Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم doi: 10.3791/4443 Published: December 22, 2012

Summary

نحن هنا وصف قراءات الجزيئي للتكيف على المدى الطويل في حاسة الشم

Abstract

خلال التحفيز المستمر والخلايا العصبية الحسية الأكثر استجابة التكيف عن طريق خفض حساسيتها للإشارة. استجابة التكيف يساعد اهتمام شكل ويحمي الخلايا من التحفيز أيضا بين أكثر. التكيف داخل الدائرة حاسة الشم من C. وكان أول وصف ايليجانس من كولبير وBargmann 1،2. هنا، والكتاب تعريف المعلمات لنموذج التكيف حاسة الشم، التي تستخدم لتصميم شاشة الوراثية لعزل طفرات معيبة في قدرتها على التكيف مع الروائح المتطايرة لمست من قبل الخلايا العصبية Amphid نوع الجناح الخلايا (AWC) C الحسية. عندما wildtype C. ويتعرض الحيوانات ايليجانس لرائحة جذابة لمست AWC-3 لل30 دقيقة وسوف التكيف مع استجابتها للرائحة وسيتم تجاهل ثم رائحة التكيف في الفحص الكيميائي لالسلوكية للساعة 1 ~. عندما wildtype C. ويتعرض الحيوانات ايليجانس لرائحة جذابة لمست-AWC للساعة 1 ~ أنها سوف تتجاهل ثم رائحة التكيف AC فيhemotaxis الفحص السلوكي للساعة 3 ~. هاتين المرحلتين من التكيف حاسة الشم في C. وقد وصفت ايليجانس على المدى القصير التكيف الشمي (يسببها التعرض بعد 30 دقيقة رائحة)، وعلى المدى الطويل التكيف الشمي (يسببها التعرض بعد 60 دقيقة رائحة). العمل في وقت لاحق من L'نجم وآخرون.، كشفت 4 أ G بروتين كيناز (PKG) دعا EGL-4 ما هو مطلوب لكلا التكيف حاسة الشم قصيرة الأجل وطويلة الأجل في الخلايا العصبية AWC. و-4 EGL البروتين يحتوي على تسلسل توطين النووية ما هو ضروري على المدى الطويل ولكن استجابات التكيف حاسة الشم يمكن الاستغناء عنها على المدى القصير استجابات التكيف حاسة الشم في 4 AWC. من علامات EGL-4 مع البروتين الفلورية الخضراء، كان من الممكن تصور توطين EGL-4 في AWC خلال التعرض لفترات طويلة رائحة. استخدام هذا تعمل بكامل طاقتها GFP الموسومة EGL-4 (GFP :: EGL-4) جزيء كنا قادرين على تطوير قراءات الجزيئي للتكيف على المدى الطويل في حاسة الشم ال 5 AWC. استخدام هذا مقراءات olecular التكيف حاسة الشم كنا قادرة على أداء كل من الأمام وعكس شاشات الجينية لتحديد الحيوانات التي تظهر متحولة معيبة أنماط توطين التحت خلوية من GFP :: EGL-4 في 6،7 AWC. نحن هنا وصف: 1) بناء GFP :: EGL-4 معربا عن الحيوانات؛ 2) بروتوكول لزراعة الحيوانات لفترة طويلة الأجل المقايسات إزفاء رائحة بفعل النووية، و 3) التسجيل للمن صنع رائحة طويلة الأمد الحدث النووية إزفاء والانتعاش (إعادة التوعية) من GFP النووية :: EGL-4 الدولة.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. بناء GFP ذات الكلمات الدلالية EGL-4 تعرب عن الحيوانات

