Summary
Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.
Abstract
Kankergeassocieerde fibroblasten (CAF) zijn de voornaamste celtype in de tumorstroma van vele soorten kanker, in het bijzonder borstkanker, en de prominente aanwezigheid wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose 1,2. CAF zijn een geactiveerd subpopulatie stromale fibroblasten, waarvan vele drukken de myofibroblast marker α-SMA 3. CAF afkomstig zijn van plaatselijke weefsel fibroblasten en van beenmerg afgeleide cellen gerekruteerd voor de ontwikkeling en tumor CAF fenotype onder invloed van de tumor micro 4 nemen. CAF werd aangetoond dat de tumor initiatie, groei en vooruitgang te bevorderen door middel van signalering dat bevordert tumorcelproliferatie, angiogenese en invasie 5-8. We hebben aangetoond dat CAF tumor groei door bemiddeling tumor-bevorderende ontsteking, vanaf de eerste stadia preneoplastisch 9. Ondanks de toenemende bewijs van de belangrijke rol CAF spelen in het faciliteren van de groei van tumoren,bestuderen CAF is een permanente uitdaging vanwege het ontbreken van CAF-specifieke markers en de enorme heterogeniteit van deze cellen met vele subtypen coëxisterende in de tumor micro-omgeving 10. Bovendien onderzoekt fibroblasten in vitro belemmerd door het feit dat hun genexpressieprofiel vaak veranderd in weefselkweek 11,12. Om dit probleem aan te pakken en onpartijdige genexpressie van fibroblasten van verse muis en menselijke weefsels mogelijk te maken, werd een methode ontwikkeld op basis van eerdere protocollen voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 13,14. Onze aanpak is gebaseerd op het benutten van PDGFRα als een oppervlak marker om fibroblasten te isoleren van verse muis en menselijk weefsel. PDGFRα is overvloedig uitgedrukt door zowel de normale fibroblasten en CAF 9,15. Deze methode maakt isolatie van zuivere populaties van normale fibroblasten en CAF, inclusief maar niet beperkt tot α-SMA + geactiveerd myofibroblasten. Fibroblasten geïsoleerd kunnen danvoor karakterisering en vergelijking van de ontwikkeling van genexpressie die optreedt in CAF tijdens tumorigenese. Sterker nog, wij en anderen gemeld expressie profilering van fibroblasten geïsoleerd door celsortering 16. Dit protocol werd met succes uitgevoerd te isoleren en hoogverrijkt populaties van fibroblasten profiel van de huid, borstklier, pancreas en longen. Bovendien maakt onze methode ook kweken van cellen gesorteerd, om functionele experimenten en verontreiniging door tumorcellen, die vaak een groot obstakel wanneer het proberen om cultuur CAF voorkomen.
Protocol
1. Ontleden uier of huidweefsel van muizen
- Voor het ontleden van de gewenste weefsel van muizen, de voorbereiding van de volgende leveringen en reagentia:
Benodigdheden:
- Chirurgie gereedschap (gewassen met wasmiddel en vervolgens ondergedompeld in 70% ethanol).
- Styrofoam oppervlak de muis rusten tijdens dissectie.
- Pins of naalden aan muizen te houden tijdens dissectie.
- Glazen pot met deksel voor de spijsvertering, met daarin magnetische roerstaaf (geautoclaveerd).
- Waterbad bij 37 ° C, met een dompelpomp magnetische roerder en voldoende water te dompelen de spijsvertering pot, terwijl rust op de roerplaat.
Reagentia:
- FACS buffer I: (4 ° C): Dulbecco's fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing CMF (Calcium Magnesium Free) + 0,5% BSA
- Collagenaseoplossing (die onmiddellijk voor gebruik):
0,05 g Collagenase II
0,05 g Collagenase IV
0,01 g deoxyribonuclease
20ml FACS buffer I. houden collagenaseoplossing tot gebruik op ijs. - PharmLyse (Ammonium Chloride lyseringsreagens).
- FACS buffer II: Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing CMF + 1% FCS.
- Dissectie van de borstklieren (zie ook 17).
- Euthanaseren vrouwelijke muizen met behulp van kooldioxide (CO 2) inademing.
- Op een piepschuim ondergrond, plaatst u de muis op zijn rug en speld vast alle vier de ledematen met 25 gauge naalden (Figuur 1A). Royaal Spuit de muis met 70% ethanol.
- Met behulp van een tang, trek de buikhuid bij de middellijn en maak een kleine incisie met een scherpe schaar.
