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Neuroscience

의 장기 강한 적응의 분자 판독 doi: 10.3791/4443 Published: December 22, 2012

Summary

여기에 장기 후각 적응의 분자 기록을 설명

Abstract

지속적인 자극하는 동안 대부분의 감각 뉴런은 신호의 감도를 감소하여 반응을 적응합니다. 적응 반응은 모양의주의를 할 수 있으며, 오버 자극 세포를 보호합니다. C.의 후각 회로에 적응 elegans 먼저 콜버트와 Bargmann 1,2에 의해 설명되었다. 여기에서 저자들은 Amphid 윙 셀 타입 C (AWC) 감각 뉴런에 의해 감지 휘발성 냄새에 적응하는 능력에 돌연변이가 결함 분리하는 유전자 화면을 설계하는 데 사용되는 후각 적응 패러다임의 매개 변수를 정의. 때 wildtype C. elegans 동물들은 냄새로 자신의 응답을 수정합니다 30 분에 매력적인 AWC - 감지 냄새 셋에 노출 된 후 ~ 1 시간의 chemotaxis 행동 분석에 적응 냄새를 무시합니다. 때 wildtype C. elegans 동물들은 후 AC에 적응 냄새를 무시합니다 ~ 1 시간을위한 매력적인 AWC - 감지 냄새에 노출되어~ 3 시간에 hemotaxis 행동 분석. C.의 후각 적응의 두 단계 elegans는 단기 후각 적응 (30 분 냄새에 노출 후 유도), 그리고 장기 후각 적응 (60 분 냄새에 노출 후 유도)로 설명했다. 나중에 L' Etoile의 외.에서 일, 4 AWC 뉴런의 단기 및 장기 후각 적응 모두 필요합니다 EGL-4라는 단백질 키나제 G (PKG)을 발견. EGL-4 단백질은 장기 후각 적응 반응하지만 AWC 4 단기 후각 적응 응답을위한 소모품에 필요한 핵 현지화 과정이 포함되어 있습니다. 녹색 형광 단백질과 태그 EGL-4함으로써, 장시간 냄새에 노출시 AWC의 EGL-4의 현지화를 시각화 할 수했습니다. 이 모든 기능을 사용하여 우리가 AWC 5 장기 후각 적응의 분자 표시 장치를 개발 할 수 있었던 EGL-4 (GFP :: EGL-4) 분자 GFP를 태그. 이 m을 사용하여후각 적응의 olecular 판독 우리는 AWC 6,7에서 GFP의 결함이 subcellular 지방화 패턴 :: EGL-4을 전시 돌연변이 동물을 식별하는 모두 순방향 및 역방향 유전 화면을 수행 할 수있었습니다. 여기 설명 : GFP 1) 건설 :: EGL-4 표현 동물, 2) 장기 냄새 유발 핵 translocation의 assays를위한 동물의 재배를위한 프로토콜 및 장기적인 악취 유발 3) 채점 핵 translocation 이벤트와 핵 GFP :: EGL-4 상태에서 복구 (재 sensitization).