  1. استنساخ متعدية GFP الانصهار :: EGL-4 تحت المروج لهذا الجين ODR-3 (2678 BP استخدام المنبع مباشرة من كودون بداية): (ع) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. التعبير ODR-3 محركات المروج في أزواج الخلايا العصبية amphid: AWA؛ AWB؛ AWC، وضعيفة في ASH.
  2. حقن بلازميد (ع) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 في الحيوانات (N2) wildtype في 50 نانوغرام / ميكرولتر مع علامات شارك في حقن باستخدام معيار تقنيات التحول الجرثومية سطر 8: (ع) OFM-1: : GFP 9 (25 نانوغرام / ميكرولتر)، و (ع) 1-ODR :: dsRed 10 (25 نانوغرام / ميكرولتر). وODR-1 التعبير محركات المروج في AWC وAWB أزواج amphid الخلايا العصبية، و-1 OFM التعبير محركات المروج في coelomocytes.
  3. إخضاع الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن صفائف خارج الصبغي بالتفصيل في الخطوة 1.2 إلى أن الأشعة فوق البنفسجية (UV) / trimethylpsoralen (TMP) بروتوكول التكامل11.
  4. التبييض مزامنة الحيوانات 12 و زراعة منهم على لوحات النمو النيماتودا (NGM) وسائل الاعلام التي تحتوي على OP50 E. كولاي إلى المرحلة L4. غسل الحيوانات L4 من أطباق NGM مع العازلة M9 لإزالة OP50 E. كولاي البكتيريا.
  5. إزالة M9 العازلة وإضافة 50-100 ميكرولتر من 30 ميكروغرام / مل حل TMP العمل على بيليه دودة في أنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5. التفاف أنبوب 1.5 مل ميكروسنتريفوج في احباط لمنع الضوء المحيط، وتستنهض الهمم بلطف على محور دوار لمدة 15 دقيقة في احباط الملفوفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. نقل الديدان في حل TMP / دودة لوحة كبيرة NGM غير المصنف.
  6. كشف الديدان على لوحة للأشعة فوق البنفسجية NGM 350 μJ (X100) باستخدام Stratalinker 2400. ثم تضاف الديدان إلى لوحة تحتوي على OP50 NGM واحتضان في الظلام لمدة 5 ساعة.
  7. اختيار 50 لوحات الديدان المعدلة وراثيا المصنفة حوالي 10 (2-5 الديدان كل لوحة). نقل لوحات P0 جديدة كل على مدار 24 ساعة لمدة 3 أيام.
  8. اختيار 250 F1 على نسيليnimals (1 الحيوان في لوحة). استنساخ الحيوانات من 2-4 F2 من كل لوحة F1. تحقق الحيوانات F3 للبحث عن خط نقل 100٪ من خلال النظر في (ع) OFM-1 :: نمط التعبير GFP تحت المجهر الفلورسنت تشريح ل.
  9. هجين الأباعد خط النهائية المتكاملة (s) مع الحيوانات N2 wildtype 5 مرات. وسوف نشير إلى خط متكامل النهائي pyIs500، وGFP الموسومة EGL-4 جزيء وGFP :: EGL-4.

2. زراعة وصيانة الحيوانات لفحوصات إزفاء النووية

  1. زراعة الحيوانات pyIs500 عند 25 ° C في 10 سم لوحات NGM القياسية (انظر أدناه للحصول على وصفة) مع المصنف E. OP50 البكتيريا القولونية 13 (الشكل 1).
  2. في يوم 1، واختيار 04:56 L4 pyIs500 الحيوانات من لوحات تزرع في 25 ° C على 5 سم 10 منفصلة OP50 E. القولونية المصنف لوحات واحتضان عند 25 درجة مئوية (أي، 4-5 L4 الحيوانات في لوحة).
  3. في يوم 4، ص غسل الكبارopulations من pyIs500 الحيوانات من لوحات كبيرة باستخدام NGM S-بصل العازلة (انظر أدناه للحصول على وصفة). استخدام ماصات زجاجية المتاح لنقل الحيوانات، لأنها سوف تلتزم جانب نصائح ماصة بلاستيكية.

3. على المدى الطويل رائحة المستحثة فحوصات إزفاء النووية

  1. غسل الحيوانات pyIs500 3 مرات في S-بصل لإزالة البكتيريا. لا يغسل أجهزة الطرد المركزي الحيوانات بين؛ بدلا تسمح الحيوانات لتسوية عن طريق الجاذبية ثابتة في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. فمن الأهمية بمكان لضمان إزالة جميع البكتيريا، والتي اليافوخات NGM خالية من التلوث، والبكتيريا المتبقية سوف تؤثر سلبا على نتائج الفحص إزفاء. أيضا، وجدنا أن التعقيم وأنابيب ميكروسنتريفوج 1.5 مل تنتج "مثبت" الملكية على الجدران الداخلية للأنبوب الذي يسبب الحيوانات التمسك الجانبين، وذلك باستخدام غير تعقيمها ميكروسنتريفوج 1.5 مل أنابيب.
  2. بينما الحيوانات تسوية بين يغسل، تشكل رانه الحل التكيف. إضافة 100 مل من S-بصل عازلة لاسطوانة مل التخرج 100. إضافة إلى التكيف مع رائحة S-بصل وختم الاسطوانة باستخدام شريط من Parafilm. إذا التكيف أداء بنزيلديهايد إضافة 7.5 ميكرولتر من بنزيلديهايد إلى 100 مل من S-بصل، للتكيف butanone إضافة 11 ميكرولتر من butaone-2 إلى 100 مل من S-القاعدية. قلب بلطف (لا يهز) الاسطوانة التي تحتوي على تخرجه S-بصل ورائحة 30 مرات لإنشاء مستحلب موحدة.
  3. بعد غسل النهائي في S-بصل، والسماح للحيوانات لتسوية وإزالة جميع السائل. تسمية أنبوب واحد "+ لقد" أو "التكيف" وغيرها من أنبوب "لقد-" أو "unadapt". ثم يضاف 1 مل من مزيج التكيف مع التكيف أنبوب microcentrifuge (+ VE)، وإضافة 1 مل من S-بصل إلى أنبوب التحكم ميكروسنتريفوج unadapted (-VE). في محاولة للحفاظ أعداد الحيوانات ما بين 100 و 200 في كل أنبوب. مع بعض الممارسة، فمن الممكن لتقدير العدد التقريبي للحيوانات في بيليه بالعين.
  4. وضع أنبوب 1.5 مل ميكروسنتريفوج غطاء حاميلكل أنبوب (يمنع فتح الأغطية من تفرقع) ووضع أنابيب على محور دوار لمدة 80 دقيقة. لقد وجدنا أن التعرض رائحة بين 60 دقيقة ودقيقة تعطي نتائج مماثلة 80 (سواء نتيجة في استجابات التكيف على المدى الطويل). ومع ذلك، 80 دقيقة التعرض يوفر نتائج أكثر اتساقا في أيدينا. وبالتالي لدينا جميع المقايسات التكيف على المدى الطويل هي موحدة باستخدام رائحة دقيقة 80 التعرض (الشكل 2).
  5. بعد 80 دقيقة، وغسل الحيوانات 3 مرات في S-القاعدية. سماح للحيوانات لتسوية عن طريق الجاذبية بين كل غسل.

4. على المدى القصير الناجم عن رائحة فحوصات إزفاء النووية

  1. في حالة التكيف رائحة قصيرة الأجل، واستخدام نفس البروتوكول وفقا لفحوصات طويلة الأجل الناجمة عن رائحة النبات (3،1-3،4 خطوات)، بدلا من احتضان ولكن هذه الحيوانات في التكيف pyIs500 رائحة لمدة 80 دقيقة، واستخدام التعرض 30 دقيقة . تحديد مقدار رائحة الناجم عن المقايسات إزفاء النووية المبينة أدناه (الخطوة 5) هو نفسه بالنسبة لتير قصيرة وطويلة الأجلالتعرض م.