- Vanaf de incisie, de huid snijden tot aan de nek van het dier terwijl het vermijden aanprikken van de buik of borstkas holten.
- Snijd de huid op de achterpoten van de middellijn incisie naar het been, resulterend in een "Y-vorm".
- Trek de huid van de muis lichaam en vastpinnen, het blootstellen vande borstklieren aan de onderkant van de huid (Figuur 1B).
- Gebruik Q-tips om voorzichtig melkklieren te scheiden van de huid tijdens het snijden bindweefsel met kleine scherpe schaar om de borstklier te scheiden in de richting van de rug van de muis.
- De abdominale klieren (# 4, 5) zijn het beste voor dit protocol. U kunt ook gebruik maken van de 2 e borstklier, maar houd in gedachten dat deze klieren anatomisch bevinden zich in de nabijheid van de borstspier, die moeilijker te scheiden, wat resulteert in cellen van gemengde weefsels oorsprong.
- Opmerking: Wanneer ontleden tumorweefsel, is het raadzaam om necrotische gebieden te verwijderen.
- Dissectie van huidweefsel: De eenvoudigste manier om de huid weefsel te verkrijgen, zonder dat te maken met ontharing is het gebruik van de muis oren. Als een grotere hoeveelheid weefsel nodig is, kunt u afscheren haar van de muis torso en ontleden huid.
- Euthanaseren muizen met CO2 inhalatie.
- Met behulp van een scherpe schaar, sneed beide oren en plaats direct bij de spijsvertering pot met een klein volume (~ 0,5 ml) van PBS op ijs.
2. Voorbereiding van borstklier / huid enkele celsuspensie
- Plaats melkklieren / achtergrond in vertering pot met een klein volume PBS op ijs. Als weefsel is bloederig wassen x2 met PBS, en dan gooi overtollige PBS.
- Hak grondig met gebogen schaar.
- Voeg 20 ml collagenase oplossing (let op: dit bedrag van collagenase oplossing zal ongeveer 5 g van mammaire of tumorweefsel en oren efficiënt distantiëren van maximaal 15 muizen).
- Plaats onmiddellijk roerplaat in 37 ° C waterbad en incubeer gedurende 15 min onder roeren bij gemiddelde snelheid.
Opmerking: optimale incubatietijd kan variëren als het verteren van andere weefsels.
- Om de reactie te stoppen, voeg 30 ml koude DMEM + 10% FCS.
- Zeef het weefsel / media mengsel througha 70 urn celzeef bovenop een 50 ml conische buis.
- Centrifugeer de conische buis gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C.
3. Rode bloedcellen Lysis
Let op: deze stap is niet nodig als muizen waren hart-perfusie met PBS voordat ze werden geofferd.
- Zuig de supernatant met een glazen pipet aan vacuum, zonder de celkorrel.
- RBC, resuspendeer celpellet lyseren in 10 ml PharmLyse oplossing en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Neutraliseer de PharmLyse oplossing door toevoeging van ongeveer 40 ml FACS-buffer I.
- Draai de conische buis met cellen gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C.
- Zuig het supernatant.
4. Het blokkeren van endogene Fc
- Optioneel: aantal cellen naar de juiste volume voor de volgende stappen te bepalen.
- Resuspendeer cellen in 1-3 ml FACS buffer I (afhankelijk on aantal cellen, en de hoeveelheid antistoffen die u wilt gebruiken).
- Voeg FcBlock (anti-muis CD16/CD32) tot 1:50 verdunning (10 ug / ml) te bereiken en op ijs geïncubeerd gedurende 10-20.
Geen behoefte te wassen FcBlock.
5. Kleuring
- Neem 100 ul aliquots op eppendorf buizen worden gebruikt als een niet-gekleurde bediening met een kleurinstellingen (volgens het aantal gebruikte fluorescente antilichamen).
- Om label fibroblasten: voeg anti-PDGFRα (direct geconjugeerd aan fluorofoor) met een verdunning van 1:50 (10 ug / ml).
- Om andere celpopulaties (bijv. immuuncellen, macrofagen, endotheelcellen, enz.) te labelen: voeg de juiste fluorescent geconjugeerde antilichamen aan de oppervlakte markers, een 1:50 verdunning.
Opmerking: hoewel PDGFRα is een robuuste marker voor fibroblasten, wordt aanbevolen antilichamen omvatten immuuncellen en epitheelcellen om eventuele dubbele positieve sluitenpopulaties en zo de zuiverheid van geïsoleerde fibroblasten.
