Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em> Arabidopsis Cotyledon</em> Epidermis während der Keimung
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.
Abstract
Imaging in vivo Dynamik zellulärer Verhalten während einer Entwicklungsstörung Sequenz kann eine leistungsstarke Technik für das Verständnis der Mechanik des Gewebes Strukturierung sein. Während tierischen Entwicklung treten Schlüssel Zellproliferation und Strukturierung Ereignisse sehr schnell. Zum Beispiel, in Caenorhabditis elegans alle Zellteilungen für die Larven Bauplan erforderlich sind innerhalb von sechs Stunden nach der Befruchtung abgeschlossen, mit sieben mitotische Zyklen 1, die sechzehn oder mehr Mitosen von Drosophila Embryogenese treten in weniger als 24 Stunden 2. Im Gegensatz dazu sind Zellteilungen der Pflanzenentwicklung langsam, typischerweise in der Größenordnung von einem Tag 3,4,5. Dies stellt eine einzigartige Herausforderung und eine Notwendigkeit für die langfristige Echtzeit-Bildgebung für die Dokumentation dynamische Verhalten der Zellteilung und Differenzierung Ereignisse während Pflanzen Organogenese. Arabidopsis Epidermis ist ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung Signalisierung, das Schicksal der Zelle, und die Entwicklung der Pflanzen. In der cotyledon besteht dieses Gewebe von Luft-und Wasser-resistente Pflaster Zellen mit gleichmäßig verteilten Spaltöffnungen, Ventile sich öffnen und schließen, um den Gasaustausch und Wasserverlust zu kontrollieren. Richtigen Abstand dieser Spaltöffnungen ist entscheidend für ihre Funktion und ihre Entwicklung folgt eine Sequenz von asymmetrischen Teilung und Zelldifferenzierung Schritte, um die organisierte Epidermis (Abb. 1) zu produzieren.
Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung der Zellen und Proteine in der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung. Dieser Zeitrahmen ermöglicht eine präzise Dokumentation der Stammzell-Divisionen und Differenzierung von epidermalen Zellen, einschließlich Spaltöffnungen und epidermalen Pflaster Zellen. Fluoreszierende Proteine können zu interessierenden Proteine fusioniert werden, um ihre Dynamik während der Zellteilung und Differenzierung Prozesse zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht es uns, die Lokalisierung eines neuen Proteins, POLAR 6 zu verstehen, während der Proliferation Stadium der Stomata-lineage Zellen in the Arabidopsis Cotyledone Epidermis, wo sie in Zellen asymmetrischen Teilung vorhergehenden Ereignisse und bewegt sich zu einem charakteristischen Bereich des Zellcortex kurz vor Teilung erfolgt exprimiert wird. Bilder können registriert und gestrafft werden Video leicht unter Verwendung Public Domain Software, um dynamische Protein-Lokalisierung und Zelltypen zu visualisieren, wie sie im Laufe der Zeit ändern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Zeitraffer-konfokalen Technik erlaubt Längsschnittstudien von fluoreszierend markierte Protein Expression und Lokalisierung in einzelnen Zellen der Arabidopsis Cotyledone Epidermis, die im Fall von polaren und andere dynamisch ändernden Proteinen ist entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion. Zuvor hat anhaltende Zeitspanne Bildgebung verwendet worden, um Arabidopsis root Pilzinfektion 11 und Meristem Wachstum 5,12 untersuchen, sondern indem die cotyledon Epidermis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Amanda Rychel für die Unterstützung bei der Entwicklung der Zeitraffer-Protokoll und Lynn Pillitteri für den Bau von POLAR :: POLAR-eGFP. Wir sind auch dankbar ABRC für die Bereitstellung der pm-rb konstruieren. Dieses Protokoll wurde durch eine Unterstützung aus dem PRESTO Auszeichnung von Japan Science Technology and Agency entwickelt. Forschung POLAR wurde auch von der University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) und der National Science Foundation (MCB-0855659) unterstützt. KMP ist ein NSF Graduate Research Fellow (DGE-0.718.124) und KUT ist ein HHMI-GBMF Ermittler.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. . Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
