Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.
Gelişimsel bir sıra boyunca hücresel davranışı in vivo dinamiği Görüntüleme doku desenlendirme mekaniğini anlamak için güçlü bir teknik olabilir. Hayvan gelişimi sırasında, anahtar hücre çoğalması ve desenlendirme olaylar çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Örneğin, Caenorhabditis elegans larva vücut planı için gerekli tüm hücre bölünmeleri yedi mitotik çevrimleri 1, döllenmeden sonra altı saat içinde tamamlanır; Drosophila embriyo on altı veya daha fazla mitoz az 24 saat 2 görülür. Buna karşılık, bitkisel gelişimi sırasında hücre bölünmesi, genellikle günde bir 3,4,5 düzeni üzerinde, yavaştır. Bu eşsiz bir meydan okuma ve hücre bölünmesi ve bitki organogenez sırasında farklılaşma olayları dinamik davranışları belgelemek için uzun vadeli canlı görüntüleme için bir ihtiyaç yüklemektedir. Arabidopsis Epidermis araştıran sinyalizasyon, hücre kaderinin ve bitkilerin gelişim için mükemmel bir model sistemi. Kotiledon, bu doku oluşur hava ve eşit dağıtılmış stoma serpiştirilmiş suya dayanıklı kaplama hücreleri, vanalar açılır ve gaz değişimi ve su kaybı kontrol yakındır. Bu stoma Uygun aralık kendi işlevi için önemlidir ve onların gelişimi asimetrik bölünme ve organize epidermis (Şekil 1) üretmek için hücre farklılaşması bir dizi adımı izler.
Bu protokol, gelişme birkaç gün boyunca hücreleri ve epidermis içinde proteinlerin gözlem izin verir. Bu zaman çerçevesi kök hücre bölünmeleri ve stoma ve epidermal kaldırım hücreleri de dahil olmak üzere epidermal hücrelerin farklılaşma hassas belgelere sağlar. Floresan proteinleri hücre bölünmesini ve farklılaşmasını işlemleri sırasında dinamik değerlendirmek için ilgi çekici proteinler oluşturacak şekilde eklenebilir. Bu teknik, th stomatal-soy hücrelerinin proliferasyonu aşaması sırasında, bize yeni bir protein, POLAR 6 lokalizasyonu anlamak olanak tanırasimetrik bölünme olayları ve bölünmesi meydana kısa bir süre önce hücre korteksin karakteristik bir alana hamle önceki hücrelerde ifade edilir e Arabidopsis kotiledon epidermis. Görüntüleri kayıt ve akıcı görüntü kolaylıkla zamanla değişebilir gibi dinamik protein lokalizasyonu ve hücre tipleri görselleştirmek için kamuya açık yazılımı kullanılarak üretilebilir.
Bu hızlandırılmış konfokal teknik fluoresan etiketli protein ekspresyonu Kutup ve başka dinamik olarak değişen bir protein halinde kendi işlevini uygun bir anlaşılması için önemli olan Arabidopsis kotiledon epidermis, bireysel hücrelerin içinde lokalizasyon uzunlamasına çalışmalar izin verir. Önceden, sürekli zaman atlamalı görüntüleme Arabidopsis kök mantar enfeksiyonu 11 ve meristem büyüme 5,12 incelemek için kullanılan, ancak kotiledon epidermisin…
The authors have nothing to disclose.
Biz POLAR :: POLAR-eGFP oluşturmak için zaman atlamalı protokolü ve Lynn Pillitteri geliştirmede yardım için Amanda Rychel ederim. Biz de am-rb inşa sağlamak için ABRC minnettarız. Bu protokol, Japonya Bilim Teknoloji ve Kurumu'ndan PRESTO ödülü bir destek ile geliştirilmiştir. POLAR Araştırma ayrıca, Washington Royalty Araştırma Fonu (RRF-4098) ve Ulusal Bilim Vakfı (MCB-0855659) Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. KMP bir NSF Lisansüstü Araştırma Görevlisi (DGE-0718124) ve KUT bir HHMI-GBMF dedektif.
Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Bacto Agar | BD | 214010 | |
One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
#5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |