Summary
암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.
Abstract
암 관련 섬유 아세포은 (CAFs) 특히 유방 암에, 많은 암의 종양 기질 내에서 가장 눈에 띄는 세포 유형으로, 그들의 눈에 잘 띄는 존재는 종종 가난한 예후 (豫后)의 1,2와 연결되어 있습니다. CAFs는 stromal 섬유 아세포의 활성화 subpopulation 있으며, 그 중 많은 myofibroblast 표시 α-SMA 3 표현한다. CAFs 지역 조직 섬유 아세포에서뿐만 아니라 골수 유래 세포 개발 종양으로 모집하고 종양 microenvironment (4)의 영향 아래 CAF의 표현형을 채택에서 유래. CAFs는 종양 세포 증식, 혈관 신생, 그리고 침략 5-8을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진하기 게재되었습니다. 우리는 CAFs는 초기 사전 neoplastic 단계 9시 시작, 종양 - 홍보 염증을 중재하여 종양 성장을 향상 것을 보여 주었다. 키 역할 CAFs의 증가에도 불구하고 증거가 종양 성장을 촉진에서 재생공부 CAFs은 종양 microenvironment 10 공동 기존의 여러 하위 유형이있는 CAF 특정 마커 및 이들 세포의 광대 한 이질성의 부족으로 인해 지속적 도전했다. 또한, 체외에서 섬유 아세포를 공부하는 것은 자신의 유전자 발현 프로파일은 종종 조직 배양 11,12에서 변경 있다는 사실에 의해 방해된다. 이 문제를 해결하기 위해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포의 편견 유전자 발현 프로파일을 허용하기 위해 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 13,14의 이전 프로토콜을 기반으로하는 방법을 개발했습니다. 우리 접근 방식은 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포를 분리 할 수있는 표면 마커로 PDGFRα을 사용에 의존하고 있습니다. PDGFRα이 넘치게 일반적인 섬유 아세포와 CAFs 9,15 모두에 의해 표시됩니다. 이 방법은 등의 일반적인 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구,의 고립하지만이 α-SMA으로 제한 할 수 있습니다 + myofibroblasts을 활성화. 절연 섬유 아세포는 할 수 있습니다특성화 및 tumorigenesis 동안 CAFs에서 발생하는 유전자 발현의 진화 비교에 사용됩니다. 사실, 우리와 다른 사람들은 16 정렬 세포에 의해 고립 된 섬유 아세포의 표현 프로파일을 발표했다. 이 프로토콜이 성공적으로 피부, 유방, 췌장과 폐 조직에서 섬유 아세포의 매우 풍부한 인구를 분리 및 프로필하기 위해 수행되었다. 또한, 우리의 방법은 작동 실험을 수행하는 문화 CAFs하려고 할 때 종종 큰 장애물입니다 종양 세포에 의한 오염을 방지하기 위해, 정렬 세포의 배양 할 수 있습니다.
Protocol
1. 마우스에서 유방이나 피부 조직을 박리
- 마우스에서 원하는 조직을 해부하기 전에 다음과 같은 용품 및 시약을 준비 :
공급 :
- 수술 도구 (세제로 세척 한 후 70 % 에탄올에 담근).
- 스티로폼 표면은 절개 중에에 마우스를 말이다.
- 핀이나 바늘은 절개 중에 쥐를 개최합니다.
- 자기 저어 바 (autoclaved)를 포함하는 소화 뚜껑 유리 항아리.
- 37 번 물을 욕조 ° C, 저어 판에 쉬고있는 동안, 잠수함 자기 교반기와 잠수함 소화 병을 할 수있을만큼 물을 포함.
시약 :
- FACS 버퍼 I : (4 ° C) : Dulbecco의 인산이 (칼슘 마그네슘 무료) 식염 CMF 버퍼 + 0.5 % BSA
- Collagenase 솔루션 (바로 사용하기 전에 한) :
0.05 g Collagenase II
0.05 g Collagenase IV
0.01 g의 Deoxyribonuclease
20ML FACS 버퍼 I.는 사용까지 얼음에 collagenase 솔루션을하세요. - PharmLyse (염화 암모늄의 Lysing 시약).
