静脉注射丙泊酚（10毫克/公斤体重）。
- 剃须用电动推剪和真空皮草膝盖上进行操作。命名前的所有程序都在术前准备室，手术室的无菌环境，以避免污染。
- 插管后，1.5毫克/公斤/分钟异丙酚和0.05毫克/千克/分钟静脉注射芬太尼维持麻醉。使用二氧化碳监测，脉搏血氧饱和度和脉率监测麻醉。
- 剃了膝盖彻底消毒，并用无菌敷料覆盖其余兔。
- 触诊髌骨与髌骨内侧进行皮肤切口。
- 打开膝关节内侧髌骨关节切开，在无菌条件下。尽量避免切割任何小的浅表血管。
- 横向髌骨置换“（ 图4）。
- 在SPE后的任何伴随的软骨损伤或关节异常的膝关节CTION，创建两个滑车沟的骨软骨缺损（3毫米深，图中呈八字形），用无菌空气工作动力钻（直径3.6毫米）与停止装置（ 图5）。
- 清洁的缺陷，他们用无菌生理盐水冲洗。
- 植入前，填写缺陷和20微升纤维蛋白胶均匀涂于底部的缺陷。
- 然后植入凝块压配合到图中呈八字形缺陷。
- 凝固后，搬迁滑车沟和髌骨内弯曲和伸展膝盖几次。
- 置换髌骨横向再次检查，如果纤维蛋白原细胞凝块是还是很到位的。
- 再次更换髌骨做完手术伤口缝合在单纽扣缝线（4-0薇乔）和连续缝合皮肤（4-0 MONOCRYL）层（可吸收缝合的材料）。
- 最后，密封伤口，喷雾敷料可渗透水蒸汽。
- 对于手术后的护理，每天检查伤口7天。兔子获得手术后镇痛卡洛芬4毫克/公斤SC每24个小时（4天），每12小时（2.5天）Buprenorphin 0.03毫克/千克SC。一个稳定的膝盖（ 如敷料）是没有必要的。
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Representative Results
手术技术允许一个成功的隔离和异体骨髓间充质干细胞植入一个人工软骨缺损。实验装置的植入导致一个成功的整合到周围的软骨。
类似的生物力学特性和类似的耐久性相比周围的软骨缺损填充修复组织。血纤维蛋白细胞凝块在体外制备的无菌板与预钻孔的骨软骨缺损（ 图3），它有相同的大小。其结果是，有植入纤维蛋白凝块和周围的软骨，这将是过早退化或剥离（ 图6）的一个危险因素之间没有裂。确保基底修复组织愈合，因为软骨下骨被穿透，从而对剪切工作。另一个重要的方面是STIF修复组织fness，应符合周围健康软骨组织，以避免增加负载和可能的过早退化。在我们的预备实验（数据未示出）中，我们发现，12周后，已经可以实现足够的刚度。此外，一个完整的和均匀的表面的移植被发现，这减少了剪切应力和可能的注入损伤（ 图6）。
图1。从使用Biocoll分离解决方案的外周血单个核细胞和间充质干细胞的血细胞和血浆分离。
图2。单层间充质干细胞（新西兰白兔）经过5天的文化。
图3。护板与预钻孔（3x3.6月）最上面的一个填充有纤维蛋白细胞凝块。
图4。开业后膝关节内侧髌骨关节切开术。
图5。滑车沟的骨软骨缺损（3毫米深，3毫米的直径，图八字形）。
图6。膝关节植入后12周的两个细胞的血纤维蛋白凝块成两个钻骨软骨缺损开业。
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Discussion
近年来，组织工程方法处理复杂的关节软骨缺损 - 如那些导致剥脱性骨软骨炎，股骨头坏死和创伤 - 的可能性变得越来越有吸引力。在前面提到的病理实体，延伸到软骨下骨组织损伤，并涉及到两个组织，其特征在于由不同的内源性愈合能力1。有致病的软骨下骨关节软骨损伤的过程，11,23中的作用越来越大的兴趣。关节软骨的功能状况及其配套骨紧密相连。任一组织的损伤的产生不利影响的机械的环境，以及在整个接头24的自我平衡。在软骨单元通过改变关节运动的机械破碎，松散体的形成，涉及的车厢中的机械磨损和减员相对的表面，可能会导致骨关节炎1,11到一个较早的发生和发展。因此，组织工程骨软骨缺损的再生方法应伴随着足够恢复的底层的软骨下骨，以提升有效结合与周围宿主组织2。骨髓间充质干细胞似乎是一种理想的细胞源，以提供这些具体要求的骨软骨修复。该协议强调促进骨和软骨组织修复有可能在成骨细胞和软骨细胞移植的骨髓间充质干细胞的分化诱导选择性。
骨髓间充质干细胞在软骨细胞相比，有几大优点：他们可以很容易地分离出骨髓，滑膜和脂肪组织没有任何更大的供体侧的发病率。间充质干细胞不分化过程中体外扩增 ，因此，可以培养大量扩大治疗大关节软骨缺损。此外，他们似乎是免疫-在适当的刺激-可以分化成软骨细胞和骨细胞25,26。骨髓间充质干细胞的另一个显着的优势，显示其免疫力低下，这意味着没有任何征兆的排斥反应27，异基因骨髓间充质干细胞可用于。因此，可以从一个或两个供体动物细胞池足以满足所有的实验。这降低了操作的时间和额外的动物的危害。
一些实验表明使用纤维蛋白胶软骨修复19,20可喜的成果。一般，血纤维蛋白原的细胞悬浮液与凝血酶溶液接种已被描述为在原位做的一个程序，直接进入人造骨软骨病变。在几分钟之后的前凝血时间（经过一段短时期）操作通常是完成通过髌骨搬迁和伤口缝合。
在几个试点测试中，我们发现，有足够的凝血纤维蛋白细胞悬浮花费60分钟以上。 原位 -操作过程中-这几乎是不可能等待超过60分钟，整个凝血。此外，通过使用模拟骨软骨病变与预钻孔的无菌板，未能显示，这是用来显然完全填充缺损，纤维蛋白胶的量是不够的，由于萎缩硬化凝块。这需要提前量增加，纤维蛋白胶，以达到一个一致的和完全填充的缺陷。 体外血块执行编制的，它可以很容易地调整结构形状，大小合适的钻缺陷，因此，补骨软骨缺损，完全和固液同。
此外，一个n 在体外制备细胞凝块防止泄漏的粘接剂，但只有几分钟后未完全硬化的血纤维蛋白的细胞悬浮液。因此，可以保证，最初打算的体积会留在缺陷，并开始与软骨整合和重塑。
所描述的技术允许一个标准化实验干细胞在软骨修复领域的研究方法。该协议提供一个可重复的方式来分离骨髓间充质干细胞，以重新植入兔子的膝关节软骨的软骨缺损。自体软骨细胞已被植入到骨软骨缺损中的血纤维蛋白的细胞模型19。使用血块的制备，而不是软骨细胞和骨髓间充质干细胞在体外模型，似乎是更有利的和有前途的新方法重构和修复骨软骨病变。
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Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
资助这个项目是由德国研究协会（授予他4578/3-1）和部分欧盟第七框架计划项目“岗巴”NMP3-SL-2010-245993。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
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