5. سجل رائحة الناجم عن الحدث إزفاء النووية

  1. جعل 2٪ الاغاروز منصات تحتوي على 5 ملي أزيد الصوديوم (نان 3) عن طريق إذابة هلام الاغاروز الكهربائي في DH 2 0. وضع قطرة واحدة من الاغاروز المنصهرة التي تحتوي نان 3 على شريحة ميكروسكوب زجاجية. ضع شريحة أخرى على الفور المجهر الزجاج على الشريحة الأولى لشد قطرة من الاغاروز المنصهر. يترك لمدة 30 ثانية، ثم ندف بلطف بعيدا المجهر الشرائح المجهر ترك شريحة واحدة مع لوحة مسطحة من الاغاروز مم 1 ~.
  2. بعد غسل النهائي في S-بصل، والسماح للالديدان لتسوية في أنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5 و إزالة جميع السائل. ثم تضاف الحيوانات قطرة من الحكمة على منصات الاغاروز من الشرائح المجهر عدة. من المهم للحفاظ على أعداد الحيوانات في الشريحة ما بين 50 و 100. والعديد من الحيوانات أيضا لكل شريحة تعقيد التهديف وخلق توهج في كثير من الأحيان بعد تناثر الضوء الأزرق الإثارة. قد السائل الزائديكون الأشرار من منصة الاغاروز باستخدام الصغيرة كيم القضاء. وضع الزجاج 0.5 مم غطاء للانزلاق على منصة واسمحوا الوقوف لمدة 2 دقيقة للسماح لنان 3 إلى شل الحيوانات. ملاحظة، يمكن استرداد الحيوانات من الشرائح بعد التسجيل. فإن الحيوانات التعافي من التخدير بعد ساعة 3 نان 1 ~ إذا نقل إلى لوحة NGM المصنف إلى قطرة من الاحتياطي M9.
  3. في هذه المرحلة لا بد من أن كل مجرب وضع المفتاح لتتبع الشريحة التي هي تجريبية (+ VE) والشريحة التي هي الشريحة التحكم (-VE) الشريحة، وتمرير الشرائح إلى شخص آخر من شأنها أن يسجل عمياء GFP: EGL-4 نمط التوطين. وهذه السيطرة لأي تحيز المجرب.
  4. نقاط ما بين 50 و 100 في الحيوانات الشريحة باستخدام المجهر الفلورسنت تستقيم مع الأهداف التكبير 10X، 40X 63X والمرشحات وGFP / RFP. أولا، حدد موقع الحيوانات تحت التكبير 10x باستخدام مشرق مجال الإضاءة. ثانيا، تحديد موقع الخلايا العصبية AWC عن طريق إيقاف مشرقاتي مجال الإضاءة وباستخدام فلتر RFP. و(ع) ODR-1 :: محركات dsRed التعبير في الخلايا العصبية وAWB AWC. الخلايا العصبية لديها AWC مميزة البيضاوي على شكل أجسام الخلايا بالمقارنة مع أجسام الخلايا AWB التي هي أصغر ودائرية الشكل (الشكل 2).
  5. مرة واحدة وقد يقع جسم الخلية AWC، والتحول إلى تصفية GFP وتسجيل توطين GFP: EGL-4 كما نووية أو حشوية. باستخدام عداد يسمح للمجرب لمواصلة البحث في العدسة في حين سجل الشريحة. ملاحظة: يتم تكرار خطوات 5،1-5،5 على الأقل 3 مرات في أيام منفصلة لإنتاج بيانات ذات دلالة إحصائية (أرقام 1-2).

6. رصد GFP الموسومة EGL-4 من خلال استعادة التكيف رائحة طويلة الأمد

  1. بعد الخطوة 3.5، تقسيم سكان pyIs500 الحيوانات في نقاط متعددة ومأخوذة عن GFP النووية مقابل حشوية :: EGL-4 في AWC في نقطة الصفر مرة (وهذا هو، بعد التعرض دقيقة 80) ومنقطة ultiple وقت لاحق (الشكل 3).
  2. نقل كل من التحكم (-VE) وحيوانات التجارب (+ VE) باستخدام ماصات زجاجية المتاح على لوحات NGM.
  3. السماح لاستعادة الحيوانات لفترات مختلفة من الوقت وإعادة النظر في توطين GFP :: EGL-AWC 4in في كل نقطة زمنية كما في خطوات 5،1 حتي 5،5.

7. المواد

لوحات NGM: ل1 L 1 0 إضافة إلى L 2 DDH: 21 ز Bacto أجار، 3 ز كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)؛ 2.5 غرام Bacto-ببتون. الأوتوكلاف وسائل الإعلام. بعد التعقيم، وأجار بارد حتى درجة حرارة 54 ° C. يقرأ إضافة الحلول التالية: فوسفات البوتاسيوم 25 مل العازلة 1M، 1 مل كبريتات المغنيسيوم M 1 (MgSO 4)؛ 1 مل الكالسيوم كلوريد M 1 (CaCl 2) (1)؛ الكولسترول مل في الإيثانول (5 ملغ / مل الأسهم).