- FACS 버퍼 II : Dulbecco의 인산이 식염 CMF 버퍼 + 1% FCS합니다.
- 유방 땀샘의 해부 (또한 17 참조).
- 이산화탄소 (CO 2) 흡입을 사용하여 여성의 쥐를 안락사시켜야.
- 스티로폼 표면에서의 뒷면에 마우스를 놓고 단단히 25 게이지 바늘 (그림 1A)를 사용하여 사지를 핀. 70 %의 에탄올과 넉넉한 마우스를 스프레이.
- 집게를 사용하여 중간 선에서 복부 피부를 당겨와 날카로운 가위로 작은 절개를합니다.
- 복부 나 가슴 충치를 펑 쳐링 피하는 동안 절개부터, 동물의 목에 피부를 잘라.
- "Y 모양"의 결과로, 다리에 대한 중간 선 절개의 후면 다리에 피부를 잘라.
- 마우스 몸에서 떨어진 피부를 당겨 아래로 핀, 노출유방 땀샘은 피부의 아래쪽 (그림 1B)에 부착.
- 마우스의 척추를 향해 유선을 분리하는 작은 날카로운 가위로 결합하는 조직을 절단하면서 부드럽게 피부의 유방 땀샘을 분리하는 Q-팁을 사용하십시오.
- 복부 분비 (# 4, 5)이 프로토콜에 가장입니다. 당신은 또한 2 차 유선을 사용하지만, 이러한 분비는 해부학 적 혼합 조직 출신 세포의 결과로, 별도의하기 어려운 경우도 있습니다 pectoralis 근육 가까이에있는 것을 명심 수 있습니다.
- 참고 : 종양 조직을 해부 할 때,이 괴사 영역을 제거하는 것이 좋습니다.
- 피부 조직의 해부 : 머리 제거 처리 할 필요없이, 피부 조직을 취득하는 가장 쉬운 방법은 마우스 귀를 사용하는 것입니다. 조직의 큰 금액이 필요한 경우, 당신은 마우스 몸에서 머리를 면도하고 피부를 해부 할 수 있습니다.
- CO 2 흡입을 사용하여 쥐를 안락사시켜야.
- 날카로운 가위를 사용하여 얼음에 PBS의 작은 볼륨 (~ 0.5 ML)를 포함하는 소화 병에 즉시 귀 및 장소를 모두 잘라.
2. 유선 / 피부 단일 세포 현탁액의 준비
- 유방 땀샘 / 얼음 PBS의 작은 볼륨을 포함하는 소화 병의 피부를 놓습니다. 조직 한 다음 PBS로 세척을 피 X2이며, 경우 초과 PBS를 폐기하십시오.
- 곡선 가위로 철저하게 이기다.
- 20 ML의 collagenase 솔루션 (참고 : collagenase 솔루션의 양이 효율적으로 15 쥐 최대의 유방이나 종양 조직과 귀를 약 5g을 떼어 놓다 것)을 추가합니다.
- 37 판을 저어에 즉시 배치 ° 15 분에 C 물 욕조 및 품다 중간 속도로 교반하면서.
참고 : 다른 조직을 소화하는 경우 최적의 배양 시간이 다를 수 있습니다.
- 반응을 중지하려면, 30 ML 차가운 DMEM + 10% FCS를 추가합니다.
- 조직 / 미디어 혼합을 통해서 스트레인헥타르 70 μm 전지 스트레이너는 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치.
- 4에 450 XG에서 5 분의 원추형 튜브를 원심 분리기 ° C.
3. 적혈구의 용해
참고 :이 희생되기 전에 쥐가 PBS로 마음 perfused 있다면이 단계가 필요하지 않습니다.
- 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서, 진공에 부착 된 유리 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 대기음.
