Summary
我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。
Abstract
発達シーケンス全体細胞挙動の in vivo動態のイメージングは組織パターン形成のメカニズムを理解するための強力なテクニックです。動物の発生時には、鍵の細胞増殖とパターニングのイベントは非常に迅速に行われます。例えば、幼虫の体の計画に必要な線虫（Caenorhabditis elegans）のすべての細胞分裂が7分裂サイクル1で、受精後6時間以内に完了され、 ショウジョウバエの胚発生の16以上の有糸分裂は、24時間2未満で発生します。これとは対照的に、植物の開発時に細胞分裂は、通常、3,4,5日のオーダーで、遅いです。これはユニークな挑戦と植物器官形成時の細胞分裂と分化のイベントの動的挙動を文書化するための長期的ライブイメージングの必要性を課している。 シロイヌナズナ表皮が植物にシグナリング、細胞の運命、そして開発を調査するための優れたモデル系である。子葉では、この組織は、空気と均等に分散気孔が点在して耐水性舗装細胞、開いたり閉じたり、ガス交換と水の損失を制御することをバルブで構成されています。これらの気孔の適切な間隔は、それらの機能に重要であり、その開発は、非対称分裂と組織表皮（ 図1）を生成する細胞分化段階の順序に従います。
このプロトコルは、開発の数日間にわたって表皮内の細胞やタンパク質の観察を可能にします。この時間枠は、幹細胞の分裂と気孔と表皮舗装細胞を含む表皮細胞の分化の正確なドキュメンテーションを可能にします。蛍光タンパク質は細胞分裂と分化の過程で、そのダイナミクスを評価するために、目的のタンパク質に融合させることができる。この手法は、番目の気孔系統細胞の増殖段階で、私たちは新規タンパク質、POLAR 6の局在を理解することができますそれが細胞内で発現されている電子シロイヌナズナ子葉表皮は、除算が発生する直前に細胞表層の特性領域に非対称分裂のイベントや動きを先行。画像が登録され、合理化されたビデオは簡単に彼らが時間の経過とともに変化するような動的なタンパク質の局在および細胞型を可視化するために、パブリックドメインソフトウェアを用いて製造することができる。
Protocol
1。種子消毒
- 33％の家庭用漂白剤、0.1％トリトンX-100：種子消毒液を準備します。
- 所望の蛍光レポーターコンストラクト（s）と遺伝子型（S）1.7 mlチューブ、滅菌溶液1mlを適用を運ぶ場所の種。 15分間nutatorでインキュベートする。
- 無菌フードでは、背後にある種子を残して、チューブから消毒液を除去するためにピペッターを使用しています。 1ミリリットル滅菌水ですすいでください。 4回繰り返します。
- 2日間以上、4℃でインキュベートする。
2。商工会議所スライドメディアの準備
- 溶解するまでバクト200mlのフラスコ内の水に寒天（アガロース純粋ではない）、およびマイクロ波の0.5％溶液の20ミリリットルを混ぜる。ソリューションを煮沸するときは注意してください。
- 約60℃に冷却ソリューションを
- ピペッターを用いた寒天溶液1mlを採取し、徐々にチャンバースライド内部のカバーガラス（ラボ·テックIIチェン＃1.5ドイツのカバーガラスシステム）に適用されます。ソリューションワットHICHは、接着剤や割れたガラスを溶かすことがあまりにも早すぎるホットまたは適用される。
- すぐに寒天溶液の第二mlを加える。寒天培地は完全にスライドチャンバーの底をカバーする必要があります。この最小限のメディアでは、水分を維持し、ガス拡散を可能にすることにより、四から五日間貯蔵養分が含まれている植物の子葉、、で開発をサポートするために十分です。
- チャンバーと実験台上でクールなスライドが覆われている。フラスコをしっかりとカバーされている場合、解決策は、将来の使用のために保存され、再加熱してもよい。
3。種子の解剖
- 4°C貯蔵種子から無菌のチューブを取り外します。
- 解剖顕微鏡のステージ上にティッシュペーパーを置き、水で湿らせます。滑らかな表面を作成するために組織を調整します。組織を切開するための種を安定させるために使用されています。