Protocol

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1. GFP의 건설 EGL-4 표현 동물 태그

  1. odr-3 유전자 (직접 상류 시작 코돈의 사용 2,678 BP)를위한 발기인 아래 병진 융합 GFP :: EGL-4를 복제 (P) odr-3 :: GFP :: EGL-4. odr-3 프로모터 드라이브 amphid 뉴런 쌍 표현 : AWA, AWB, AWC, 그리고 약하게 ASH 인치
  2. (P) ofm-1 : 플라스미드 (P) odr-3 :: GFP :: 50 wildtype (N2) 동물에 EGL-4 표준 세균 라인 변환 기술 8을 사용 공동 분사 마커와 μl / NG를 삽입 : : GFP 9 일 (μl / 25 NG) 및 (P) odr-1 :: dsRed 10 (25 NG / μl). AWC 및 AWB amphid 뉴런 쌍의 odr-1 프로모터 드라이브 표현하고 coelomocytes의 ofm-1 프로모터 드라이브 표현.
  3. 울트라 바이올렛 (UV) / trimethylpsoralen (TMP) 통합 프로토콜 단계 1.2에 설명 된 extrachromosomal 배열을 표현 형질 전환 동물을 대상11.
  4. 블리치는 동물 12 동기화하고 OP50 E.를 포함하는 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 올려 배양 L4 단계에 대장균. OP50 E.를 제거하는 M9 버퍼로 NGM 플레이트에서 L4 동물을 씻어 대장균 박테리아.
  5. M9 버퍼를 제거하고 30 μg / 1.5 ML의 microcentrifuge 관 웜 펠렛로 ML의 TMP 작업 솔루션의 50-100 μl를 추가합니다. 주변 빛을 차단하고, 호일로 싼 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 15 분 동안 회전하는 것에 부드럽게 활발히 논의하기 위해 호일에 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 넣어. 큰 unseeded NGM 판에 TMP / 웜 솔루션에 웜을 전송합니다.
  6. Stratalinker 2400을 사용하여 UV 350 μJ (X100)에 NGM 접시에 웜을 쉽게받을 수 있습니다. 그런 다음 OP50 포함 NGM 플레이트에 웜을 추가로 5 시간 동안 짙은 어둠 속 품다.
  7. 약 10 시드 플레이트 (2-5 웜 각 판) 50 유전자 변형 웜을 선택합니다. 전송 P0 새로운 판에 3 일 동안은 24 시간입니다.
  8. 250 clonal F1을 선택nimals (판 당 1 동물). 각 F1 판 2-4 F2 동물을 복제. ofm-1 (P)에서 :: 해부 형광 현미경으로 GFP 표현 패턴을 보면 100 % 전송 라인을 찾아 F3 동물을 확인합니다.
  9. Outcross wildtype의 N2 동물과의 최종 통합 라인 (들) 5 회. 우리는 pyIs500으로 최종 통합 라인을 참조하고, GFP 등 GFP 태그 EGL-4 분자 :: EGL-4입니다.

2. 원자력 Translocation의 Assays을위한 재배와 동물의 유지 보수

  1. 25 pyIs500 동물을 육성 ° OP50 E. 스탠다드 10cm NGM 플레이트에 C (제조법은 아래를 참조) 시드 대장균 박테리아 13 일 (그림 1).
  2. 1 일에서 5 개의 10cm OP50 E.에 25 재배 플레이트 4-5 L4 pyIs500 동물 ° C를 선택 대장균은 25 접시 배양을 놓는 ° C (그 판 당 4-5 L4 동물입니다.)
  3. 4 일에서 성인 P를 씻어S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼를 사용하여 대형 NGM 플레이트에서 pyIs500 동물의 opulations (제조법은 아래를 참조). 그들은 플라스틱 피펫 팁의 측면에 집중하므로, 동물을 전송하는 일회용 유리 피펫을 사용합니다.

3. 장기 냄새 유발 원자력 Translocation의 Assays

  1. pyIs500 동물에게 세균을 제거 할 S-자연적으로 흐르는 것과 3 번 씻으십시오. 세차 사이에 동물을 원심 분리기하지 마십시오 아니라 동물 고정 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 다 박테리아가 제거되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다, 그 NGM의 pates는 잔여 박테리아가 부정적인 translocation 분석의 결과에 영향을 미칠 것이기 때문에, 오염에서 무료입니다. 또한, 우리는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 autoclaving하는 측면에 집중하기 위해 동물을 일으키는 등 비 autoclaved 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 사용하는 관의 내부 벽에 "끈적"재산을 생산하는 것으로 확인되었습니다.
  2. 동물이 세차 사이에 정착하고 있지만, t를 구성하는그는 적응 솔루션을. 100 ML의 졸업생 실린더에 S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼의 100 ML을 추가합니다. S-자연적으로 흐르는 것과에게 냄새를 적응 추가 Parafilm의 스트립을 사용하여 실린더를 밀봉. butanone 적응이 S-자연적으로 흐르는 것과 100 ML에 2 butaone 11 μl를 추가에 대한 benzaldehyde 적응은, S-자연적으로 흐르는 것과 100 ML에 benzaldehyde의 7.5 μl를 추가합니다. 수행하는 경우 부드럽게 (흔들하지 않음)이 포함 된 졸업 실린더가 S-자연적으로 흐르는 것과과 냄새 30 회 균일 한 에멀젼을 만드는 반전.
  3. S-자연적으로 흐르는 것과의 마지막 세척 후, 동물이 모든 액체를 해결하고 제거 할 수 있습니다. 라벨 한 튜브 "+ VE"또는 "적응"과 다른 튜브 "VE"또는 "unadapt". 그런 다음 적응 microcentrifuge 튜브 (+ VE)에 적응 믹스 1 ML을 추가하고 unadapted 제어 microcentrifuge 관 (-VE)에 S-자연적으로 흐르는 것과 1 ML를 추가합니다. 각 튜브에 100와 200 사이의 동물의 숫자를 유지하려고합니다. 연습으로, 그것은 눈으로 펠릿에 동물의 대략적인 수를 추정 할 수 있습니다.
  4. 1.5 ML microcentrifuge 튜브 캡 보호를 삽입각 튜브 (터지는 오픈에서 뚜껑을 방지)와 80 분의 회선 근에 튜브를 삽입합니다. 우리는 60 분 및 80 분 사이의 냄새에 노출 비슷한 결과를 (장기 적응 응답에서 두 결과) 산출 것으로 나타났습니다. 그러나, 80 분 노출 우리 손에 더 일관된 결과를 제공합니다. 따라서 우리의 모든 장기 적응 assays는 80 분 냄새에 노출 (그림 2)를 사용하여 표준화합니다.
  5. 80 분 후, S-자연적으로 흐르는 것과의 동물에게 3 번 씻는다. 동물이 각 빨래 사이에 중력에 의해 해결 할 수 있습니다.

4. 단기 냄새 유발 원자력 Translocation의 Assays

  1. 단기 냄새 적응의 경우, 그러나 대신 80 분에 냄새를 적응 pyIs500 동물 잠복기 때문에, 30 분 노출을 사용하여 당 장기 냄새 유발 translocation의 assays (단계 3.1-3.4)와 같은 프로토콜을 사용 . 아래에 설명 된 악취 유발 핵 translocation의 assays의 정량화은 (5 단계) 장기 및 단기 적이에 대해 동일합니다m 노출.

5. 냄새 유발 원자력 Translocation 이벤트 점수를

  1. DH 2 0에서 젤 전기 영동 아가로 오스를 용해하여 5 MM 나트륨 azide (할머니 3) 포함 2% 아가로 오스 패드를 확인합니다. 유리 현미경 슬라이드에 낸 세를 포함하는 용융 아가로 오스의 한 방울을 넣으십시오. 즉시 용융 아가로 오스의 드롭을 평평하게하는 최초의 슬라이드에 다른 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 30 초에두고 부드럽게 현미경은 ~ 1 mm의 평면 아가로 오스 패드와 하나 현미경 슬라이드를두고 슬라이드 떨어져 애타게.
  2. S-자연적으로 흐르는 것과의 마지막 세척 후, 웜은 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 정착하고 모든 액체를 제거 할 수 있습니다. 그런 다음 몇 가지 현미경 슬라이드의 아가로 오스 패드로 드롭 현명한 동물을 추가합니다. 이 50과 100 사이에 슬라이드 당 동물의 번호를 유지하는 것이 중요합니다. 슬라이드 당 너무 많은 동물이 골을 복잡하고 종종 푸른 빛이 여기 뒤에 산란 빛이 생성됩니다. 초과 액체가 수도김 부 작은을 사용하여 아가로 오스 패드에서 악한합니다. 패드에 0.5 mm의 유리 커버 슬립을 놓고 동물을 고정하는 할머니 3 수 있도록 2 분에 서 보자. 참고 동물 채점 후 슬라이드에서 복구 할 수 있습니다. M9 버퍼 한 방울로 시드 NGM 플레이트로 전송하면 동물 ~ 1 시간 후 할머니 3 마취에서 회복됩니다.
  3. 이 시점에서는 각 실험은 슬라이드 실험 (+ VE) 슬라이드하고있는 슬라이드 (-VE) 슬라이드 컨트롤입니다 추적 할 키를 고안하고, 맹목적으로 GFP를 점수를 다른 사람에게 슬라이드를 통과 필수적입니다 : EGL-4 현지화 패턴. 이 모든 실험 바이어스에 대해 적용됩니다.
  4. , 10X 40X 63X 배율과 목표 및 GFP / RFP 필터를 수직 형광 현미경을 사용하여 슬라이드 당 50과 100 동물 사이의 점수. 첫째, 밝은 분야 조명을 사용하는 10X 배율에 따라 동물을 찾습니다. 둘째, brigh를 해제하여 AWC 뉴런을 찾습니다t-필드 조명 및 RFP 필터를 사용합니다. AWB 및 AWC 뉴런의 (P) odr-1 :: dsRed 드라이브는 표현. 모양의 작고 원형 아르 AWB 셀 기관 (그림 2)와 비교 AWC 뉴런은 독특한 타원형 모양의 세포 기관을 갖추고 있습니다.
  5. AWC 전지 본체가 위치한되면, GFP 필터로 전환 GFP의 지역화 기록 : 핵이나 세포질로 EGL-4. 카운터를 사용하면 실험이 슬라이드를 골면서 접안 렌즈로 계속 찾고 있습니다. 참고 : 단계 5.1-5.5는 통계적으로 의미가있는 데이터 (그림 1-2) 생산 별도의 일에 최소 3 번 반복됩니다.

6. 장기 냄새 적응에서 복구하는 동안 EGL-4 GFP 태그 모니터링

  1. 단계 3.5 이후 시간 포인트 제로에서 AWC의 여러 aliquots과 핵 대 세포질 GFP에 대한 점수 :: EGL-4에 pyIs500 동물의 인구를 분할 (즉 80 분 노출 후) 및 multiple 이후의 시간 점 (그림 3).
  2. NGM 접시에 일회용 유리 피펫을 사용하여 컨트롤 (-VE) 및 실험 (+ VE) 동물을 모두 전송합니다.
  3. 동물이 시간의 다양한 길이에 복구 할 수 있도록 각 시점에서 GFP :: EGL-4in AWC의 재검토 현지화 5.1 5.5 단계에 있습니다.

7. 자료

NGM 번호판 :; 3g의 나트륨 염화물 (NaCl) 2.5 g Bacto-펩톤 21g Bacto-한천 : 1 L에 대해 1 L ddH 2 0에 추가 할 수 있습니다. 압력솥 미디어. 온도는 54 ° C.를 읽고 autoclaving, 멋진 한천이 끝날 때까지 , 1 ML 1 M의 황산 마그네슘 (MgSO 4), 1 ML 1 M의 염화칼슘 (CaCl 2), 에탄올 1 ML의 콜레스테롤 (5 MG / ML 주식) 25 ML 1M 칼륨 인산 버퍼 다음 솔루션을 추가합니다.

1 M 이염 기성 K 2 HPO 4 174.2 g / 몰 : 500 ML를 들어 : 400 ML ddH 2 O에 용해 87.1 g DibasiC K 2 HPO 4. ddH 2 O. 500 L에 볼륨 조절 500 ML 무균 필터 유닛을 사용하여 소독 필터링 할 수 있습니다.

1 M 일 염기의 KH 2 PO 4 136.1 g / 몰 : 1 L의 경우 : 800 ML ddH 2 O에서 136.1 g 일 염기의 KH 2 PO 4 분해. ddH 2 O. 1 개 L로 볼륨을 조정 500 ML 무균 필터 유닛을 사용하여 소독 필터링 할 수 있습니다.

1 M의 칼륨 인산 (K 3 PO 4) 버퍼 산도 6.0 : 1 L의 경우 : 1 L 무균 필터 유닛에서 1 M 일 염기의 KH 2 PO 4 868 ML를 추가합니다. 단위를 통해 필터링 할 수 있습니다 다음, 1 M 이염 기성 K 2 HPO 4 132 ML를 추가합니다. 장치가 모든 액체를 필터링 할 수 있습니다. 필터 장치를 제거하고 6.0 산도를 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.

S-자연적으로 흐르는 것과 : 1 L의 경우 : 50 ML 100 K 3 PO 4 버퍼를 추가 산도 ~ 6.0; 20 ML 5M NaCl AQ. 1 개 L에 기입ddH 2 O. 솔루션을 압력솥.

M9 : 3g KH 2 PO 4, 6g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 ML 1 M MgSO 4, H 2 O. : 1 L의 경우 ddH 2 0 1 개 L로 입력합니다. autoclaving하여 소독.

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Representative Results

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AWC 전, 연장 냄새에 노출 후 GFP :: EGL-4in의 지역화 패턴의 예는 그림 2에 표시됩니다. 장시간 악취 노출, GFP :: EGL-4 이전은 AWC (그림 2B)의 세포 기질에 지역화하고 있으며, 80 분 냄새 노출 GFP 후 :: EGL-4는 AWC (그림 2D)의 핵에 번역되어 있습니다. 행동 수준에서 cytosolic GFP :: EGL-4 AWC에있는 동물은 냄새의 포인트 소스 (- chemotaxis 지수 3 가까운 1 되오니, 이용에 참고하여 그림 2C는 unadapted 동물의 chemotaxis assays의 대표 결과를 그래프)에 매료됩니다. AWC에 핵 GFP :: EGL-4을 전시 동물은 적응 냄새 (- chemotaxis 지수는 제로에 가까운 되오니, 이용에 참고하여 적응 동물의 chemotaxis assays에서 그림 2E 그래프 대표 결과)의 포인트 소스에 매료되지 않습니다. 냄새 유발 핵 translocation의 assays에서 통계적으로 의미가있는 데이터를 생성하려면,실험은 최소 3 배, 별도의 일에를 실행해야합니다. chemotaxis 분석에 대한 자세한 설명을 보려면이 문서 2,490 14 목성을 참조하는 것이 유용 할 수 있습니다.

EGL-4는 계속 AWC 생리학의 안정적이고 오래 지속되는 변화를 일으키는 AWC 뉴런의 핵을 입력하면 경우에도 EGL-4는 핵 (그림 3)에서 더 이상 사용할 수 없습니다. 80 분 냄새에 노출 동물 후 적응 냄새 (그림 3 상단 패널, 왼쪽에 가벼운 바),이 적응도 회복 120 분 (그림 3 상단 패널 오른쪽에 가벼운 바) 이후에 계속된다의 포인트 소스를 무시합니다. 냄새 노출 GFP의 80 분 후 : EGL-4는 AWC의 핵 (그림 3 하단 패널, 왼쪽에 가벼운 바)에서 관찰된다. 이 핵 항목은 필요하고 AWC 5 장기적인 적응을 유발하기에 충분한 모두 있습니다. 120 분 복구 후,이 동물들은 더 이상 핵 GFP :: E를 전시하지GL-4 (그림 3 하단 패널 오른쪽에 가벼운 바) 아직 아직 행동 수준에 적응 냄새 benzaldehyde의 포인트 소스를 무시합니다.

그림 1
그림 1. 장기 냄새 유발 핵 translocation의 assays를위한 프로토콜의 개요를 참조하십시오. 첫째, GFP를 표현 동물 :: EGL-4 (pyIs500 동물) OP50 E.로 놓는 NGM 플레이트에 25 ° C에서 재배되고 대장균. 둘째, 동물 냄새 적응 믹스 (실험 집단) 또는 S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼 (제어 그룹)에 노출되어있다. 셋째, 동물 AWC와 AWC에서 세포질 GFP :: EGL-4을 전시 동물의 수에 핵 GFP을 전시 동물의 수 :: EGL-4를 계산하여 맹목적으로 채점됩니다.

그림 2
그림 2. 외의 허가와 함께 수정됩니다. 6 그림 2B는. 전에 연장 악취 노출, GFP :: EGL-4 AWC의 세포 기질에 지역화되어 있습니다. 그림 2C 할 수 있습니다. 행동 수준에서, 동물 cytosolic GFP와 함께 AWC의 :: EGL-4는 신 지점에 매력을냄새의 CE. 이 그래프는 unadapted 동물의 chemotaxis assays의 대표 결과에서 생성되었습니다. chemotaxis 지수는 가까운 1입니다. 그림 2D합니다. 80 분 냄새 노출 GFP 후 :: EGL은-4 AWC의 핵에 번역되어 있습니다. 그림 2E. AWC에 핵 GFP :: EGL-4을 전시 동물하는 것은 매력을하지 않습니다 적응 냄새의 점 소스. 이 그래프는 적응​​ 동물의 chemotaxis assays의 대표 결과에서 생성되었습니다. chemotaxis 지수는 제로에 가깝 있습니다.

그림 3
그림 3. EGL-4 번이가 계속 AWC 생리학의 안정적이고 오래 지속되는 변화를 일으키는 AWC 뉴런의 핵을 입력 EGL-4는 핵에 더 이상 존재하지 않을 경우에도. 냄새 (80 분)에 노출 동물은 장기 악취 노출 복구 허용에 대한 채점 세포질 대 핵GFP의 국산화 :: EGL-4. (상단 패널) 120 분 복구 후 80 분에 냄새에 노출 된 동물은 여전히​​ 행동​​ 수준에 적응하고 있습니다. (아래 패널) 80 분 동안 냄새에 노출 된 120 분 복구 동물 한 후 더 이상 핵 GFP :: EGL-4을 전시하지 않습니다. 따라서, 핵 EGL-4 EGL-4 이후 계속 AWC의 생리학에서 안정적으로 오래 지속되는 변경 사항을 호출하면 핵에 더 이상 사용할 수 없습니다. 그림은 리 5.의 허가와 함께 수정됩니다. 그림 3 위 패널. 80 분 냄새에 노출 동물 후 적응 냄새의 포인트 소스를 무시합니다,이 적응는 회복의 120 분 이후 지속됩니다. 그림 3 낮은 패널. 냄새 노출 GFP의 80 분 :: EGL-4는 AWC의 핵에서 관찰 한 후. 이 핵 항목은 필요하고 AWC의 장기 적응을 유발하기에 충분한 모두 있습니다. 120 분 복구 후,이 동물들은 더 이상 핵 GFP을 전시하지 :: EGL-4 아직 여전히 점 가진 게 아무것도 무시합니다행동 수준의 적응 냄새 benzaldehyde의 경찰과.

