Summary

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em> ג elegans</em

Published: December 22, 2012
doi:

Summary

כאן אנו מתארים readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em> Elegans Caenorhabditis</em>. קינאז G, EGL-4, החלבון הוא הכרחי לתגובות הסתגלות יציבות בזוג נוירון החושי הראשוני נקרא AWC. במהלך-4 EGL translocates הממושך ריח מהחשיפה cytosol לגרעין של AWC.

Abstract

במהלך גירוי מתמשך נוירונים החושיים ביותר יהיה להתאים את תגובתם על ידי הפחתת רגישותם לאות. תגובת ההסתגלות מסייעת תשומת לב צורה וגם מגנה על תאים מגירוי יתר. הסתגלות בתוך מעגל חוש הריח של ג elegans תואר לראשונה על ידי קולבר וBargmann 1,2. הנה, החוקרים הגדירו פרמטרים של הפרדיגמה הסתגלות חוש הריח, שהם משמשים לעיצוב מסך גנטי לבודד מוטנטים פגומים ביכולתם להסתגל לריחות נדיפים חשו על ידי התאים מסוג C (AWC) נוירונים אגף Amphid החושיים. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש 3 למשך 30 דקות הם יתאימו את היענותם לריח ואז יהיה להתעלם מריח ההתאמה בבדיקה התנהגותית chemotaxis ל~ 1 שעה. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש ל~ 1 שעה ואז הם יוכלו להתעלם מהריח בהתאמת acבדיקה התנהגותית hemotaxis ל~ 3 שעות. שני שלבים אלה של הסתגלות חוש ריח בג elegans תואר כהסתגלות קצרת טווח הרחה (מושרה לאחר חשיפת ריח דק 30), והסתגלות הרחה ארוכת טווח (הנגרם לאחר חשיפת ריח דק 60). מאוחר יותר לעבוד מאטואל et al., 4 חשפו חלבון קינאז G (pkg) נקרא EGL-4 שנדרש עבור שניהם הסתגלות הרחה קצרת טווח וארוך טווח בנוירונים AWC. EGL-4 החלבונים מכילים רצף לוקליזציה גרעיני שהוא הכרחי לתגובות ארוכות טווח הרחת הסתגלות אך dispensable לתגובות הסתגלות הרחה קצרת טווח ב4 AWC. על ידי תיוג EGL-4 בחלבון פלואורסצנטי ירוק, אפשר היה לדמיין את הלוקליזציה של EGL-4 בAWC במהלך חשיפה הממושכת ריח. שימוש הפונקציונלי מלא זה GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) מולקולה הצלחנו לפתח readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח ארוך ב5 AWC. שימוש מ 'זהreadout olecular הסתגלות הרחה היינו מסוגל לבצע שני מסכים גנטיים קדימה לאחור כדי לזהות בעלי חיים מוטנטים כי תערוכה פגומה דפוסי subcellular לוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4 ב6,7 AWC. כאן אנו מתארים: 1) הבנייה של ה-GFP :: EGL-4 חיות מבטאות, 2) הפרוטוקול לגידול של בעלי חיים למבחני טרנסלוקציה ריח מושרה גרעיניים לטווח ארוך, ו3) הניקוד של הטווח ארוך הריח המושרה אירוע גרעיני טרנסלוקציה והתאוששות (מחדש רגישות) מGFP הגרעיני :: מדינת EGL-4.

Protocol

1. בנייה של ה-GFP תייגה EGL-4 בעלי חיים מבטאים שיבוט ההיתוך GFP translational :: EGL-4 תחת האמרגן לגן ODR-3 (שימוש 2678 נ"ב ישירות במעלה זרם של קודון ההתחלה): (עמ ') ODR-3 :: GFP :: EGL-4. ODR-3 כונני אמרגן הביטוי בזוגות נוירון amphid: AWA; AWB…

Representative Results

דוגמה לדפוס הלוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4in AWC לפני ואחרי חשיפה ממושכת ריח מוצגת באיור 2. לפני החשיפה ממושכת ריח, GFP :: EGL-4 הוא מקומי לcytosol של AWC (איור 2 ב '), ולאחר 80 דקות ריח החשיפה GFP :: EGL-4 הם מקומי לגרעין של AWC (האיור 2D). ברמת ההתנהגותית, חיות עם cytosolic GFP ::…

Discussion

הכניסה הגרעינית ריח המושרית של EGL-4 מולקולת ה-GFP-tagged המתואר כאן מספק readout מולקולרי חזק של הסתגלות חוש ריח בג elegans. מבחני טרנסלוקציה הגרעיניים ריח המושרים הם פשוטים ודורשים רק כמה ימים ארוכים של הכנה. PyIs500 החיה שבנינו עבור מבחנים אלה, מבטאת את סמן שמאיר את הנוירו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לסקוט המילטון, וחברי המעבדה 'האלורן לקריאה מדוקדקת של כתב היד הזה. אנו מודים גם למבקר האנונימי שלנו לקבלת הצעות מצוינות והערות תובנה.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM plates
Sodium Chloride Fisher Chemical S671-10 NGM plates
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer and NGM plates
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer and NGM plates
Kimwipes – Small Kimberly-Clark LS2770  
Ethanol 100% Gold Shield Chemical Co. 43196-115 diluting odors for chemotaxis assays
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C8106-500G NGM plates
Magnesium Sulphate MP Biomedicals 150136-500G NGM plates
Sodium Azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthetic
Agarose – UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose pads
Benzaldehyde Sigma-Aldrich B1334-100G AWC odor
Butanone, ACS Grade Sigma-Aldrich 360473-500ML AWC odor
Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored Denville LS8147  
Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ Fisher Scientific 13-678-20B  
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV integration
Filter Vacuum Bottle – 500 ml Nalgene 09-740-25B  

References

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
  4. L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
  6. O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
  7. O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
  10. L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71 (1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).

Play Video

Cite This Article
He, C., Lee, J. I., L’Etoile, N., O’Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).

View Video