- ピペットでチューブから組織への20から30種を、ビューの解剖スコープのフィールドにそれらを配置するように注意してください。
- 鋭い鉗子（Roboz、＃5生物学の先端）を使用して、慎重に苗内側から種皮を除去します。外側と内側の両方の外皮を除去しなければならない。
- 撮像する際子葉、それは胚軸と幼根を除去するために有益である。子葉は、このプロトコルの下で数日間のために開発するのに十分な栄養素が含まれています。無傷の場合、胚軸は、ビューの時間経過のフィールドの子葉を外に移動し、劇的にまっすぐに長くなります。胚軸の自由子葉をスライスするためにメスを使用してください。
- マイクロチューブまたは同様に、水に浸漬解剖子葉を開催しています。
- 子葉の希望数に達するまで3.4から3.6を繰り返します。 15から20まで成功解剖をマウントする前に、推奨されています。
4。チャンバースライドで取り付け子葉
- 小さ い（18 mm 2）のカバースリップ、寒天培地をカットとチャンバースライドのガラス基盤からレイヤー全体を持ち上げるを使用。
- 持ち株からの水の最低ピペット解剖子葉持ち上げた寒天層下チャンバースライドにチューブ。
- 優しく子葉上に寒天を下げる。余分な水が存在する場合は、子葉を乱さないように注意しながら、組織とそれを取り除く。マウントが完了すると、標本はもはや簡単に移動するべきではありません。
- チャンバースライドにカバーを置き、顕微鏡のステージにスライドを移動します。
5。タイムラプスイメージング
- 画像希望のフルオロフォア（s）に倒立共焦点顕微鏡をセットアップします。使用LSM700パラメータ：GFP、440から530 nmのバンドパスフィルターと488nmおよびコレクションでの励起のために、RFP、570から610 nmのバンドパスフィルターと555 nmおよびコレクションでの励起のために。
- マウントされた損傷のために検体を検査します。顕微鏡ソフトにプログラムそのまま、正しくマウント子葉の場所を。禅、2009年：20倍対物レンズとチャンバースライドの中心に客観的な動きに子葉に焦点を当てる。 アクイジションモード下では、0.5にズームを変更し、 フレームサイズ</ 48x48ピクセルにem>です。 体位体位下のチェックボックスをオンにして、 スキャンの概要のイメージ[...]ボタンを選択し、30から35に水平方向および垂直方向のタイル数を増やします。スキャンが完了すると、観察する各子葉で[ディメンション]タブと場所の十字線の下に位置]ボタンをクリックします。
- すべてsamples.In禅2009の子葉の表皮を網羅Zシリーズを設定しますzスタックチェックボックスをクリックします。 ポジション·リストの下の各位置を選択し、ボタンに移動]をクリックします 。子葉の表皮の最上層の面に焦点を当てると、Zスタックの下の最初に設定 ]ボタンをクリックします。表皮が有用に表示されている最も低い位置にピントを合わせて設定された最後のボタンをクリックします。設定するには、最善のzスライス厚を示して、 最適の横にあるボタンをクリックしてください。これらの設定は、すべてのサンプルを包含することを確認するために各子葉をチェックし、zパラメータは個人ラージヒルに設定することはできません禅2009年idual位置。
- 目的の解像度と長さの時系列を設定します。 3日間15〜30分の間隔は、表皮細胞分裂におけるタンパク質ダイナミクスのに有効である。この間隔は、必要に応じて変更することができます。禅2009年： 時系列チェックボックスをクリックします。 時系列の下では、テキストフィールドにスライダーやタイピングを用いて所望の画像の数のためにサイクルを設定します 。 30 の間隔を設定すると min を選択するプルダウンメニューを使用しています。
- xyzt多位置のスキャンを開始します。位置の数は、スキャンの仕様によって制限されなければならないことに注意してください。合計スキャン時間は、所望の間隔よりも大きい場合には、時点が正確でなくなります。 6同時位置の最大値は59で撮像する際GFPおよびRFP可能です我々のシステムを用いて30分間隔でzスライス。希望する解像度に変更フレームサイズと実験の開始]をクリックします ：2009年の禅。
6。ビデオの編集
- 共焦点データファイルから、最大強度、TIFFなどロスレス形式の画像ファイルとして各時間/位置の組み合わせと輸出のz投影する。ファイル名は、映画にそれらを結合するためのソフトウェアのための位置ごとに1シリーズ（ 例えば 、極性GFP_0001_pos1など、POLAR-GFP_pos1_0001、POLAR-GFP_pos1_0002ない）でなければなりません。禅2009年：その後、別々のファイル、 最大値投影にポジションを分割する処理]タブの下のサブセット：コピーを使用します。最後に、TIFF（： -シリーズエクスポート、フル解像度の画像ウィンドウファイル ）としてエクスポートします。
- bUnwarpJマクロ9（：登録：bUnwarpJプラグイン ） を実行して、連続した画像を配置するフィジー7,8を使用しています。 Monoに登録モードを変更します。すべての詳細オプションは、デフォルト値を使用することができます。長い時間の経過シーケンスの場合、自動的に一連の画像にbUnwarpJを適用するマクロ "アフィン+一貫弾性2Dイメージのレジストレーション"、およびオープンyをダウンロードしてインストールするそれを使用するイメージシーケンス：インポート：我々のデータは、 ファイルを使用しています 。 MOPSのランドマーク抽出と実行のチェックをはずします。
- 整列した一連の画像を開いて、目的のビデオ形式（AVIは良い選択です）で保存するフィジー/ ImageJのまたはQuickTime Proを使用しています。
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Representative Results
このメソッドを使用して収集された有益な時間ポイントのセットは、 図3に示します。 30分の時間スケールでの細胞膜はRFP（PM-RB）で標識され、GFPは、その天然のプロモーター下POLARタンパク質に融合されている（POLAR :: POLAR-GFP）6、我々は、タンパク質の局在の変化とともに細胞分裂を参照してください。を前に付けます。気孔の系譜フォーム幹細胞様さらに非対称分裂を受ける能力を保持meristemoids、およびその姉妹細胞、気孔と呼ばれる系統の接地細胞（SLGCs）と呼ばれる気孔の前駆体の非対称分裂。 SLGCsは気孔の前駆体の運命を負うものではありません、彼らは頻繁に舗装細胞への分化転換が、葉が広がるように、最初から離間別メリステモイドを生成するために非対称分裂機能を再開することができる。これらの運命のすべてがPOLARの発現と局在:: POLAR-GFP（ 図3、ビデオ1）に反映されます。
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図1：気孔発生の模式図。 Protodermal細胞はSCREAM（SCRM）、（SPCH）SPEECHLESS塩基性ヘリックス - ループ - ヘリックス転写因子によって制御ステップでメリステモイド母細胞（MMC）のように気孔の系譜を入力し、SCRM2。 MMCはメリステモイド（M）と気孔系統の地上セル（SLGC）を生成するために非対称的に分裂し、このステップでは、複数回発生すると離隔されている気孔によって1つのメカニズムを提供するかもしれません。孔辺母細胞（GMC）のアイデンティティにメリステモイドの細胞状態遷移はbHLH型ミュート同様に、SCRM / 2で具体的に指示される。 2成熟したガード細胞（GC）にGMCとその分化の最終対称分裂は、SCRM / 2 10とのbHLH型ファマを必要とします。ig1large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図2シードの郭清と取付手順の図。種子は4で滅菌し、保持されている°Cは、種皮と胚軸を除去し、子葉は倒立共焦点顕微鏡でイメージング用のチャンバースライドに寒天培地の下にマウント。
