Summary
癌相关成纤维细胞（CAFS）信号，促进细胞增殖，血管生成和炎症促进肿瘤的发生，生长和发展。在这里，我们描述了一种方法，分离出纯净的新鲜小鼠和人体组织的正常成纤维细胞和纤维母细胞分选，表面标志使用PDGFRα的人口。
Abstract
癌症相关的成纤维细胞（CAFS）是最重要的细胞类型，许多癌症的肿瘤间质内，特别是乳腺癌，其突出的存在往往与预后不良1,2。 CAF的活化的基质成纤维细胞的亚群，其中许多表达的肌纤维母细胞标记物α-SMA的3。 CAF的起源来自局部组织的成纤维细胞，以及从招募到显影的肿瘤和采用的CAF表型的影响下的肿瘤微环境4的骨髓来源的细胞。 CAF的信号，促进肿瘤细胞增殖，血管生成和侵袭5-8，促进肿瘤的发生，生长和发展。我们表明，CAF的提高肿瘤的生长，介导肿瘤促进炎症开始，最早在癌前阶段9。尽管越来越多的证据中发挥的关键作用CAF的促进肿瘤的生长，研究CAF的一直是一个持续的挑战，由于缺乏CAF-这些细胞的特异性标志物和广阔的异质性，与现有的许多亚型肿瘤微环境的10。此外，成纤维细胞的体外研究是通过阻碍它们的基因表达中的事实，常常在组织培养11,12改变。为了解决这个问题，让公正的新鲜小鼠的成纤维细胞和人体组织的基因表达分析，荧光激活细胞分选（FACS）13,14以前的协议的基础上，我们开发了一种方法。我们的方法依赖于利用PDGFRα隔离成纤维细胞的表面标记，从新鲜小鼠和人体组织。 PDGFRα中大量表达的正常成纤维细胞和纤维母9,15。此方法允许隔离纯种群的正常成纤维细胞和CAF的，包括，但不限于α-SMA +活化肌成纤维细胞。然后可以隔离成纤维细胞用于表征和比较基因的表达，在肿瘤发生在纤维母的演变。事实上，我们和其他人表达谱成纤维细胞分离细胞分选16。该协议成功地进行了高度浓缩的人群皮肤，乳腺，胰腺和肺组织中的成纤维细胞进行隔离和剖析。此外，我们的方法允许排序的细胞培养，在为了执行功能的实验，以避免污染的肿瘤细胞，这往往是一个很大的障碍时，试图来培养的CAF。
Protocol
1。解剖小鼠乳腺皮肤组织
- 解剖组织的小鼠之前，需准备以下用品及试剂：
耗材：
- 外科工具（在用洗涤剂和洗涤，然后浸渍在70％的乙醇）。
- 鼠标停留在剥离时的发泡胶面。
- 引脚或针头在解剖小鼠。
- 玻璃瓶盖的消化，含有磁性搅拌棒（灭菌）。
- 水浴中于37℃，含有潜式磁力搅拌器和足够的水来淹没消化罐，休息时的搅拌盘上。
试剂：
- FACS缓冲I：（4°C）的Dulbecco磷酸盐缓冲液钙，镁，CMF（免费）+ 0.5％BSA
- 胶原酶溶液（使用前）：
0.05克Ⅱ型胶原酶
0.05克Ⅳ型胶原酶
0.01克Deoxyribonuc租赁
20毫升FACS缓冲液I.查看胶原酶溶液在冰上直至使用。 - PharmLyse（氯化铵溶胞试剂）。
- FACS缓冲液II：Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水CMF + 1％FCS的。
- 乳腺解剖 （见17）。
- 安乐死使用二氧化碳（CO 2）的吸入的雌性小鼠。
- 在一个塑料表面，将鼠标放在它的背部和脚牢牢四肢，用25号针（ 图1A）。鼠标慷慨喷用70％的乙醇。
- 使用产钳，拉腹部皮肤在中线作一小切口，用锋利的剪刀。
- 从开始的切口，切开皮肤动物的脖子上，同时避免对腹腔或胸腔穿刺。
- 从正中切口朝向腿部上的后脚切开皮肤，导致在一个“Y形”。
- 拉皮肤距离谅解备忘录Ê身体和牵制，露出附着到皮肤的底面（ 图1B）的乳腺。
- 用棉签轻轻分开乳腺皮肤，同时降低结膜组织分开乳腺小锋利的剪刀对脊柱的鼠标。
- 腹部的腺体（＃4，5）本协议是最好的。您还可以使用第二届乳腺，但请记住，这些腺体的解剖学位于靠近胸大肌这可能是很难区分，导致在混合组织起源的细胞。
- 注：解剖肿瘤组织时，建议切除坏死的地区。
- 皮肤组织的解剖：皮肤组织的最简单的方式来获得，而无需处理脱毛是使用鼠标的耳朵。如果大量的组织是必需的，你可以剃去头发从鼠标躯干和剖析皮肤。
- 安乐死的小鼠ü唱CO 2吸入。
- 使用锋利的剪刀，立即切断的耳朵和地方在消化罐的体积小（约0.5毫升）的PBS冰。
2。的乳腺/护肤单细胞悬液的制备
- 将乳腺/皮肤消化jar文件含有一个小体积的PBS在冰上。如果组织是“血腥与PBS洗X2”，然后丢弃多余的PBS。
- 切碎，彻底弯曲的剪刀。
