Summary
我们描述了一个协议，用玻片和媒体的固定几天的发展，记录植物子叶共聚焦成像的表皮气孔分化。萤光标记的蛋白质，可以动态跟踪的表达和亚细胞定位，细胞分裂和细胞分化过程中增进了解其可能的作用。
Abstract
在整个发育序列体内的细胞行为的动态影像可以是一个强大的技术了解组织图案的机制。在动物发育，的关键细胞增殖和图案的事件发生得非常快。例如，在秀丽隐杆线虫的幼虫体内所有细胞分裂计划完成后6小时内受精，与七个有丝分裂周期1; 果蝇胚胎发育的16个或更多的有丝分裂发生在不到24小时2。与此相反，在植物发育的细胞分裂是缓慢的，通常在一天3,4,5的顺序。这会带来了独特的挑战和记录植物器官的细胞分裂和分化过程中的动态行为，需要进行长期实时成像调查信令，细胞命运和发展，在植物拟南芥表皮是一个很好的模型系统。。在子叶，这种组织是由空气和抗水的路面细胞穿插均匀分布的气孔，阀的打开和关闭控制的气体交换和水分损失。这些气孔的适当的间距，它们的功能是至关重要的，和它们的发展如下不对称分裂和细胞分化的步骤来产生有组织的表皮（ 图1）的序列。
该协议允许在表皮细胞和蛋白质的观察超过几天发展。这个时间框架的干细胞分裂和分化的表皮细胞，包括气孔和表皮路面细胞可以精确的文档。荧光蛋白可以稠合到感兴趣的蛋白的细胞分裂和分化过程期间，以评估它们的动态。这项技术使我们了解了一种新的蛋白质，POLAR 6的国产化，在气孔系细胞的增殖阶段，在日Ê的拟南芥子叶的表皮，它是在不对称分裂事件和细胞皮层不久之前分裂发生的一特征区移动到前面的细胞中表达。图片可以注册和流线型的视频轻松使用公共域软件的可视化动态和蛋白定位的细胞类型，因为它们随着时间的推移而改变。
Protocol
1。种子消毒
- 准备种子消毒液：33％的家用漂白剂，0.1％的Triton X-100。
- 广场种子携带所需的荧光记者的结构（S）和1.7 ml管型（S）和适用于1毫升灭菌水溶液。孵育15分钟nutator。
- 在无菌罩，使用移液器删除解决方案，从管消毒，背后留下的种子。用1ml无菌水冲洗。重复四次。
- 在4℃下孵育2天或以上。
2。商会的媒体的制备
- 20毫升0.5％Bacto琼脂（不是纯粹的琼脂糖），在水中在200毫升的烧瓶中，和微波溶液混合直至溶解。沸腾的解决方案时一定要小心。
- 该溶液冷却至约60℃。
- 收集1毫升的琼脂溶液用移液管，慢慢地适用于玻璃盖内的Lab-Tek II双腔室幻灯片（德国盖玻片＃1.5系统）。解w高血压脑出血是太热或太快，可能会熔化，胶水或裂纹玻璃。
- 立即添加第二个琼脂溶液的毫升。琼脂培养基上，现在应该完全覆盖滑动室的底部。这个最小的媒体足够的支持子叶的植物，其中包含储存的营养物质，保持水分，使气体扩散为四到五天的发展。
- 与台式酷溜室覆盖。如果烧瓶盖紧，溶液可能被保存和再加热，以备将来使用。
3。种子解剖
- 从4°C存储，删除不育种子管。
- 放置在舞台上，在解剖显微镜和纸巾与水滋润。调整组织来创建一个平滑的表面。组织被用于稳定种子解剖。
- 吸取20-30的种子从管组织，小心翼翼地将它们放置在解剖范围的视野。
- 使用锋利的钳子（Roboz，＃5生物学尖端），小心地取出种子，从幼苗内。两外层和内珠被必须被移除。
- 当成像子叶，这是有利于除去的下胚轴和胚根。胚子含有足够的营养，在此协议下发展了好几天。如果完好，下胚轴将整顿和延长戏剧性的是，移动子叶时间的推移视野。用手术刀切子叶下胚轴。
- 维持解剖子叶浸渍在水中，在微管或类似。
- 重复,3.4-3 .6，直至达到所需数量的子叶。 15-20成功的解剖之前，建议安装。
4。在会议厅内的幻灯片安装胚子
- 使用一个小的（18毫米）盖玻片，穿过琼脂培养基室幻灯片的玻璃基板整层。
- 移液管解剖子叶从保持的最低水管进入腔滑动，根据解除的琼脂层。
- 轻轻地放下琼脂上的子叶。如果存在过量的水，浸泡用纸巾，小心不要打扰子叶。样品应不再移动时，容易安装完成。
- 将盖室幻灯片和显微镜载物台移动幻灯片。
5。时间的推移成像
- 倒激光共聚焦显微镜图像所需的荧光（S）。 LSM700使用的参数：GFP的激发波长为488 nm和收集在440-530 nm的带通滤波器; RFP，在555nm处和收集在570-610 nm的带通滤波器的激励。