1 M ثنائي القاعدة K 2 HPO 4 174،2 ز / مول: للحصول على 500 مل: 400 مل في O 2 DDH، ويحل 87،1 ز Dibasiج K 2 HPO 4. ضبط مستوى الصوت إلى 500 L مع DDH 2 O. تصفية تعقيم باستخدام 500 مل وحدة تصفية العقيمة.

1 M أحادى KH 2 PO 4 136،1 ز / مول: ل 1 L: في 800 مل O 2 DDH، ويحل 136،1 ز أحادى KH 2 PO 4. ضبط مستوى الصوت إلى 1 L مع DDH 2 O. تصفية تعقيم باستخدام 500 مل وحدة تصفية العقيمة.

1 فوسفات البوتاسيوم M (K 3 PO 4) 6.0 درجة الحموضة عازلة: ل 1 L: في وحدة تصفية العقيمة 1 L، إضافة 868 مل من 1 M KH 2 PO أحادى 4. تسمح وحدة لتصفية من خلال، ثم يضاف مل 132 من 1 M ثنائي القاعدة HPO 2 K 4. تسمح وحدة لتصفية جميع السائل. إزالة وحدة تصفية وضبط درجة الحموضة إلى 6.0. تخزين في درجة حرارة الغرفة.

S-بصل: ل1 L: إضافة 50 مل 1M K 3 PO 4 العازلة، ودرجة الحموضة ~ 6.0؛ و 20 مل 5M عبد القدير كلوريد الصوديوم. ملء إلى 1 L معDDH 2 O. الأوتوكلاف الحل.

M9: ل1 L: 3 ز KH 2 PO 4 و 6 ز نا 2 HPO 4 و 5 ز كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgSO H 2 O. ملء إلى 1 0 2 مع L DDH. تعقيم بواسطة التعقيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد مثال على نمط توطين GFP :: EGL-AWC 4in وقبل وبعد التعرض لفترات طويلة رائحة في الشكل 2. يتم ترجمة قبل التعرض لفترات طويلة رائحة، GFP :: EGL-4 إلى العصارة الخلوية من AWC (الشكل 2B)، وبعد 80 دقيقة من التعرض رائحة GFP :: يتم ترجمة EGL-4 إلى نواة AWC (الشكل 2D). على المستوى السلوكي، تنجذب الحيوانات مع GFP عصاري خلوي :: EGL-4 في AWC إلى مصدر الرائحة نقطة (الشكل 2C الرسوم البيانية نتائج ممثلة من المقايسات الكيميائي للحيوانات unadapted - لاحظ الكيميائي 3 هو مؤشر على مقربة من 1). لا تنجذب الحيوانات العارضة GFP النووية :: EGL-4 في AWC إلى مصدر نقطة من رائحة التكيف (الشكل 2E الرسوم البيانية نتائج ممثلة من المقايسات الكيميائي للحيوانات تكيفت - لاحظ مؤشر الكيميائي قريبة من الصفر). لتوليد بيانات ذات دلالة إحصائية من رائحة الناجم عن المقايسات إزفاء النووية،يجب تشغيل التجارب على الأقل 3 مرات في أيام منفصلة و. للحصول على وصف مفصل للفحص الكيميائي قد يكون من المفيد أن أشير إلى إن الرب المادة 2490 14.