- 加入20 mL胶原酶溶液（注：这将有效量的胶原酶溶液分离约5克的乳腺肿瘤组织和耳朵了15只）。
- 将立即，搅拌板在37°C水浴，并孵育15分钟，而在中速搅拌。
注：孵育时间可能有所不同，如果消化其他组织。
- 要停止反应，加入30毫升冷DMEM + 10％FCS。
- 应变的组织/媒体混合物通过一个70微米的细胞过滤网放置在一个50毫升锥形管的顶部。
- 离心锥形管中在450×g离心5分钟，在4℃下
3。红血细胞裂解
注意：这一步是没有必要，如果小鼠心脏灌注PBS处死。
- 吸取上清，使用的玻璃移液管连接到真空中，而不会干扰细胞沉淀。
- 以溶解红细胞，细胞沉淀重悬在10毫升PharmLyse溶液并在室温下孵育5分钟。
- 中和该PharmLyse溶液，加入约40毫升的FACS缓冲液一
- 附带的锥形管中，细胞在450×g离心5分钟，在4℃下
- 吸取上清液
4。阻断内源性的Fc
- 可选：计数细胞，以确定适当的音量以下STEPS。
- 悬浮细胞在1-3毫升FACS缓冲I（根据细胞数量及金额您要使用的抗体）。
- 添加FcBlock（抗小鼠CD16/CD32）达到1:50稀释（10微克/毫升），并在冰上孵育10-20'。
不需要洗掉FcBlock。
5。染色法
- 取出100μl等分试样被用来作为一种未染色的控制和单一的颜色控制（根据使用的荧光抗体的数目）的eppendorf管中。
- 标记成纤维细胞：抗PDGFRα（直接结合的荧光）为1:50的稀释（10微克/毫升）。
- 至标记其他细胞群（ 例如，免疫细胞，巨噬细胞，内皮细胞等）：添加适当的荧光共轭的表面标志物的抗体，以1:50稀释。
注意：虽然PDGFRα是一个健壮的成纤维细胞标记物，它建议包括抗体对于immune细胞和上皮细胞，以排除任何双阳性的人群，从而提高了孤立的成纤维细胞的纯度。
- 添加2微升每种抗体的每个的单一颜色控制eppendorf管中。
- 1小时上冰在黑暗中培养细胞的抗体。
- 洗：填写管FACS缓冲液I和旋转450×g离心5分钟，在4°C。
- 吸液上清，重悬细胞在FACS缓冲I至浓度约为2×10 6个细胞/毫升，或两者浓度最适当的排序与您的可用FACS分拣机。
可选：细胞可以悬浮在FACS缓冲液II中的持续时间排序。这可能会提高细胞活力。然而，暴露于血清中的因素可能影响基因的表达，这应该被测试，并考虑。
- 标记的细胞转移到FACS管与管的过滤器：过滤单元防止细胞团块。
- 排除死细胞，加入7AAD（0.5微克/毫升）或碘化丙啶（PI）的样品（未染色的控制除外）。
注意：为了避免浪费细胞，你可以添加7AAD/PI录制后，在流式细胞仪的未染色的样品，并且再次使用控制7AAD只。
- 在分析样本保持在冰上。
6。通过流式细胞仪分离细胞
（注：该协议的一部分，需要经营FACS分选机， 如 BD FACS AriaII，或熟练的技术人员的协助下，在以前的知识）。
- 使用流式细胞仪分选机软件（BD FACSDiva），准备适当的分析图，分析前向散射（FSC），侧向散射光（SSC），7AAD，FITC，PE和任何其他荧光标记细胞（ 图2）。
- 在加载每个样品的细胞分选仪，涡流简单地重悬细胞。
- 首先分析仪的ING未染色样品以便设置总细胞群体的选通，栅极出细胞碎片，并以确定的自发荧光或背景染色。
- 染色的样品+ 7AAD分析，以确定和门活细胞与细胞总人口的人口。
- 分析每一个单一的颜色控制，补偿等，以确定和校准参数。
- 染色的样品分析，定义的门的位置进行排序。
- 一旦参数和门已设置为所需的细胞群，开始排序到微量离心管或15毫升锥形管中含有培养基或RNA裂解液（如RLT缓冲或Trizol法）标记的细胞群。
注意：如果大量的单元格进行排序，它是不建议直接进入分类，RNA裂解缓冲液，作为鞘液的大量伴随细胞的裂解缓冲液稀释，并降低产量。
- 灵宝n细胞后马上分拣完成后，转移到新鲜培养基或RNA裂解缓冲液，根据你的实验的目的。
- 如果排序，以培养分离出的细胞，进行无菌排序。为了更好地恢复细胞，用无酚红DMEM + 5％FCS的FACS缓冲液II和20％FCS收集细胞培养液中。
- 如果排序培养成纤维细胞，胶原蛋白涂层板alwaysplate，从来没有直接对塑料激活的成纤维细胞基因表达的变化，因为这结果。
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Representative Results
使用PDGFRα隔离高度富集的组织的成纤维细胞的种群中的成纤维细胞的结果作为一个标记。排序后的纯度为99％的水平，量化排序后分析（ 图2A）。估算污染的非成纤维细胞通过小区固有控制基因的相对表达量（ 图2B）的百分比通常显示0.1-0.6％的污染。这个级别的纯度，使高品质的转录组分析孤立的成纤维细胞9。
在乳腺中，在组织中的成纤维细胞的百分比变化在正常乳腺组织中的5-20％之间，和1-5％MMTV-PyMT肿瘤中。在肿瘤组织中的成纤维细胞的相对百分数是低于在肿瘤前的组织，尽管增加成纤维细胞的总数，由于上皮隔室的大规模扩展。从肿瘤组织中分离出的成纤维细胞的减少％也因的附加的技术难度和减少从一个高度坏死组织的细胞分选效率。
隔离成纤维细胞进行培养后直接排序，但可能需要几天恢复（ 图2D）。重要的是执行所有进一步的实验与低传代细胞，作为主要的成纤维细胞进行文化传播的衰老过程。
图1。新鲜的乳腺成纤维细胞的分离纯化。 A-FVB /ŋ/ PyMT的鼠标。接触B-C-新鲜的乳腺增生病乳腺增生病。FVB / N / PyMT的小鼠进行解剖和消化，胶原酶单细胞悬液。细胞免疫标记抗体成纤维细胞的表面标志（PDGFRα）和马crophages表面标记（F4/80），然后用流式细胞仪分离。 ，排序成纤维细胞培养或裂解RNA纯化。 点击此处查看大图 。
图2。剖析排序的成纤维细胞。 A-小鼠乳腺的单细胞悬液与F4/80PDGFRαand，抗染色。流式细胞仪分选图所示（左图）。 P2是成纤维细胞闸门（PDGFRα+细胞）和P4是巨噬细胞的闸门（F4/80 +细胞）。一个职位的排序进行分析，以确定B-排序纯度的细胞特异性的控制基因的荧光定量RT-PCR分析fibrobla排序的成纤维细胞和巨噬细胞（中间和右边的面板）的纯度。日（PDGFRα，柱-1α），免疫细胞（CD45，CSF-1R）和上皮细胞（E-钙粘蛋白）。结果归一到两个看家基因（GAPDH和MGUS）。 GAPDH的相对表达C-PDGFRα的表达未分类的总人口的乳腺成纤维细胞的定量D-排序成纤维细胞组织培养。 点击此处查看大图 。
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Discussion
虽然在组织培养中进行的实验可以是信息性 的和建议可以验证在体内的功能原理，它是已知的，会发生大的变化，在基因表达的细胞在培养11,12。为了避免组织培养一步成纤维细胞中的基因表达分析时，我们开发了一个协议，允许隔离正常，以及与癌症相关的新鲜小鼠成纤维细胞或人体组织。该协议已成功应用于鼠标，从9人的皮肤，胰腺，乳腺组织。用流式细胞仪分选的成纤维细胞的分离要求，标签成纤维细胞的表面标记。我们建立了PDGFRα是一个强大的表面标志，使隔离高度浓缩的9成纤维细胞群体的。此外，PDGFRα的表达对正常组织的成纤维细胞和纤维母，从而使公正的组织成纤维细胞的分离和分析，而不是focusing就一个特定的亚群。
成纤维细胞是一种异质细胞群表达的标记分子，以及在其原产地和信号性能8,10,18。虽然PDGFRα是一个健壮的成纤维细胞的表面标志物，但它不标记100％的成纤维细胞在所有组织中产生在未标记的细胞亚群，根据组织类型。在皮肤中的成纤维细胞中，约90％是PDGFRα+（未示出），而在约85％的总的组织的成纤维细胞是乳腺PDGFRα+（ 图2C）。 PDGFRα的表达成纤维细胞的百分比在其他类型的组织可能会发生变化，并且需要被定义为每个组织。尽管如此，在皮肤和乳腺，利用作为一个细胞表面标志物的PDGFRα将导致高度富集的种群的大部分组织成纤维细胞中，允许表达概况分析或排序条件的细胞的培养等。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢他们的帮助，流式细胞仪分选博士Yitzchak Oschry和博士ORIT的鹭阿西夫。这项研究得到了补助NE从欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）根据赠款协议Ň°[276890]，从以色列癌症协会（20110078），并从以色列癌症研究基金（ 研究职业发展奖 ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
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