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Discussion

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GFP 태그 EGL-4 분자의 냄새 유발 핵 항목은 여기에 설명하는 것은 C.에서 후각 적응의 강력한 분자 기록을 제공합니다 elegans. 냄새 유발 핵 translocation의 assays은 간단하고 준비 시간을 몇 일을해야합니다. 우리가이 assays에 건설 한 pyIs500 동물은 AWC 신경 세포뿐만 아니라 GFP 태그 EGL-4 단백질을 표현을 비춰 마커를 표현합니다. 따라서, 우리는 뉴런의 클래스로 작업없이 경험이 거의있는 실험이 매우 빠르게합니다 (아마도 몇 다스의 동물을 검토 한 후) 핵 대 세포질 EGL-4에 대한 올바른 전지 및 채점을 식별 편안하게 할 수 있음을 느낀다. 독자는 C로 GFP 분석을 설명 기사 835를 목성을 참조하는 것이 유용 할 수 있습니다 elegans 15.

생성 된 데이터는 최고 품질의 것을 보장하기 위해 우리는 다음과 같은 가이드 라인을 제안 :1) 모든 점수가 무조건 수행해야합니다 2) 오염 (곰팡이 또는 세균)의 흔적을 포함 재배 판을 사용할 수 없습니다, 3) 재배 기간 동안 경험이 굶어 사용해서는 안되는 웜, 그리고 4) 적응 믹스는 신선한하셔야합니다 실험의 날.

모든 감각 시스템은 neuronal 소성의 예를 나타냅니다. 핵으로 신호의 전송은 neuronal 소성 16 안정적인 형태의 매우 보존 기능입니다. 자극을 뉴런의 PKG의 핵 translocation을 나타냅니다 후각 소성의 분자 판독을 개발함으로써, 우리는 생체 모델에서 내 neuronal 소성의 신속하고 자세한 해부에 대한 플랫폼을 제공합니다. 후각 적응의 우리의 분자 표시 장치를 사용 우리는 C.의 후각 적응을 형성하는 이벤트의 일부를 설명하기 시작했다 elegans 5,6,7. 그러나,이 단지 시작이며,의 함수로이 과정을 공부하여GE, 성별, 감염, 또는 다이어트 우리는 회로 및 시스템 레벨에서 neuronal 소성의 중요한 테마를 발견 할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는이 원고의주의 읽기에 대한 스콧 해밀턴과 O'Halloran 연구실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 제안과 통찰력 의견을 익명 리뷰어를 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM plates
Sodium Chloride Fisher Chemical S671-10 NGM plates
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer and NGM plates
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer and NGM plates
Kimwipes - Small Kimberly-Clark LS2770
Ethanol 100% Gold Shield Chemical Co. 43196-115 diluting odors for chemotaxis assays
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C8106-500G NGM plates
Magnesium Sulphate MP Biomedicals 150136-500G NGM plates
Sodium Azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthetic
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose pads
Benzaldehyde Sigma-Aldrich B1334-100G AWC odor
Butanone, ACS Grade Sigma-Aldrich 360473-500ML AWC odor
Microcentrifuge Tubes - 1.5 ml Colored Denville LS8147
Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4" Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV integration
Filter Vacuum Bottle - 500 ml Nalgene 09-740-25B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, (4), 803 (1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4, (2), 179 (1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74, (3), 515 (1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107, (13), 6016 (2010).
  6. O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5, (12), e1000761 (2009).
  7. O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, (2), e31614 (2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
  10. L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25, (3), 575 (2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71 (1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, (1432), 757 (2003).
의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em
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He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).More

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).

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