مرة واحدة EGL-4 يدخل نواة الخلايا العصبية AWC أنه يسبب تغييرات مستقرة وطويلة الأمد في علم وظائف الأعضاء AWC التي تستمر حتى عندما EGL-4 لم يعد في النواة (الشكل 3). وبعد 80 دقيقة من التعرض الحيوانات رائحة تجاهل مصدر نقطة من رائحة التكيف (الشكل 3 اللوحة العليا، شريط الضوء على اليسار)، وهذا التكيف سوف تستمر حتى بعد 120 دقيقة من الانتعاش (الشكل 3 اللوحة العليا، شريط الضوء على اليمين). بعد 80 دقيقة من التعرض رائحة GFP: لوحظ EGL-4 في نواة AWC (الشكل 3 اللوحة السفلى، شريط الضوء على اليسار). هذا الدخول النووية على حد سواء اللازم والكافي للحث على المدى الطويل التكيف في ال 5 AWC. بعد الشفاء دقيقة 120، هذه الحيوانات لم تعد تظهر GFP النووية :: EGL-4 (الشكل 3 اللوحة السفلى، شريط الضوء على اليمين) سوف تتجاهل حتى الآن لا تزال مصدر نقطة من بنزيلديهايد رائحة التكيف على المستوى السلوكي.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على بروتوكول للفحوصات طويلة الأجل الناجمة عن رائحة إزفاء النووية. أولا، تزرع الحيوانات معربا عن GFP :: EGL-4 (pyIs500 الحيوانات) في C ° 25 على لوحات NGM المصنف مع E. OP50 القولونية. ثانيا، تتعرض الحيوانات لرائحة مزيج التكيف (المجموعة التجريبية) أو المخزن المؤقت S-بصل (مجموعة المراقبة). ثالثا، وسجل الحيوانات عمياء عن طريق حساب عدد من الحيوانات واظهار GFP النووية :: EGL-4 في AWC وعدد من الحيوانات واظهار GFP حشوية :: EGL-4 في AWC.

الشكل 2
الشكل 2. وآخرون .. 6 2B الشكل. قبل التعرض لفترات طويلة رائحة، GFP :: EGL-4 المترجمة إلى العصارة الخلوية من AWC. الشكل 2C. وعلى المستوى السلوكي، والحيوانات مع GFP عصاري خلوي تنجذب :: EGL-4 في AWC إلى نقطة الحامضم من الرائحة. تم إنشاء هذا الرسم البياني من نتائج ممثلة من المقايسات الكيميائي للحيوانات unadapted. لاحظ مؤشر الكيميائي على مقربة من 1. الشكل 2D. بعد 80 دقيقة من التعرض رائحة GFP :: EGL-4 المترجمة إلى نواة AWC. 2E الشكل. الحيوانات العارضة GFP النووية :: EGL-4 في AWC لا تنجذب لمصدر نقطة من رائحة التكيف. تم إنشاء هذا الرسم البياني من نتائج ممثلة من المقايسات الكيميائي للحيوانات تكييفها. لاحظ مؤشر الكيميائي قريبة من الصفر.

الشكل 3
الشكل 3. مرة واحدة EGL-4 يدخل نواة الخلايا العصبية AWC أنه يسبب تغييرات مستقرة وطويلة الأمد في علم وظائف الأعضاء AWC التي تستمر حتى عندما EGL-4 لم يعد في النواة. ويسمح الحيوانات المعرضة لرائحة (80 دقيقة) للتعافي من التعرض رائحة طويلة الأجل وسجل للحشوية مقابل النوويةتوطين GFP :: EGL-4. (اللوحة العليا) وبعد 120 دقيقة الانتعاش لا يزال يتم تكييفها الحيوانات التي تعرضت لرائحة لمدة 80 دقيقة على المستوى السلوكي. (اللوحة السفلى) بعد 120 دقيقة الانتعاش الحيوانات التي تعرضت لرائحة لمدة 80 دقيقة لم يعد يحمل GFP النووية :: EGL-4. وهكذا، EGL النووية-4 استدعاء مستقرة تغييرات تستمر فترات طويلة في علم وظائف الأعضاء من AWC أن تستمر بعد EGL-4 لم يعد في النواة. تم تعديل الرقم بإذن من لي وآخرون. 5. الشكل 3 اللوحة العليا. وبعد 80 دقيقة من التعرض الحيوانات رائحة تجاهل مصدر نقطة من رائحة التكيف، وهذا التكيف سوف تستمر حتى بعد 120 دقيقة من الانتعاش. الشكل 3 اللوحة السفلى. لوحظ بعد 80 دقيقة من التعرض GFP رائحة :: EGL-4 في نواة AWC. هذا الدخول النووية على حد سواء اللازم والكافي للحث على المدى الطويل التكيف في AWC. بعد الشفاء دقيقة 120، هذه الحيوانات لم تعد تظهر GFP النووية :: EGL-4 بعد سيتم تجاهل تزال نقطة الدانقRCE من بنزيلديهايد رائحة التكيف على المستوى السلوكي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