- Voeg 2 pi van elk antilichaam aan elk van de kleur control eppendorf buizen.
- Incubeer cellen met antilichamen gedurende 1 uur op ijs in het donker.
- Te wassen: vul buizen met FACS-buffer I en draai gedurende 5 minuten bij 450 xg bij 4 ° C.
- Zuig supernatant, resuspendeer cellen in FACS buffer I tot een concentratie van ongeveer 2 x 10 6 cellen / ml, of welke concentratie meest geschikt voor het sorteren met de beschikbare FACS sorter.
Optioneel: Cellen worden opnieuw gesuspendeerd in FACS buffer II gedurende de sortering. Dit kan de levensvatbaarheid van de cellen. Echter kan de blootstelling aan factoren in serum van invloed genexpressie die moet worden getest, en in aanmerking genomen.
- Overdracht gelabelde cellen in FACS buisjes met filter boven: filter cellen in de buizen naar cel klonten te voorkomen.
- Om dode cellen te sluiten, voegt 7AAD (0,5 ug / ml) of Propidium jodide (PI) monsters (met uitzondering van de niet-gekleurde controle).
Opmerking: Om te voorkomen dat het verspillen van cellen, kunt u 7AAD/PI toevoegen aan de niet-gekleurde monster na het opnemen in de FACS, en opnieuw als 7AAD controlegroep met uitsluitend gebruiken.
- Bewaar monsters op ijs tijdens het analyseren.
6. Isolatie van cellen door FACS
(Let op: dit deel van het protocol vereist voorkennis in de exploitatie van een FACS sorter, bijvoorbeeld BD FACS AriaII, of de hulp van een vakman).
- Met behulp van de FACS sorter software (BD FACSDiva), voor te bereiden passende analyse percelen voorwaartse verstrooiing (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC), 7AAD, FITC, PE en andere fluorofoor gebruikt om label-cellen (Figuur 2) te analyseren.
- Voor het laden van elk monster voor de cel sorteerder, vortex kort aan cellen opnieuw in suspensie.
- Begin met de ongekleurde monster analyseren om de gating gesteld aan de totale celpopulatie te gate van cell puin, en autofluorescentie of achtergrondkleuring bepalen.
- Analyseer ongekleurde monster + 7AAD bepalen en gate de populatie van levende cellen van de totale celpopulatie.
- Analyseer elke afzonderlijke kleur controle om vast te stellen en te kalibreren parameters zoals compensatie.
- Analyseer de gekleurde monster om de positie van poorten te definiëren voor het sorteren.
- Zodra de parameters en poorten voor de gewenste celpopulaties zijn ingesteld, begint het sorteren van de gelabelde celpopulaties in Eppendorf buizen of 15 ml conische buizen met kweekmedium of RNA lysis buffer (zoals RLT buffer of Trizol).
Opmerking: Als het sorteren van een groot aantal cellen, wordt het afgeraden om direct te sorteren in RNA lysis buffer, de grote hoeveelheid mantelvloeistof bij de cellen de lysisbuffer verdunnen en verminderen de opbrengst.
- Spin Cellen naar beneden direct na het sorteren is voltooid, en de overdracht naar vers medium of RNA lysis buffer, deafhankelijk van het doel van uw experiment.
- Indien het sorteren met het oog op de cultuur geïsoleerde cellen, uit te voeren steriel soort. Voor beter herstel van cellen met fenolrood vrij DMEM + 5% FCS plaats van FACS buffer II en verzamelen cellen in kweekmedium met 20% FCS.
- Als het kweken gesorteerd fibroblasten, alwaysplate op collageen gecoate platen en nooit rechtstreeks op kunststof, omdat dit resulteert in activatie van fibroblasten die leidt tot veranderingen in hun genexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met PDGFRα als marker voor fibroblasten resultaten in isolatie van sterk verrijkte populaties van weefsel fibroblasten. De zuiverheid na sortering was 99%, zoals gekwantificeerd door post-sort analyse (Figuur 2A). Geschatte percentage niet-contaminerende fibroblast cellen door de relatieve expressie van cel-specifieke controle genen (Figuur 2B) toont typisch 0,1-0,6% verontreiniging. Deze zuiverheid maakt het mogelijk hoge kwaliteit transcriptoom profilering van geïsoleerde fibroblasten 9.
In borstklieren, het percentage van fibroblasten in het weefsel varieert tussen 5-20% in normaal borstweefsel, en 1-5% in MMTV-PyMT tumoren. Het relatieve percentage van fibroblasten in tumorweefsel is lager dan in pre-neoplastische weefsel, ondanks een toename van het aantal fibroblasten, vanwege de enorme expansie van de epitheliale compartiment. De verlaagde% van fibroblasten geïsoleerd van tumorweefsel is het resultaat vande toegevoegde technische moeilijkheid en verminderde efficiëntie van celsortering van een zeer necrotisch weefsel.
Geïsoleerde fibroblasten kunnen direct worden gekweekt na sortering, maar kan een paar dagen om te herstellen (Figuur 2D). Het is essentieel om alle verdere experimenten met lage passage cellen, uit te voeren als primaire fibroblasten ondergaan veroudering tijdens propagatie in cultuur.
Figuur 1. Zuivering van fibroblasten van verse borstklieren. A-FVB / n / PyMT muis. B-blootgestelde borstklieren. C-Fresh borstklieren werden geprepareerd uit FVB / n / PyMT muizen en gedigereerd met collagenase om een enkele celsuspensie. Immune cellen werden gemerkt met antilichamen voor fibroblast oppervlaktemerker (PDGFRα) en macrophages oppervlaktemerker (F4/80), gevolgd door scheiding door FACS. Gesorteerd fibroblasten werden ofwel gekweekt of gelyseerd voor RNA-zuivering. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Profilering van gesorteerd fibroblasten. A-Enkele cel suspensies van muis melkklieren werden gekleurd met antilichamen PDGFRαand F4/80. FACS sortering plot wordt weergegeven (linker paneel). P2 is de fibroblasten poort (PDGFRα + cellen) en P4 is de macrofagen poort (F4/80 + cellen). Een post soort analyse uitgevoerd om de zuiverheid van de gesorteerde fibroblasten en macrofagen (middelste en rechter panelen) te bepalen. B-analyse van sortering zuiverheid qRT-PCR van celspecifieke control genen fibroblast (PDGFRα, Col-1α), immuuncellen (CD45, CSF-1R) en epitheelcellen (E-cadherine). De resultaten werden genormaliseerd om twee huishouding genen (GAPDH en MGUS). Relatieve expressie tot GAPDH wordt weergegeven. C-Kwantificering van PDGFRα uitdrukking in totaal ongesorteerde bevolking van mamma-fibroblasten. D-Weefselkweek van gesorteerd fibroblasten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl experimenten uitgevoerd in weefselkweek kan informatief en suggereren functionele principes die kunnen worden geverifieerd in vivo is bekend dat grote veranderingen in genexpressie van cellen in kweek 11,12. Om een weefselkweek stap vermijden wanneer genexpressie profilering in fibroblasten, ontwikkelden we een protocol waarmee Isolatie van normale, evenals kanker geassocieerde fibroblasten van verse muis of menselijk weefsel. Dit protocol werd met succes toegepast met de huid, pancreas en het borstweefsel uit de muis en van de mens 9. Isolatie van fibroblasten door FACS sortering heeft een oppervlak merker die labels fibroblasten. Is vastgesteld dat PDGFRα een robuust oppervlak merker die de isolatie van sterk verrijkte populaties van fibroblasten 9 is. Bovendien is PDGFRα uitgedrukt op zowel normale weefsel fibroblasten en CAF, zodat onpartijdige isolatie en profilering van weefsel fibroblasten dan focusing op een specifieke subpopulatie.
Fibroblasten een heterogene celpopulatie met betrekking tot de expressie van marker moleculen evenals in de herkomst en signaleringseigenschappen 8,10,18. Terwijl PDGFRα is een robuust oppervlak marker voor fibroblasten, is het niet etiket 100% van fibroblasten in alle weefsels resulteert in een ongemerkt subpopulatie van cellen, afhankelijk weefseltype. In huid ongeveer 90% van fibroblasten PDGFRα + (niet weergegeven), terwijl in borstklieren ongeveer 85% van de totale weefsel fibroblasten PDGFRα + (figuur 2C). Het percentage PDGFRα uiten fibroblasten kunnen variëren in ander weefsel typen, en moet worden gedefinieerd voor elke weefsel. Niettemin in huid en borstklieren, zal gebruik PDGFRα als celoppervlaktemarker tot sterk verrijkte populaties van de meeste weefsels fibroblasten, waardoor expression profiling of kweken van cellen gesorteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken dr. Jitschak Oschry en Dr Orit Sagi-Asif voor hun hulp bij FACS sortering. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan NE van de Europese Unie zevende kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr. [276890], van het Israël Cancer Association (# 20110078), en van de Israëlische Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 Forthcoming.
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