- 检查是否有损坏的标本。编程的位置，完整，正确安装的子叶到显微镜的软件。 2009年在禅宗：聚焦一个子叶与20倍的目标，移动目标为中心的室内滑梯。在采集模式 ，改变缩放到0.5和帧大小</ em>的48x48像素。下位置，选择位置 “复选框和扫描概述图片...”按钮，然后增加水平和垂直的瓦数为30-35。当扫描完成后，单击该的位置按钮下的“ 尺寸 ”选项卡和地点十字线，在每个子叶观察。
- 设置z系列，围绕这些的子叶表皮的2009年所有samples.In禅：Z-Stack的复选框。下位置列表中选择每个位置，然后单击“ 移动 ”按钮。专注于子叶表皮的最上面的平面，单击“ 设置 ”下的第一个按钮的Z-Stack。重点在表皮是有益的可见至最低位置， 最后单击“ 设置 ”按钮。单击该按钮旁边的优化 ，这显示出最佳的Z-层厚，设置。检查每个子叶，以确认这些设置包括所有样品的Z参数不能设置为个人，禅2009年idual位置。
- 设置所需的分辨率和长度的时间序列。在表皮细胞分裂的蛋白质动力学间隔为15-30分钟三天有效。此时间间隔可以根据需要改变。 2009年在禅宗：单击“ 时间序列 ”复选框。在时间序列中 ，设置循环使用滑块或在文本字段中键入所需的图像的数量。设置时间间隔为30，并使用下拉菜单选择分 。
- 开始XYZT多位置扫描。请注意，由扫描规格的位置的数目必须限制，如果总的扫描时间是大于所需的时间间隔，将不正确的时间点。成像时，GFP和RFP在59 Z-片在30分钟的时间间隔使用我们的系统，最多同时六的位置是可能的。 2009年在禅宗：改变帧尺寸 ，所需的分辨率，然后点击开始实验 。
6。视频编辑
- 从的共聚焦数据文件，使Z-投影每个时间/位置组合和出口为无损格式，如TIFF图像文件的最大强度。文件名 应该是在每一个系列的位置（ 例如 ，软件将它们组合成一部电影的POLAR-GFP_pos1_0001，POLAR-GFP_pos1_0002等，而不是POLAR-GFP_0001_pos1）。 2009年在禅宗：使用复制子集下的“ 处理 ”选项卡，分裂成单独的文件，然后最大强度投影的位置。最后，导出为TIFF 文件：出口，全分辨率图像窗口- （系列 ）。
- 使用FIJI 7,8使连续运行的bUnwarpJ宏（ 插件：注册：bUnwarpJ）的图像。变更登记模式为单声道。所有的高级选项可以使用默认值。长的时间间隔序列，下载并安装宏“仿射+一致的弹性2D图像配准”，这将申请bUnwarpJ的一系列图像，自动，和开放Ÿ我们的数据文件：导入：图像序列中使用它。取消选中MOPS地标提取和运行。
- FIJI / ImageJ的或QuickTime Pro打开的顺序排列的，并保存在需要的视频格式（AVI是一个不错的选择）。
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Representative Results
用这种方法收集的信息的时间点的一组是在图3中所示。细胞膜被标记为与RFP（PM-RB）和GFP融合POLAR蛋白质在其本地子（的POLAR :: POLAR-GFP）在30分钟的时间尺度，我们可以看到细胞分裂蛋白定位的变化他们前面。非对称细胞分裂在气孔血统形式的干细胞，如气孔，它保留接受进一步的不对称分裂的能力，meristemoids和他们的姐妹细胞的前体，称为气孔的血统地细胞（SLGCs）。的SLGCs不承担气孔的前体的命运，他们经常转分化成路面的细胞，但可能会继续不对称分裂能力产生另一种拟分生组织隔开，从第一叶的扩大。所有这些命运的表达和定位的POLAR :: POLAR-GFP（ 图1）3，视频中反映。
