Summary
Se describe un protocolo utilizando portaobjetos de cámara y los medios para inmovilizar los cotiledones de la planta para la formación de imágenes confocal de la epidermis durante varios días de desarrollo, la documentación de diferenciación estomática. Proteínas marcadas con fluoróforo se puede seguir dinámicamente por la expresión y localización subcelular, mejorar la comprensión de sus posibles funciones durante la división celular y la diferenciación de células de tipo.
Abstract
Formación de imágenes in vivo de la dinámica en el comportamiento celular a lo largo de una secuencia de desarrollo puede ser una técnica potente para comprender la mecánica de los patrones de tejido. Durante el desarrollo del animal, la proliferación celular y los acontecimientos clave de patrones ocurrir muy rápidamente. Por ejemplo, en Caenorhabditis elegans todas las divisiones celulares requeridos para el cuerpo de la larva se completan dentro de seis horas después de la fertilización, con siete ciclos mitóticos 1; las mitosis dieciséis o más de la embriogénesis de Drosophila se producen en menos de 24 horas 2. En contraste, las divisiones celulares durante el desarrollo de la planta son lentos, típicamente del orden de un día 3,4,5. Esto impone un desafío único y una necesidad a largo plazo de imágenes en directo para documentar los comportamientos dinámicos de la división celular y la diferenciación de los eventos durante la organogénesis vegetal. Epidermis Arabidopsis es un excelente sistema modelo para la señalización de la investigación que el destino celular y el desarrollo de las plantas. En el cotiledón, este tejido se compone de aire y resistentes al agua del pavimento células intercaladas con estomas uniformemente distribuida, válvulas que se abren y cierran para controlar el intercambio de gases y la pérdida de agua. El espaciamiento apropiado de estos estomas es crítica para su función, y su desarrollo sigue una secuencia de división asimétrica y pasos de diferenciación celular para producir la epidermis organizada (Fig. 1).
Este protocolo permite la observación de células y proteínas en la epidermis durante varios días de desarrollo. Este período de tiempo permite una documentación precisa de divisiones de células madre y la diferenciación de las células epidérmicas, incluyendo estomas y células epidérmicas pavimento. Las proteínas fluorescentes se pueden fusionar a proteínas de interés para evaluar su dinámica durante la división celular y los procesos de diferenciación. Esta técnica permite comprender la localización de una nueva proteína, POLAR 6, durante la etapa de proliferación de células de linaje-estomática en thArabidopsis e cotiledón epidermis, donde se expresa en las células anteriores eventos asimétricos de división y se desplaza a una zona característica de la célula de la corteza se produce poco antes de la división. Las imágenes pueden ser registrados y vídeo racionalizado producir fácilmente usando software de dominio público para visualizar la localización de proteínas dinámico y tipos de células a medida que cambian con el tiempo.
Protocol
1. Esterilización de semillas
- Preparar la solución de esterilización de semillas: 33% lejía doméstica, 0,1% Triton X-100.
- Coloque las semillas que llevan construcción deseada indicador fluorescente (s) y el genotipo (s) en el tubo de 1,7 ml y aplicar 1 ml de solución de esterilización. Incubar en Nutator durante 15 min.
- En una campana estéril, utilizar una pipeta para retirar la solución de esterilización de tubo, dejando detrás de semillas. Enjuague con 1 ml de agua estéril. Repetir cuatro veces.
- Incubar a 4 º C durante dos días o más.
2. Preparación de diapositivas Sala de prensa
- Mezclar 20 ml de solución al 0,5% de Bacto Agar (no puro agarosa) en agua en un matraz de 200 ml, y microondas hasta que se disuelve. Tenga cuidado al hervir la solución.
- Enfriar la solución a alrededor de 60 ° C.
- Recoger 1 ml de solución de agar con una pipeta y lentamente se aplican a la cubierta de vidrio en el interior de la cámara de diapositivas (Lab-Tek II compartimentado # 1,5 Sistema cubreobjetos alemán). Solución which está demasiado caliente o demasiado rápido puede aplicar pegamento o fundir vidrio crack.
- Inmediatamente añadir un segundo ml de solución de agar. Medios de agar ahora debe cubrir completamente la parte inferior de la cámara de diapositivas. Este medio mínimo es suficiente para apoyar el desarrollo de un cotiledón planta, que contiene nutrientes almacenados, durante cuatro a cinco días por el mantenimiento de la humedad y permitiendo la difusión de gas.
- Dejar enfriar en la diapositiva de sobremesa con cámara cubierta. Si matraz se cubre herméticamente, la solución puede ser guardado y se recalienta para su uso futuro.
3. Disección de Semillas
- Retire el tubo de semillas estériles de 4 ° C en almacenamiento.
- Colocar un tejido de papel en la etapa de un microscopio de disección y humedecer con agua. Ajuste tejido para crear una superficie lisa. El tejido se utiliza para estabilizar las semillas para su disección.
- Pipetear 20-30 semillas del tubo para el tejido, teniendo cuidado de colocarlos en el microscopio de disección campo de vista.
- Con unas pinzas cortantes (Roboz, # 5 punta biología), Retire con cuidado la cubierta de la semilla de la planta de semillero en el interior. Tegumentos tanto exterior e interior debe ser eliminado.
- Cuando la imagen del cotiledón, es beneficioso para eliminar el hipocotilo y la radícula. Los cotiledones contienen nutrientes suficientes para desarrollar durante varios días bajo este protocolo. Si está intacta, el hipocotilo se enderezará y alargar de manera espectacular, moviendo el cotiledón fuera del campo de lapso de tiempo de vista. Utilice un bisturí para cortar los cotiledones libres del hipocotilo.
- Mantenga cotiledones disecados sumergidas en agua, en un microtubo o similar.
- Repita 3.4-3.6 hasta que el número deseado de cotiledones se alcanza. 15-20 disecciones exitosas se recomienda antes del montaje.
4. Los cotiledones de montaje en la Cámara Slide
- Con un pequeño (18 mm 2) hoja de la cubierta, corte a través de los medios de agar y levantar toda la capa de base de cristal hasta la diapositiva cámara.
- Pipetear diseccionaron los cotiledones con un mínimo de agua de la explotación agrícolatubo en el portaobjetos de cámara, bajo la capa de agar levantada.
- Baje suavemente el agar en los cotiledones. Si el exceso de agua está presente, empapar lejos con un pañuelo de papel, con cuidado de no molestar a los cotiledones. Las muestras deben dejar de moverse con facilidad cuando monte es completa.
- Coloque la tapa de la diapositiva y diapositiva cámara de movimiento para platina del microscopio.
5. Time lapse de imágenes
- Configurar microscopio confocal invertido a la imagen de la fluoróforo deseado (s). LSM700 parámetros utilizados para: GFP, excitación a 488 nm y recogida con un filtro pasa banda a 440-530 nm; para RFP, excitación a 555 nm y recogida con un filtro pasa banda a 570-610 nm.
- Inspeccione muestras montadas por daños. Programar las posiciones de intacta, correctamente montado en el software de cotiledones microscopio. En el Zen 2009: Enfoque en un cotiledón de 20x objetivo y mover objetivo hasta el centro de la diapositiva de cámara. En Modo de Adquisición, cambiar el zoom a 0,5 y bastidor </ Em> a 48x48 píxeles. Seleccione la casilla Posiciones e imagen Scan vista general ... botón debajo de posiciones, a continuación, aumentar el número de azulejos horizontales y verticales de 30-35. Cuando exploración haya terminado, haga clic en el botón Posiciones en la pestaña Dimensiones y mira lugar en cada cotiledón de observar.
- Configure serie z que abarca la epidermis cotiledón de todos Zen samples.In 2009: Haga clic en la casilla Z-Stack. Seleccione cada posición en la Lista de posición y haga clic en el botón Mover a. Centrarse en el plano superior de la epidermis cotiledón y haga clic en el botón Set Primero bajo Z-Stack. Enfoque a la posición más baja en la que útilmente epidermis es visible y haga clic en el botón Set Final. Haga clic en el botón al lado de Optimal, que muestra mejor el z-rebanada de espesor, para ajustar. Comprobar cada cotiledón para confirmar que estos ajustes abarcar todas las muestras, los parámetros z no se puede ajustar para Indivposiciones iDual en Zen 2009.
- Crear serie temporal con una resolución deseada y la longitud. Intervalos de 15-30 min durante tres días son eficaces para la dinámica de proteínas en la división celular epidérmica. Este intervalo se puede cambiar según sea necesario. En el Zen 2009: Haga clic en la casilla de series temporales. En series de tiempo, establezca Ciclos para el número de imágenes que desee utilizando el control deslizante o escribiendo en el campo de texto. Configurar el Intervalo a 30 y utilice el menú desplegable para seleccionar min.
- Comience xyzt multi-posición de exploración. Tenga en cuenta que el número de posiciones debe ser limitada por las especificaciones de exploración; si el tiempo total de exploración es mayor que el intervalo deseado, los puntos de tiempo no será correcta. Un máximo de seis posiciones simultáneas son posibles cuando la imagen buenas prácticas agrarias y RFP en 59 z rodajas en un intervalo de 30 minutos usando nuestro sistema. En el Zen 2009: Cambio del tamaño del marco de la resolución que desee y haga clic en Start Experiment.
6. Edición de vídeo
- Desde el archivo de datos confocal, haga una intensidad máxima z-proyección de cada combinación de tiempo / posición y exportación como archivos de imagen en un formato sin pérdidas como TIFF. Los nombres de archivos deben estar en una serie por posición (por ejemplo, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc, no POLAR-GFP_0001_pos1) para el software para combinarlos en una película. En el Zen 2009: Copia Uso: Subconjunto en la pestaña Procesamiento de dividir posiciones en archivos separados, entonces la proyección de intensidad máxima. Por último, exportar como archivos TIFF (Archivo: Exportación, ventana completa resolución de imagen - series).
- Utilice FIJI 7,8 para alinear imágenes sucesivas mediante la ejecución de la macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Registro: bUnwarpJ). Cambiar el modo de registro a Mono. Todas las opciones avanzadas puede usar valores por defecto. Para largas secuencias de lapso de tiempo, descargar e instalar la macro "Affine + Consistente registro elástico imagen 2D", que se aplicará bUnwarpJ a una serie de imágenes de forma automática, y abierto ynuestros datos con File: Import: Secuencia de imágenes para usarlo. Desmarque MOPS extracción hitos y correr.
- Utilice FIJI / ImageJ o Quicktime Pro para abrir la secuencia de imágenes alineadas y guardar en el formato de vídeo deseado (AVI es una buena opción).
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Representative Results
Un conjunto de puntos de tiempo informativos obtenidos con este método se muestra en la Figura 3. Las membranas celulares están etiquetados con RFP (pm-rb) y GFP se fusiona a la proteína polar bajo su promotor nativo (POLAR :: POLAR-GFP) 6 En la escala de tiempo de 30-min, vemos divisiones celulares junto con los cambios en la localización de proteínas precede. Divisiones celulares asimétricas en forma linaje estomas con células madre como precursores de los estomas llamados meristemoids, que conservan la capacidad de sufrir más divisiones asimétricas, y sus células hermanas, llamados estomas células de linaje de tierra (SLGCs). SLGCs no asuma un destino precursor estomática, que con frecuencia transdiferenciarse en células pavimento, pero puede capacidad de reanudar la división asimétrica para producir otra meristemoide separada de la primera como de la hoja se expande. Todos estos destinos se refleja en la expresión y localización de POLAR :: POLAR-GFP (Fig. 3, Video 1).
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Figura 1. Esquema de desarrollo de estomas. Células Protodermal entrar en el linaje de los estomas como las células madre meristemoide (MMC) en un paso controlado por los factores de transcripción básicos hélice-loop-hélice palabras (SPCH), Scream (SCRM), y SCRM2. MMCs dividen asimétricamente para producir un meristemoide (M) y la célula estomática suelo linaje (SLGC); este paso puede ocurrir varias veces y proporciona un mecanismo por el cual los estomas están separados entre sí. La transición de células de estado de la meristemoide a la célula madre guardia (GMC) identidad se dirige específicamente por la bHLH MUTE así como SCRM / 2. Una última división simétrica de la GMC y su diferenciación en dos células oclusivas maduros (GC) requiere la Fama bHLH con SCRM / 2 10.ig1large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.
Figura 2. Diagrama de la disección de semillas y procedimiento de montaje. Las semillas se esterilizan y se mantuvo a 4 ° C, las cubiertas de las semillas e hipocotilos eliminados, y los cotiledones montado debajo de los medios de agar en un portaobjetos de cámara para formación de imágenes en un microscopio confocal invertido.
Figura 3. Time-lapse de imágenes demuestra POLAR POLAR-:: GFP localización distal anterior a la división celular asimétrica. Serie A: POLAR-GFP aparece inicialmente distribuida uniformemente, a continuación, aproximadamente dos horas antes de la asimetríadivisiones tricas (puntas de flecha) POLAR-GFP segrega de distancia del sitio de la meristemoide incipiente. Serie B: Después de la primera división asimétrica (punta de flecha), POLAR-GFP desaparece tanto en las células, lo que implica una rápida transición para proteger células madre (GMC) del estado por el meristemoide. El GMC (asterisco) divide simétricamente y se diferencia para formar células de los estomas de guardia, mientras que la célula hermana recupera POLAR-GFP expresión, es de suponer que presagia una posterior división asimétrica.
Video 1. Aerodinámico, video registrada de POLAR :: POLAR-GFP localización durante la amplificación y el espaciamiento de una célula precursora estomas. Inicialmente, POLAR-GFP parece uniformemente en la célula; por 39 hr después de la germinación, polariza fuertemente, justo antes de una división (40.0h) colocar un meristemoide menor en el extremo opuesto de la célula. La celda más grande de la derecha también recupera la identidad linaje estomas, y en un 45 hr POLAR-GFP localización se mueve junto al precursor de estomas. La división en 47 h produce un nuevo meristemoide (derecha) orientada lejos del meristemoide existente (izquierda) de la primera. El resultado final es de dos estomas separados por una célula. (Las imágenes que faltan en el vídeo no se recogieron y no representan cambios significativos.) Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
Esta técnica de lapso de tiempo confocal permite estudios longitudinales de expresión de la proteína marcado fluorescentemente y su localización en células individuales de la epidermis cotiledón Arabidopsis, que en el caso de las proteínas de cambio dinámico polar y otra es fundamental para una comprensión adecuada de su función. Previamente, el tiempo de formación de imágenes sostenida lapso ha sido utilizado para examinar la infección fúngica raíz de Arabidopsis 11 y el crecimiento meristemo 5,12, pero la adición de la epidermis cotiledón expande la versatilidad de esta técnica y permite su uso para proteínas adicionales, particularmente ayudando el creciente campo de desarrollo de estomas .
El protocolo principal limitación es que se limita actualmente a los cotiledones, que contienen los nutrientes necesarios para el desarrollo temprano. Además, el desarrollo del cotiledón no es exactamente idéntica a la sufrida en aire debido a que el medio de gel restringe el intercambio de gas. Scanning laexposición servicios y las luces de las habitaciones son adecuadas para fotomorfogénesis, induciendo la expansión de los cotiledones y la maduración del cloroplasto, pero de vez en cuando los estomas se puede desarrollar en pares adyacentes debido a la baja emisión de CO 2 concentración. Esta tendencia se puede reducir mediante el uso de sólo una fina capa de medios de comunicación y un mínimo de agua de montaje como se indica en este protocolo.
Selección fluoróforo es también importante para el éxito de esta técnica. Tanto las buenas prácticas agrarias y RFP trabajo bien, y permitir doble etiquetado para visualizar la periferia de la célula o proteína evaluar co-localización. Los filtros personalizados reducir en gran medida la autofluorescencia y permitir la detección sensible de etiquetas de proteínas fluorescentes, incluso cuando la clorofila está presente. Sin embargo, incluso autofluorescencia filtró PPC en los cotiledones en germinación es lo suficientemente fuerte como para impedir la visibilidad de casi toda la señal utilizando el LSM700. Para los instrumentos con una capacidad de desmezcla espectral, una selección más amplia de fluoróforos puede ser factible.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Amanda Rychel de asistencia en el desarrollo del protocolo y el lapso de tiempo para la construcción de Pillitteri Lynn POLAR POLAR-eGFP ::. También damos las gracias a ABRC para proporcionar la pm-rb construir. Este protocolo fue desarrollado a través de un soporte de la concesión PRESTO desde Japón Ciencia y Tecnología de la Agencia. La investigación sobre POLAR también fue apoyado por la Universidad de Washington Libre Fondo de Investigación (RRF-4098) y la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP es un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), y KUT es un investigador del HHMI-GBMF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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