- 상온에서 5 분 10 ML의 PharmLyse 솔루션과 배양에 RBC, resuspend 세포 펠렛을 lyse합니다.
- FACS 버퍼 I.의 약 40 ML을 추가하여 PharmLyse 솔루션을 중화
- 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분을위한 세포와 원뿔 튜브를 스핀
- 표면에 뜨는을 대기음.
4. 내생 FC의 차단
- 선택 사항 : 다음 단계에 해당하는 양을 결정하는 셀 수.
- 1-3 ML FACS 버퍼 I에 Resuspend 세포 (O를 따라사용하려는 N 셀 번호 및 항체의 양).
- 1시 50분 희석 (10 μg / ML)에 도달하고, 10-20 '을 얼음에 품다 할 FcBlock (안티 - 마우스 CD16/CD32)를 추가합니다.
아니오 FcBlock 씻어 필요가 없습니다.
5. 더럽히는 것
- 해제 - 스테인드 제어 및 단일 색상 컨트롤 (사용 형광 항체의 수에 따라)으로 사용할 eppendorf 튜브에 100 μl aliquots을보십시오.
- 라벨 섬유 아세포로 : 1시 50분의 희석 (10 μg / ML)에 (형광에 직접 복합) 방지 PDGFRα를 추가합니다.
- 다른 세포 집단 (예를 들면 면역 세포, 대 식세포, 내피 세포 등) 라벨 : 1시 50분 희석에, 표면 마커에 적절한 휘황 복합 항체를 추가합니다.
참고 : PDGFRα는 섬유 아세포에 대한 강력한 마커이지만, 그것은 어떤 이중 긍정적를 제외하기 위해 면역 세포와 상피 세포에 대한 항체를 포함하는 것이 좋습니다인구 및 따라서는 고립 된 섬유 아세포의 순도를 향상시킬 수 있습니다.
- 단일 색상 제어 eppendorf 튜브의 각 각 항체의 2 μl를 추가합니다.
- 어둠 속에서 얼음에 1 시간에 대한 항체와 세포를 배양.
- 세탁 방법은 다음과 같습니다 FACS 버퍼 I와 튜브를 작성하여 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분에 스핀
- 약 2 X 10 6 세포 / ML, 또는 중 사용 가능한 FACS의 정렬과 정렬을위한 가장 적합한 농도의 농도에 I를 버퍼링 FACS에 표면에 뜨는, resuspend 세포를 대기음.
선택 사항 : 셀이 분류의 기간 동안 FACS 버퍼 II에 resuspended 될 수 있습니다. 이 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 혈청의 요인에 노출, 테스트 및 고려해야 효과 유전자 발현을 할 수 있습니다.
- 셀 clumps을 방지하기 위해 튜브에 필터 셀 : 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 셀을 전송합니다.
- 죽은 세포를 제외하려면 7AAD을 (0.5 μg / ML) 추가 또는 형샘플에 idium의 요오드화물 (PI) (을 취소 스테인드 제어 제외).
참고 : 셀을 낭비하지 않도록하려면 FACS에 기록 후 해제 - 스테인드 샘플에 7AAD/PI을 추가하고 7AAD 전용 컨트롤로 다시 사용할 수 있습니다.
- 분석하는 동안 얼음에 샘플을 보관.
6. FACS에 의한 세포의 분리
(참고 : 프로토콜의이 부분은 FACS의 정렬, 예를 들어 BD FACS AriaII, 또는 숙련 된 기술자의 도움을 운영에 이전 지식을 필요).
- FACS 정렬 소프트웨어 (BD FACSDiva)를 사용, 앞으로 분산 (FSC), 측면 분산 (SSC), 7AAD, FITC, PE 및 레이블 셀 (그림 2)에 사용되는 다른 형광을 분석하기 위해 적절한 분석 음모를 준비합니다.
- 셀 정렬 각 샘플을로드하기 전에 소용돌이가 간단히 세포를 resuspend합니다.