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原理图如图1所示。气孔的发展。 Protodermal细胞进入气孔血统，meristemoid母细胞（MMC）的基本螺旋 - 环 - 螺旋转录因子SPEECHLESS（SPCH），SCREAM（SCRM），SCRM2控制中的一个步骤。金属基复合材料非对称分裂产生meristemoid的（M）和气孔的谱系接地单元（SLGC）的，此步骤中，可能会发生多次，并提供了一种机制，通过该气孔隔开。保护母细胞（GMC）的拟分生组织的细胞的状态过渡的身份是针对专门由以及SCRM / 2的bHLH静音。最后一个对称分裂的GMC，其分化成两个成熟的保卫细胞（GC）需要使用：FAMA SCRM / 2 10 BHLH。ig1large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图2。图种子解剖和安装过程的。将种子灭菌并保持在4℃下，种皮和下胚轴去除，和子叶安装在琼脂培养基上，在用于成像在一个倒置的共聚焦显微镜的室滑动。
图3。时间推移成像演示的POLAR :: POLAR-GFP远端定位不对称的细胞分裂前。 A系列：POLAR-GFP最初出现均匀分布，然后大约两小时前，不对称性的TRIC部门（箭头）POLAR-GFP隔离距离的初期拟分生组织的网站。 B辑：继最初的不对称分裂（箭头），POLAR-GFP两种细胞中消失，这意味着快速过渡，以防止母细胞（GMC）的拟分生组织状态。 GMC（星号）将对称的，并分化形成气孔保卫细胞，，而妹妹细胞恢复POLAR-GFP的表达，大概预示着以后的不对称分裂。
视频1。精简，注册的视频POLAR ::的POLAR-GFP定位在一个气孔的前体细胞的扩增和间距。最初，POLAR-GFP均匀地出现在单元格中;发芽后39小时，它偏振强烈，之前除法（40.0h）放置一个较小的拟分生组织的细胞的相对端处。更大的电池在正确的恢复气孔血统的身份，并通过45小时的POLAR-GFP本地化移动相邻的气孔前体。该部门在47小时产生一个新的拟分生组织（右）面向从现有的拟分生组织（左）从第一。最终的结果是两个分隔的一个单元格的气孔。 （从视频图像丢失收集，并不代表显著的变化。） 点击这里观看电影 。
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Discussion
这个时间的推移激光共聚焦技术使荧光标记的蛋白质在拟南芥的子叶表皮，极性和动态变化的蛋白质的情况下，其功能是至关重要的一个正确的认识，单个细胞中的表达和定位的纵向研究。此前，一直持续时间延时成像用于检查拟南芥根真菌感染11和分生组织的生长5,12，但添加子叶表皮扩大这种技术的多功能性，并允许其使用额外的蛋白质，特别是协助气孔发展领域的不断扩大。
该协议的主要限制是，它是目前仅限于子叶，其中包含他们所需要的营养物质的早期开发。另外，子叶发展是不完全相同的，在空气中经过，因为凝胶介质限制气体交换。扫描LASER曝光和房间的灯是足够的光形态，，诱导子叶扩张和叶绿体成熟，但在相邻的一对，由于低CO 2浓度，气孔有时可能会发展。这种倾向可以减少通过仅使用一个薄的介质层和最小的安装水，在该协议中的指示。
荧光基团的选择是使用这种技术的成功也很重要。 GFP和RFP的工作，并允许双标以可视化的细胞外周或评估蛋白质共定位。自定义过滤器，大大降低了自体荧光和允许甚至当叶绿素荧光蛋白标记的灵敏的检测。然而，即使过滤CFP自体荧光萌发的子叶是强大到足以排除几乎所有的信号使用LSM700的可见性。用混合像元分解能力的仪器，更广泛的选择荧光基团可能是可行的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们协助开发时间的推移协议和熊黛林Pillitteri建设的POLAR :: POLAR-EGFP感谢Rychel阿曼达。我们也感谢ABRC提供PM-RB建设的。这个协议是一个支持PRESTO奖来自日本的科学技术和代理的发展。极地研究还得到了大学，华盛顿版权研究基金（RRF，4098）和美国国家科学基金会（MCB-0855659）。 KMP是一个NSF研究所研究员（DGE-0718124），吉是HHMI的GBMF的研究者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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