Langsiktig, høy oppløsning Confocal Time Lapse Imaging av<em> Arabidopsis cotyledon</em> Epidermis under spiring
Summary
Vi beskriver en protokoll med kammer lysbilder og media for å immobilisere plante cotyledons for confocal avbildning av epidermis over flere dager med utvikling, dokumentere stomatal differensiering. Fluoroforen-merket proteiner kan spores dynamisk ved uttrykk og subcellulære lokalisering, øke forståelsen av de mulige roller under celledeling og celle-type differensiering.
Abstract
Imaging in vivo dynamikken i mobilnettet atferd gjennom en utviklingsmessig sekvens kan være en kraftig teknikk for å forstå mekanikken i vev mønster. Under dyr utvikling, tast celleproliferasjon og mønster hendelser skje svært raskt. For eksempel, i Caenorhabditis elegans alle celledelinger kreves for larve kroppen blir realisert innen seks timer etter befruktning, med syv mitotiske sykluser 1; de seksten eller flere mitoses av Drosophila embryogenese forekommer i mindre enn 24 timer 2. I kontrast, celledelinger under planteutvikling er langsom, typisk i størrelsesorden av en dag 3,4,5. Dette medfører en unik utfordring og et behov for langsiktige live bildebehandling for å dokumentere dynamiske atferd av celledeling og differensiering hendelser under anlegget organogenesen. Arabidopsis epidermis er en utmerket modell system for å undersøke signalering, celle skjebne og utvikling i planter. I cotyledon består dette vevet av luft-og vanntette fortau celler ispedd jevnt fordelt stomata, ventiler som åpnes og lukkes for å kontrollere gassutveksling og vanntap. Riktig avstand mellom disse stomata er kritisk for sin funksjon, og deres utvikling følger en sekvens av asymmetrisk divisjon og celledifferensiering trinnene å produsere den organiserte epidermis (fig. 1).
Denne protokollen tillater observasjon av celler og proteiner i epidermis over flere dager av utvikling. Denne tidsrammen gir nøyaktig dokumentasjon av stilk-celledelinger og differensiering av epidermal cellene, inkludert stomata og epidermal fortau celler. Fluoriserende proteiner kan være smeltet til proteiner av interesse å vurdere sine dynamikken under celledeling og differensiering prosesser. Denne teknikken tillater oss å forstå lokalisering av et nytt protein, 6 POLAR, under spredning stadium av stomatal-avstamning celler i the Arabidopsis cotyledon epidermis, hvor den er uttrykt i celler foranstående asymmetriske divisjon hendelser og beveger seg til et karakteristisk område av cellen cortex like før divisjonen oppstår. Bilder kan bli registrert og strømlinjeformet video enkelt produsert med public domain programvare for å visualisere dynamisk protein lokalisering og celletyper som de endrer seg over tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette time-lapse confocal teknikken gir longitudinelle studier av fluorescently merket protein uttrykk og lokalisering i enkelte celler i Arabidopsis cotyledon epidermis, som i tilfelle av POLAR og andre dynamisk skiftende proteiner er avgjørende for en riktig forståelse av sin funksjon. Tidligere har vedvarende tidsforløp bildebehandling blitt brukt til å undersøke Arabidopsis root soppinfeksjon 11 og meristem vekst 5,12, men legger til cotyledon epidermis utvider allsidighe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Amanda Rychel for å få hjelp i utviklingen av tidsforløp protokollen og Lynn Pillitteri for å konstruere POLAR :: POLAR-eGFP. Vi er også takknemlige for ABRC for å gi pm-rb konstruere. Denne protokollen ble utviklet gjennom et støtte fra PRESTO prisen fra Japan Science Technology and Agency. Forskning på POLAR ble også støttet av Universitetet i Washington Royalty forskningsfond (RRF-4098) og National Science Foundation (MCB-0855659). KMP er en NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), og KUT er en HHMI-GBMF etterforsker.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| One-chamber slide | Nunc (Thermo Scientific) | 155360 | Or two-chamber (155379) |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Zen 2009 software |
| 20x objective lens | Zeiss | 420650-9901 | NA 0.8, Plan-APOCHROMAT |
| Dissecting microscope | Benz (National) | 431TBL | Illuminates from below |
| #5 forceps, biology tip | Roboz Surgical Instrument | RS-4978 | Very fine tips are critical |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64 (1983).
- Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development. Current Biology. 5, 1449 (1995).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. . Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).
- Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).
- Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).
- Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development. Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).
- Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).
- Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem. Plant Journal. 48, 619 (2006).