- cel에서 게이트로, 총 세포 인구의 게이팅을 설정하기 위해 흠없는 샘플을 분석하여 시작난 파편, 그리고 autofluorescence이나 배경 착색을 결정합니다.
- 전체 세포 인구에서 라이브 세포의 인구를 결정하고 게이트 흠없는 샘플 + 7AAD를 분석합니다.
- 이러한 보상 등의 매개 변수를 결정하고 보정 각 단일 색상 제어를 분석합니다.
- 정렬 게이트의 위치를 정의하기 위해 스테인드 샘플을 분석합니다.
- 일단 원하는 세포 인구에 대한 매개 변수 및 문이 설정되었으며, eppendorf 튜브 나 문화 매체 또는 RNA의 용해 버퍼를 (예 : RLT 버퍼 또는 Trizol 등)가 포함 된 15 ML 원뿔 튜브에 표시된 셀 인구 정렬 시작합니다.
참고 : 셀의 많은 정렬하는 경우가 세포 용해 버퍼를 희석하고 수율을 줄일 수 있습니다 동반 피복 유체의 큰 볼륨으로, RNA의 용해 버퍼에 직접 정렬하는 것은 권장하지 않습니다.
- 신선한 중간이나 RNA의 용해 버퍼 드에 정렬이 완료 된 후 다운 즉시 세포를 회전 및 이동실험의 목적에 대기 중입니다.
- 문화 절연 셀에 순서대로 정렬하면 멸균 정렬을 수행합니다. 세포의 더 나은 복구를 들어, 페놀 레드 무료 DMEM + 5퍼센트 FCS 대신 FACS 버퍼 II를 사용하여 20 % FCS와 문화 매체에 세포를 수집합니다.
- 배양은 섬유 아세포를 정렬하면 자신의 유전자 표현의 변화로 이어지는 섬유 아세포의 활성화에이 결과로 플라스틱 콜라겐 코팅 접시에 alwaysplate 결코 직접적으로.
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Representative Results
조직 섬유 아세포의 높은 풍부한 인구의 고립 된 섬유 아세포 결과의 표시로 PDGFRα을 사용합니다. 정렬 후 순도의 수준은 후 정렬 분석 (그림 2A)에 의해 정량 99 %이다. 셀 - 특정 제어 유전자의 상대적 표현 (그림 2B)에 의해 비 섬유 아세포 세포를 오염 수의 비율을 추정하는 것은 일반적으로 0.1-0.6 %의 오염을 보여줍니다. 순도 수준은 절연 섬유 아세포 9 고품질의 transcriptome 프로파일 할 수 있습니다.
유방 땀샘에서 조직의 섬유 아세포의 비율은 정상 유방 조직에서 5-20%, 그리고 MMTV-PyMT 종양의 1-5% 사이에 다릅니다. 종양 조직에서 섬유 아세포의 상대적 비율은 상피 구획의 대규모 확장으로 인해 섬유 아세포의 총 수 증가에도 불구하고, 사전 neoplastic 조직에 비해 낮습니다. 종양 조직에서 분리 섬유 아세포의 감소 %도의 결과입니다기술적 어려움을 추가하고 매우 괴사 조직에서 세포 정렬의 효율성을 감소.
절연 섬유 아세포는 정렬 후 직접 배양 할 수 있지만, 며칠 (그림 2D) 복구해야 할 수 있습니다. 주요 섬유 아세포는 문화의 전파하는 동안 노화를 받아야로 낮은 통로 세포, 모든 추가 실험을 수행 할 필수적입니다.
1 그림. 신선한 유방 땀샘에서 섬유 아세포의 정화. A-FVB / N / PyMT 마우스. 유방 땀샘을 B-이라. C-신선한 유방 땀샘이 FVB / N / PyMT 마우스에서 해부하고 단일 세포 현탁액에 collagenase를 소화했다. 셀 섬유 아세포 표면 마커 (PDGFRα) 및 mA에 대한 항체와 면역 - 라벨이 붙지 만crophages 표면 마커 (F4/80)는 FACS로 분리 한 다음. 정렬 섬유 아세포는 어느 배양 또는 RNA 정화에 lysed되었습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 정렬 섬유 아세포의 프로파일. 마우스 유방 땀샘의 A-싱글 셀 중지는 PDGFRαand F4/80 항체 물들했다. FACS 정렬 음모가 (왼쪽 패널) 표시됩니다. P2는 섬유 아세포 게이트 (PDGFRα + 세포)이며, P4는 대 식세포 게이트 (F4/80 + 세포)입니다. 게시물 정렬 분석 정렬 섬유 아세포와 대 식세포 (가운데 및 오른쪽 패널)의 순도를 결정하기 위해 수행되었다. fibrobla에 대한 세포 특정 제어 유전자의 qRT-PCR에 의한 분류 순도 B-분석성 (PDGFRα, 콜-1α), 면역 세포 (CD45, CSF-1R)과 상피 세포 (E-cadherin). 결과는 두 집 보관 유전자 (GAPDH와 mGUS)로 표준화되었다. GAPDH에 상대적으로 표현이 표시됩니다. 유방 섬유 아세포의 총 정렬되지 않은 인구 PDGFRα 표현의 C-정량화. 정렬 섬유 아세포의 D-조직 문화. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
조직 문화에 실험을 유익하게 생체에서 확인 할 수 있습니다 기능 원리를 제안 할 수 있지만, 그것은 문화 11,12의 세포의 유전자 발현에 큰 변화가 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 섬유 아세포의 유전자 발현 프로파일 링 할 때 조직 문화 단계를 피하기 위해, 우리는 할 수 있습니다 신선한 마우스 또는 인체 조직의 정상뿐만 아니라 암 관련 섬유 아세포의 분리.에게 프로토콜을 개발 이 프로토콜이 성공적으로 마우스와 인간 9 일부터 피부, 췌장 및 유방 조직에 적용되었습니다. FACS 정렬에 의한 섬유 아세포의 절연은 표면 마커 라벨의 섬유 아세포가 필요합니다. 우리는 PDGFRα는 섬유 아세포 9 매우 풍부한 인구의 절연을 수있는 강력한 표면 마커입니다 설립했다. 또한, PDGFRα 따라서 편견 절연 및 프로파일 조직 섬유 아세포의보다 focusi을 허용, 일반 조직 섬유 아세포 모두와 CAFs에 표시됩니다특정 subpopulation에 NG.
섬유 아세포는 마커 분자의 표현에 관해서는뿐만 아니라 자신의 출발지와 신호 특성 8,10,18의 이기종 셀 인구입니다. PDGFRα는 섬유 아세포에 대한 강력한 표면 마커이지만, 그것은 조직 유형에 따라 세포의 라벨이없는 subpopulation의 결과로 모든 조직에서 섬유 아세포의 100 %에 라벨을하지 않습니다. 유방 땀샘에서 총 조직 섬유 아세포의 약 85 %가 PDGFRα + (그림 2C)하는 동안 피부에 섬유 아세포의 약 90 % (미도시)에 PDGFRα +입니다. PDGFRα 표현 섬유 아세포의 비율은 다른 조직 유형에 따라 다양하며 각 조직에 대해 정의해야 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 피부와 유방 땀샘에서 세포 표면 마커로 PDGFRα을 활용하면 정렬 세포의 표현 프로파일 또는 배양을 허용, 조직 섬유 아세포의 대부분의 매우 풍부한 인구가 발생합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 FACS 정렬과의 도움을 박사 Yitzchak Oschry 박사 Orit Sagi - Asif 감사드립니다. 이 연구는 보조금 협정 N 아래에있는 유럽 연합 (EU) 세븐 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에서 NE에 대한 교부금에 의해 지원되었다 ° [276890] 이스라엘 암 협회 (# 20110078)에서와 이스라엘 암 연구 기금 (연구에서 경력 개발 상).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
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