図3タイムラプスイメージングが示しPOLAR ::非対称細胞分裂に先立つPOLAR-GFP遠局在。シリーズ：asymme前POLAR-GFPは最初に均等に分散表示され、その後約2時間POLAR-GFPの偏析離れる初期メリステモイドのサイトからTRIC部門（矢頭）。シリーズB：初期非対称分裂（矢じり）に続いて、POLAR-GFPはメリステモイドによって母細胞（GMC）の状態を保護するために急速な変化を暗示し、両方のセルに表示されなくなります。姉妹細胞がおそらく後で非対称分裂をpresaging、POLAR-GFP発現を取り戻しつつGMC（アスタリスク）は、対称的に分割して、気孔孔辺細胞を形成するために区別しています。
ビデオ1。1気孔の前駆細胞の増幅と間隔の間POLAR :: POLAR-GFPの局在化の合理化、登録されたビデオ。当初、POLAR-GFPは細胞内に均一に表示され、39時間で発芽した後、それだけで除算（40.0h）は細胞の反対側の端に小さなメリステモイドを置く前に、強く偏光する。右の大きなセルはまた気孔系統のアイデンティティを取り戻し、そして45でHR POLAR-GFPの局在は、気孔の前駆体に隣接して移動。 47時間で割り算は最初から既存のメリステモイド（左）から離れて指向の新しいメリステモイド（右）を生成します。最終結果は、1セルで区切られた二つの気孔です。 （ビデオから欠落している画像は、収集されていないと大きな変化を表しているわけではありません。） ムービーを見るにはここをクリック 。
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Discussion
このタイムラプス共焦点技術は極性および他の動的に変化するタンパク質の場合には、それらの機能を適切に理解するために重要であるシロイヌナズナの子葉の表皮の個々の細胞の蛍光標識タンパク質の発現と局在の縦断的研究を可能にします。以前は、持続時間タイムラプスイメージングはシロイヌナズナの根真菌感染症11、分裂組織の成長5,12を調べるために使用しますが、子葉の表皮を追加すると、この技術の汎用性を拡大し、付加的なタンパク質のためのその使用を可能にし、特に気孔発生の拡大分野を支援しています。
プロトコルの主な制限は、それが現在、彼らは開発の初期段階に必要な栄養素が含まれて子葉に制限されることである。また、子葉の開発はゲル媒体はガス交換が制限されるため、空気中で受けたものと正確に同じではありません。スキャンラSER曝露と部屋の照明は、子葉展開と葉緑体の成熟を 誘導する、光形態形成に適しているが、気孔は時折、低CO 2濃度による隣接ペアで開発することがあります。この傾向は、このプロトコルで指示されたとおり、メディアと最小限の取り付け水の薄層だけを使用することで軽減することができます。
蛍光色素の選択は、この手法での成功のためにも重要です。 GFPおよびRFPの両方がうまく機能し、ダブル細胞周囲を視覚化したり、タンパク質の共局在を評価するためにラベリングできます。カスタムフィルタは大幅自己蛍光を低減し、葉緑素が存在する場合でも蛍光タンパク質タグの高感度な検出を可能にします。しかし、発芽子葉でさえフィルタリングCFPの自家蛍光LSM700を使用して、ほぼすべての信号の視認性を排除するのに十分な強さ。スペクトルアンミキシング機能を備えた機器の場合、蛍光団のより広い選択が可能であるかもしれません。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、POLAR :: POLAR-EGFP構築するための時間経過プロトコルとリンPillitteriの開発を支援するためのアマンダRychelに感謝します。また、PM-rbが構築提供するためABRCに感謝しています。このプロトコルは、日本科学技術振興機構からさきがけ賞の支援により開発されました。 POLARの研究はまた、ワシントンロイヤリティ研究基金（RRF-4098）、国立科学財団（MCB-0855659）の大学によってサポートされていました。 KMPは、NSF大学院リサーチフェロー（DGE-0718124）であり、本学では、ハワードヒューズ-GBMFの研究者でもある。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
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