دخول رائحة النووية التي يسببها جزيء من GFP الموسومة-4 EGL الموصوفة هنا يقدم قراءات قوية الجزيئي للتكيف حاسة الشم في C. ايليجانس. رائحة الناجم عن المقايسات إزفاء النووية هي واضحة وتتطلب سوى بضعة أيام من وقت الإعداد. الحيوان pyIs500 أننا شيدت لهذه المقايسات، يعبر عن علامة الذي ينير الخلايا العصبية AWC وكذلك التعبير عن GFP الموسومة EGL-4 البروتين. وهكذا، نرى أن مجرب مع قليل من دون خبرة في العمل مع هذه الفئة من الخلايا العصبية يمكن بسرعة كبيرة (ربما بعد فحص الحيوانات بضع عشرات) تبدأ تشعر بالراحة تحديد الخلية الصحيحة والتسجيل لالسيتوبلازمية النووية مقابل EGL-4. قد يكون من المفيد للقارئ أن أشير إلى إن الرب المادة 835 التي تصف تحليل GFP في C. ايليجانس 15.

للتأكد من أن البيانات التي تم إنشاؤها هي من أعلى مستويات الجودة نقترح الإرشادات التالية:1) يجب أن تتم جميع التهديف عمياء؛ 2) لا يمكن لوحات زراعة تحتوي على أي أثر للتلوث (الفطرية أو الجرثومية) يمكن أن تستخدم، 3) الديدان التي لا ينبغي أبدا المجاعة شهدت خلال زراعة استخدامها، ويجب و4) أن يتم يمزج التكيف جديدة على يوم التجريب.

جميع أنظمة حسية تظهر أمثلة من اللدونة العصبية. انتقال إشارات إلى النواة هي ميزة الحفظ للغاية من أشكال مستقرة من اللدونة العصبية 16. من خلال تطوير قراءات الجزيئي للاللدونة حاسة الشم التي تمثل إزفاء النووية من PKG في الخلايا العصبية حفز، ونحن نقدم منبرا للتشريح السريع ومفصلة من اللدونة العصبية داخل الجسم الحي في النموذج. باستخدام قراءات لدينا الجزيئي للتكيف حاسة الشم بدأنا لوصف بعض الأحداث التي تشكل حاسة الشم في التكيف C. ايليجانس 5،6،7. ومع ذلك، وهذا هو مجرد بداية، وهذه العملية من خلال دراسة بوصفها وظيفة منجنرال الكتريك، والجنس، والعدوى، أو النظام الغذائي قد نكتشف من المواضيع الهامة اللدونة العصبية في الدوائر ومستوى النظم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر سكوت هاملتون، وأعضاء المختبر O'Halloran لقراءة متأنية لهذه المخطوطة. نشكر أيضا مجتمعنا مجهول للحصول على اقتراحات ممتازة والتعليقات الثاقبة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM plates
Sodium Chloride Fisher Chemical S671-10 NGM plates
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer and NGM plates
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer and NGM plates
Kimwipes - Small Kimberly-Clark LS2770
Ethanol 100% Gold Shield Chemical Co. 43196-115 diluting odors for chemotaxis assays
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C8106-500G NGM plates
Magnesium Sulphate MP Biomedicals 150136-500G NGM plates
Sodium Azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthetic
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose pads
Benzaldehyde Sigma-Aldrich B1334-100G AWC odor
Butanone, ACS Grade Sigma-Aldrich 360473-500ML AWC odor
Microcentrifuge Tubes - 1.5 ml Colored Denville LS8147
Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4" Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV integration
Filter Vacuum Bottle - 500 ml Nalgene 09-740-25B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, (4), 803 (1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4, (2), 179 (1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74, (3), 515 (1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107, (13), 6016 (2010).
  6. O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5, (12), e1000761 (2009).
  7. O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, (2), e31614 (2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
  10. L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25, (3), 575 (2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71 (1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, (1432), 757 (2003).
A قراءات الجزيئية من التكيف على المدى الطويل في الشم<em&gt; C. ايليجانس</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).More

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter