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Neuroscience

लंबी अवधि में घ्राण अनुकूलन के एक आणविक Readout doi: 10.3791/4443 Published: December 22, 2012

Summary

यहाँ हम लंबी अवधि में घ्राण अनुकूलन के एक आणविक readout का वर्णन

Protocol

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1. GFP का निर्माण EGL-4 व्यक्त पशु Tagged

  1. जीन ओडीआर 3 (2678 बीपी सीधे शुरू कोडोन के अपस्ट्रीम उपयोग करें) के लिए प्रमोटर के तहत translational संलयन :: GFP क्लोन EGL-4: (पी) ओडीआर-3 :: GFP :: EGL-4. अभिव्यक्ति amphid न्यूरॉन जोड़े में ओडीआर 3 प्रमोटर ड्राइव: AWA, AWB, AWC, और राख में कमजोर.
  2. (पी) OFM-1: प्लाज्मिड (पी) ओडीआर-3 :: GFP wildtype जानवरों (N2) में 50 में EGL-4 मानक रोगाणु लाइन परिवर्तन 8 तकनीकों का उपयोग करते हुए सह इंजेक्शन मार्कर के साथ एनजी / μl इंजेक्षन: : GFP 9 (25 एनजी / μl), और (पी) ओडीआर-1 :: dsRed 10 (25 एनजी / μl). AWC और AWB amphid न्यूरॉन जोड़े में ओडीआर-1 प्रमोटर ड्राइव अभिव्यक्ति, और OFM 1-coelomocytes में प्रमोटर ड्राइव अभिव्यक्ति.
  3. ट्रांसजेनिक 1.2 चरण में अल्ट्रा वायलेट (यूवी) / (tmp) एकीकरण प्रोटोकॉल trimethylpsoralen extrachromosomal विस्तृत arrays व्यक्त जानवरों विषय11.
  4. ब्लीच 12 पशुओं सिंक्रनाइज़ और उन्हें निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) OP50 ई. युक्त प्लेटों पर खेती L4 मंच कोलाई. एन जी एम प्लेटों से L4 जानवरों M9 बफर के साथ OP50 ई. हटाने धो कोलाई बैक्टीरिया.
  5. M9 बफर निकालें और 30 ग्राम / 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में मिली tmp कीड़ा गोली पर काम समाधान के 50-100 μl जोड़ें. लपेटें पन्नी में 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के परिवेश प्रकाश ब्लॉक, और एक आवर्तनी पर धीरे से पन्नी लिपटे 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 15 मिनट के लिए आंदोलन. स्थानांतरण / tmp कीड़ा समाधान एक बड़े गैरवरीय एन जी एम प्लेट में कीड़े.
  6. यूवी 350 μJ (X100) एन जी एम प्लेट एक Stratalinker 2400 का उपयोग कर पर कीड़े बेनकाब. फिर एक OP50 युक्त एन जी एम प्लेट कीड़े जोड़ने और 5 घंटे के लिए अंधेरे में सेते हैं.
  7. लगभग 10 वरीयता प्राप्त प्लेट (2-5 कीड़े प्रत्येक प्लेट) के लिए 50 ट्रांसजेनिक कीड़े उठाओ. स्थानांतरण P0 नई प्लेटों के लिए 3 दिनों के लिए हर 24 घंटे है.
  8. 250 clonal F1 उठाओnimals (प्लेट प्रति पशु 1). प्रत्येक F1 थाली से 2-4 F2 जानवरों के क्लोन. F3 जानवरों की जाँच करने के लिए (पी) में OFM-1 :: एक विदारक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे GFP अभिव्यक्ति पैटर्न देख द्वारा एक 100% संचरण लाइन के लिए देखो.
  9. Outcross wildtype N2 जानवरों के साथ अंतिम एकीकृत लाइन (ओं) 5 बार. हम pyIs500 के रूप में अंतिम एकीकृत लाइन का उल्लेख है, और GFP रूप GFP टैग EGL 4 अणु :: EGL-4.

2. और परमाणु स्थानान्तरण assays के लिए खेती और पशु के रखरखाव

  1. 25 में pyIs500 जानवरों खेती ° C (नुस्खा के लिए नीचे देखें) मानक 10 सेमी एन जी एम प्लेटों पर OP50 ई. के साथ वरीय कोलाई बैक्टीरिया 13 (1 चित्रा).
  2. 1 दिन, पांच अलग - अलग 10 OP50 ई. सेमी पर 25 में खेती की प्लेटों से चार से पाँच L4 pyIs500 जानवरों डिग्री सेल्सियस लेने कोलाई 25 में प्लेटें और सेते वरीयता प्राप्त ° C (जो है, प्लेट प्रति 4-5 L4 जानवरों).
  3. 4 दिन, वयस्क पी धो लोबड़ी एन जी एम एस बेसल बफर का उपयोग कर प्लेटें बंद opulations pyIs500 जानवरों (नुस्खा के लिए नीचे देखें). डिस्पोजेबल गिलास pipettes का उपयोग करने के लिए पशुओं पर स्थानांतरित करने के लिए, के रूप में वे प्लास्टिक विंदुक युक्तियाँ के पक्ष के लिए छड़ी होगी.

3. लंबी अवधि के गंध Induced परमाणु स्थानान्तरण Assays

  1. PyIs500 जानवरों बैक्टीरिया को दूर बेसल में 3 बार धोएं. Washes के बीच जानवरों अपकेंद्रित्र मत करो, बल्कि जानवरों को गंभीरता से एक स्थिर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. यह सभी बैक्टीरिया को सुनिश्चित करने के निकाल दिया जाता है के लिए महत्वपूर्ण है, और कि एन जी एम pates संक्रमण से मुक्त कर रहे हैं, के रूप में अवशिष्ट बैक्टीरिया नकारात्मक स्थानान्तरण परख के परिणाम को प्रभावित करेगा. इसके अलावा, हमने पाया है है कि 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों वाष्पदावी विसंक्रण एक ट्यूब है कि जानवरों पक्षों के लिए छड़ी का कारण बनता है, और इसलिए गैर autoclaved 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग की भीतरी दीवारों पर "" चिपचिपा संपत्ति पैदा.
  2. जबकि जानवरों washes के बीच का भुगतान कर रहे हैं, टी बनानेवह अनुकूलन समाधान. एक 100 मिलीलीटर स्नातक सिलेंडर एस बेसल बफर की 100 मिलीलीटर जोड़ें. एस बेसल गंध आदत डाल जोड़ें और सिलेंडर सील Parafilm की एक पट्टी का उपयोग. यदि प्रदर्शन benzaldehyde अनुकूलन एस बेसल की 100 मिलीलीटर benzaldehyde के 7.5 μl जोड़ने लिए butanone अनुकूलन एस बेसल की 100 मिलीलीटर के लिए 2-butaone के 11 μl जोड़ने. धीरे पलटना (हिला नहीं है) स्नातक सिलेंडर युक्त एस बेसल और गंध 30 बार एक वर्दी पायस बनाने.
  3. एस बेसल में अंतिम धोने के बाद जानवरों को व्यवस्थित करने और सभी तरल निकालने की अनुमति देते हैं. लेबल एक ट्यूब "+ ve" या "अनुकूलन" और अन्य ट्यूब "ve" या "unadapt". फिर अनुकूलन microcentrifuge ट्यूब (+ ve) अनुकूलन मिश्रण के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और जिन्हे नगरपालिका इत्यादि स्थानिय संस्थाओ ने अपने प्रबंध मे न लिया हो नियंत्रण microcentrifuge ट्यूब (-ve) एस बेसल 1 मिलीलीटर जोड़ने. प्रत्येक ट्यूब में 100 और 200 के बीच जानवरों की संख्या रखने की कोशिश करें. कुछ अभ्यास के साथ, यह संभव है कि एक गोली में आंख से पशुओं की अनुमानित संख्या का अनुमान है.
  4. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब टोपी रक्षक जगहप्रत्येक ट्यूब (lids को popping खोलने से रोकता है) और 80 मिनट के लिए एक रोटेटर पर ट्यूबों जगह. हमने पाया है कि 60 मिनट और 80 मिनट के बीच गंध जोखिम पैदावार इसी तरह के परिणाम (लंबी अवधि के अनुकूलन प्रतिक्रियाओं में दोनों परिणाम). हालांकि, 80 मिनट जोखिम हमारे हाथ में और अधिक अनुरूप परिणाम प्रदान करता है. इस प्रकार हमारे सभी लंबी अवधि के अनुकूलन assays एक 80 मिनट की गंध जोखिम (चित्रा 2) का उपयोग करके मानकीकृत कर रहे हैं.
  5. 80 मिनट के बाद, जानवरों एस बेसल में 3 बार धो लो. जानवरों के प्रत्येक धोने के बीच गुरुत्वाकर्षण से व्यवस्थित करने की अनुमति दें.

4. लघु अवधि के गंध प्रेरित परमाणु स्थानान्तरण Assays

  1. अल्पकालिक गंध अनुकूलन के मामले में, प्रति लंबी अवधि के गंध प्रेरित स्थानान्तरण assays (3.1-3.4 कदम) के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग incubating 80 मिनट के लिए गंध ज्यादा अनुकूल ढालने में pyIs500 जानवरों की लेकिन बजाय, एक 30 मिनट जोखिम का उपयोग करें . गंध प्रेरित परमाणु स्थानान्तरण नीचे उल्लिखित assays (5 चरण) की मात्रा का ठहराव लंबी अवधि और कम से आतंकवाद के लिए एक ही हैमीटर जोखिम.

5. गंध प्रेरित परमाणु स्थानान्तरण इवेंट स्कोरिंग

  1. 2% agarose 0 2 DH में जेल वैद्युतकणसंचलन agarose भंग द्वारा 5 मिमी सोडियम azide (3 NaN) युक्त पैड हैं. पिघला हुआ agarose की एक बूंद एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर NaN 3 युक्त रखें. तुरंत पहले पिघला हुआ agarose के ड्रॉप समतल स्लाइड पर एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड जगह है. 30 सेकंड के लिए छोड़ दें, और फिर धीरे से अलग चिढ़ाने के ~ 1 मिमी के एक फ्लैट agarose पैड के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड छोड़ने खुर्दबीन स्लाइड.
  2. एस बेसल में अंतिम धोने के बाद, कीड़े 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में व्यवस्थित करने के लिए और सभी तरल निकालने की अनुमति देते हैं. तो कई खुर्दबीन स्लाइड के agarose पैड पर ड्रॉप - वार जानवरों जोड़ने. यह स्लाइड प्रति पशुओं की संख्या 50 और 100 के बीच रखने के लिए महत्वपूर्ण है. स्लाइड प्रति बहुत सारे जानवरों स्कोरिंग जटिल और अक्सर नीली बत्ती उत्तेजना के बाद एक बिखरने चमक पैदा करेगा. अतिरिक्त तरलagarose पैड से किम पोंछ छोटे का उपयोग करके दुष्ट हो. पैड पर एक 0.5 मिमी कांच कवर पर्ची प्लेस और 2 मिनट के लिए खड़े NaN 3 के लिए अनुमति देने के लिए जानवरों को स्थिर करते हैं. नोट, स्कोरिंग के बाद जानवरों स्लाइड से बरामद किया जा सकता है. जानवरों NaN 3 चतनाशून्य करनेवाली औषधि से ~ 1 घंटे के बाद ठीक हो अगर M9 बफर की एक बूंद में एक वरीय एन जी एम प्लेट स्थानांतरित कर दिया जाएगा.
  3. इस बिंदु पर यह जरूरी है कि प्रत्येक experimenter एक ट्रैक जो स्लाइड में प्रयोगात्मक स्लाइड (ve +) है और स्लाइड जो नियंत्रण (-ve) स्लाइड कुंजी चिंतन करना, और एक अन्य व्यक्ति है कि आँख बंद करके GFP स्कोर होगा स्लाइड पास: EGL-4 स्थानीयकरण पैटर्न. यह किसी भी प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह के लिए को नियंत्रित करेगा.
  4. स्लाइड प्रति 50 और 100 जानवरों 10X, 40X और 63X बढ़ाई उद्देश्यों और GFP / आरएफपी फिल्टर के साथ एक ईमानदार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के बीच कुल. सबसे पहले, 10X उज्ज्वल मैदान रोशनी का उपयोग कर वृद्धि के तहत जानवरों का पता लगाने. दूसरे, बंद brigh मोड़ AWC न्यूरॉन का पता लगानेटी क्षेत्र रोशनी और आरएफपी फिल्टर का उपयोग कर. (पी) AWB और AWC न्यूरॉन्स में ओडीआर-1 :: dsRed ड्राइव अभिव्यक्ति. AWC न्यूरॉन्स विशिष्ट अंडाकार आकार सेल निकायों AWB सेल निकायों जो छोटे और आकार में गोल कर रहे हैं (चित्रा 2) के रूप में के साथ तुलना में.
  5. एक बार AWC सेल शरीर में स्थित किया गया है, GFP फिल्टर करने के लिए स्विच और GFP की स्थानीयकरण रिकॉर्ड: परमाणु या cytoplasmic EGL-4. एक काउंटर का उपयोग experimenter ऐपिस में लग रही है जबकि स्लाइड स्कोरिंग रखने के लिए अनुमति देता है. नोट: 5.1-5.5 कदम अलग दिनों पर कम से कम 3 बार दोहराया सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा (1-2 आंकड़े) का उत्पादन कर रहे हैं.

6. लंबी अवधि के गंध अनुकूलन से वसूली के दौरान मॉनिटरिंग GFP EGL-4 टैग

  1. 3.5 कदम के बाद, कई समय बिंदु शून्य पर AWC में aliquots परमाणु बनाम cytoplasmic GFP के लिए स्कोर :: EGL-4 में विभाजित pyIs500 जानवरों की आबादी (है कि 80 मिनट के प्रदर्शन के बाद) और मीटरultiple बाद समय अंक (3 चित्रा).
  2. दोनों (-ve) नियंत्रण और प्रयोगात्मक जानवरों (ve +) एन जी एम प्लेटों पर डिस्पोजेबल गिलास pipettes का उपयोग स्थानांतरण.
  3. जानवरों को समय के विभिन्न लंबाई के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें और प्रत्येक समय बिंदु पर फिर से जांच :: GFP AWC EGL 4in स्थानीयकरण चरणों में 5.1 5.5 के रूप में.

7. सामग्री

एन जी एम प्लेट: 3 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl); 2.5 छ Bacto - peptone 21 छ Bacto अग्रवाल: 1 एल 1 एल DDH 2 0 जोड़ने. आटोक्लेव मीडिया. वाष्पदावी विसंक्रण, शांत अगर के बाद जब तक तापमान 54 डिग्री सेल्सियस पढ़ता , 1 मिलीग्राम 1 एम मैग्नीशियम सल्फेट (4 MgSO), 1 मिलीग्राम 1 एम कैल्शियम क्लोराइड (2 CACL), इथेनॉल में 1 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल (शेयर 5 मिग्रा / मिली) 25 मिलीलीटर 1M पोटेशियम फॉस्फेट बफर: निम्न समाधानों जोड़ें.

1 एम Dibasic कश्मीर 2 HPO 4 174.2 छ / mol: 500 मिलीलीटर के लिए: 400 मिलीलीटर DDH 2 ओ में भंग, 87.1 छ Dibasiसी 2 कश्मीर HPO 4. DDH 2 ओ के साथ 500 एल मात्रा समायोजित 500 मिलीलीटर बाँझ फिल्टर यूनिट का उपयोग बाँझ बनाना फ़िल्टर.

1 एम एक भस्मक 2 KH पीओ 4 136.1 छ / mol: 1 एल के लिए: 800 मिलीलीटर DDH 2 हे में 136.1 छ एक भस्मक 2 KH 4 पीओ भंग. DDH 2 ओ के साथ 1 एल मात्रा समायोजित 500 मिलीलीटर बाँझ फिल्टर यूनिट का उपयोग बाँझ बनाना फ़िल्टर.

1 एम पोटेशियम फॉस्फेट (3 K पीओ 4) बफर पीएच 6.0: 1 एल के लिए: 1 एल बाँझ फिल्टर यूनिट में 1 एम एक भस्मक 2 KH 4 पीओ के 868 मिलीलीटर जोड़ने. इकाई के माध्यम से फिल्टर करने की अनुमति दें, तो 1 एम Dibasic कश्मीर 2 4 HPO 132 मिलीलीटर जोड़ने. इकाई सभी तरल फिल्टर करने की अनुमति दें. फिल्टर यूनिट निकालें और 6.0 पीएच को समायोजित. कमरे के तापमान पर स्टोर.

एस बेसल: 1 एल के लिए: 50 मिलीलीटर 1M कश्मीर 3 पीओ 4 बफर जोड़ने के लिए, ~ 6.0 पीएच, और 20 मिलीलीटर 5M NaCl aq. 1 एल के साथ भरेंDDH 2 ओ समाधान आटोक्लेव.

M9: 3 छ KH 2 4 पीओ, 6 छ ना 2 4 HPO, 5 ग्राम NaCl, 1 मिलीग्राम 1 एम MgSO 4, एच 2 ओ: 1 एल के लिए साथ DDH 2 0 1 एल भरें. वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा जीवाणुरहित.

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Representative Results

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:: GFP EGL 4in स्थानीयकरण AWC पहले पैटर्न और लंबे समय तक गंध के प्रदर्शन के बाद के एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. पिछले लंबे समय तक गंध जोखिम, GFP :: EGL-4 AWC (चित्रा 2B) की cytosol स्थानीय है, और के बाद 80 मिनट में गंध जोखिम GFP :: EGL-4 AWC (चित्रा 2 डी) के नाभिक के लिए स्थानीय है. व्यवहार के स्तर, साइटोसोलिक :: AWC में GFP EGL-4 के साथ जानवरों गंध की एक बिन्दु स्रोत (कृपया ध्यान दें chemotaxis 3 सूचकांक 1 के करीब है चित्रा 2C जिन्हे नगरपालिका इत्यादि स्थानिय संस्थाओ ने अपने प्रबंध मे न लिया हो जानवरों के chemotaxis assays से प्रतिनिधि परिणाम रेखाचित्रित) करने के लिए आकर्षित कर रहे हैं. AWC में परमाणु :: GFP EGL-4 के प्रदर्शन पशु आदत डाल गंध (कृपया ध्यान दें chemotaxis सूचकांक शून्य के करीब है अनुकूलित जानवरों के chemotaxis assays से चित्रा 2E रेखांकन प्रतिनिधि परिणाम) की एक बिन्दु स्रोत नहीं आकर्षित कर रहे हैं. गंध से प्रेरित परमाणु स्थानान्तरण assays से सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा उत्पन्न करने के लिए,प्रयोगों में कम से कम 3 बार और अलग - अलग दिनों पर चलाई जानी चाहिए. Chemotaxis परख के एक विस्तृत वर्णन के लिए यह २४९० अनुच्छेद 14 जौव का उल्लेख करने के लिए उपयोगी हो सकता है.

एक बार 4-EGL AWC न्यूरॉन्स यह AWC फिजियोलॉजी में स्थिर है और लंबे समय तक चलने वाले परिवर्तन का कारण बनता है कि जारी रहती के नाभिक में प्रवेश करती है तब भी जब EGL 4 नाभिक (3 चित्रा) में नहीं रह गया है. 80 मिनट गंध जोखिम जानवरों के बाद आदत डाल (3 चित्रा ऊपरी पैनल, बाईं तरफ प्रकाश पट्टी), गंध और इस अनुकूलन वसूली (3 चित्रा ऊपरी पैनल, सही पर प्रकाश बार) के 120 मिनट के बाद भी जारी रहती है की एक बिन्दु स्रोत की अनदेखी करेंगे. गंध जोखिम GFP के बाद 80 मिनट: EGL-4 AWC के नाभिक (3 चित्रा कम पैनल, बाईं तरफ प्रकाश पट्टी) में मनाया जाता है. इस परमाणु प्रविष्टि दोनों आवश्यक और AWC 5 में लंबी अवधि के अनुकूलन के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है. 120 मिनट वसूली के बाद, इन जानवरों अब कोई परमाणु GFP :: ई प्रदर्शनGL-4 (3 चित्रा कम पैनल, सही पर प्रकाश बार) अभी तक अभी भी आदत डाल गंध benzaldehyde के व्यवहार के स्तर पर एक बिंदु के स्रोत की अनदेखी करेंगे.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रोटोकॉल की लंबी अवधि के परमाणु गंध प्रेरित स्थानान्तरण assays के लिए अवलोकन. सबसे पहले, GFP व्यक्त जानवरों :: EGL 4 (pyIs500 जानवरों) 25 डिग्री सेल्सियस पर एन जी एम OP50 ई. के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों पर खेती की जाती है कोलाई. दूसरे, पशुओं के एक गंध अनुकूलन मिश्रण (प्रायोगिक समूह) या एस बेसल बफर (नियंत्रण समूह) के लिए संपर्क कर रहे हैं. तीसरा, जानवरों आँख बंद करके AWC और AWC में cytoplasmic :: GFP EGL-4 का प्रदर्शन जानवरों की संख्या में परमाणु GFP प्रदर्शन जानवरों की संख्या :: EGL-4 गिनती से रन बनाए हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है चित्रा 6 2B. व्यवहार के स्तर पर, साइटोसोलिक GFP के साथ जानवरों से पहले लंबे समय तक गंध जोखिम, GFP :: EGL 4 AWC की cytosol लिए स्थानीय है. चित्रा 2C. :: AWC में EGL-4 एक खट्टा बात करने के लिए आकर्षित कर रहे हैंगंध के CE. यह ग्राफ जिन्हे नगरपालिका इत्यादि स्थानिय संस्थाओ ने अपने प्रबंध मे न लिया हो जानवरों के chemotaxis assays से प्रतिनिधि परिणाम से उत्पन्न किया गया था. नोट chemotaxis सूचकांक 1 के करीब चित्रा 2 डी के बाद 80 मिनट में गंध जोखिम GFP :: EGL-4 AWC के नाभिक स्थानीय चित्रा 2E. AWC में परमाणु :: GFP EGL-4 के प्रदर्शन पशु नहीं आकर्षित कर रहे हैं. आदत डाल गंध की एक बिन्दु स्रोत. इस ग्राफ अनुकूलित जानवरों के chemotaxis assays से प्रतिनिधि परिणाम से उत्पन्न किया गया. नोट chemotaxis सूचकांक शून्य के करीब है.

चित्रा 3
EGL-4 एक बार 3 चित्रा AWC न्यूरॉन्स यह AWC फिजियोलॉजी में स्थिर है और लंबे समय तक चलने वाले परिवर्तन का कारण बनता है कि जारी रहती के नाभिक में प्रवेश करती है तब भी जब EGL 4 नाभिक में नहीं रह गया है. गंध (80 मिनट) के लिए संपर्क में पशु गंध लंबी अवधि के जोखिम से उबरने के लिए अनुमति दी जाती है और रन के लिए cytoplasmic बनाम परमाणुGFP की स्थानीयकरण :: EGL-4. (ऊपरी पैनल) 120 मिनट वसूली के बाद जानवरों है कि 80 मिनट के लिए गंध से अवगत कराया गया व्यवहार के स्तर पर अभी भी अनुकूलित कर रहे हैं. (लोअर पैनल) 120 मिनट वसूली जानवरों है कि 80 मिनट के लिए गंध से अवगत कराया गया के बाद अब परमाणु :: GFP EGL-4 दिखा रहे हैं. इस प्रकार, परमाणु EGL-4 AWC के फिजियोलॉजी में स्थिर लंबे समय से स्थायी परिवर्तन कि EGL-4 के बाद जारी रहती है invokes नाभिक में नहीं रह गया है. चित्रा ली एट अल 5. से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है चित्रा 3 ऊपरी पैनल. 80 मिनट गंध जोखिम जानवरों के बाद आदत डाल गंध की एक बिन्दु स्रोत की अनदेखी, और इस अनुकूलन वसूली के 120 मिनट के बाद भी बच जाएगा 3 कम पैनल चित्र. बाद गंध जोखिम GFP की 80 मिनट :: EGL-4 AWC के नाभिक में मनाया जाता है. इस परमाणु प्रविष्टि दोनों आवश्यक और AWC में लंबी अवधि के अनुकूलन के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है. 120 मिनट वसूली के बाद, इन जानवरों अब कोई परमाणु GFP प्रदर्शन :: EGL-4 अभी तक अभी भी एक बिंदु sou की अनदेखी करेंगेRCE व्यवहार के स्तर पर आदत डाल गंध benzaldehyde की.

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Discussion

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गंध प्रेरित एक GFP टैग EGL चार अणु परमाणु प्रविष्टि यहाँ वर्णित सी. में घ्राण अनुकूलन का एक मजबूत आणविक readout प्रदान करता है एलिगेंस. गंध से प्रेरित परमाणु स्थानान्तरण assays सीधा कर रहे हैं और तैयारी के समय की केवल कुछ दिनों की आवश्यकता होती है. pyIs500 जानवर है कि हम इन assays के लिए निर्माण किया है, एक मार्कर है कि आंगनवाडी केंद्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन GFP टैग प्रोटीन EGL-4 व्यक्त illuminates व्यक्त करता है. इस प्रकार, हमें लगता है कि कोई न्यूरॉन के इस वर्ग के साथ काम करने का अनुभव करने के लिए थोड़ा के साथ एक experimenter बहुत तेजी से (शायद कुछ दर्जन जानवरों की जांच करने के बाद) को सहज महसूस करने के लिए सही है और परमाणु बनाम cytoplasmic EGL-4 के लिए सेल स्कोरिंग की पहचान शुरू कर सकते हैं. यह उपयोगी हो सकता है के लिए पाठक के लिए 835 लेख है कि सी में GFP विश्लेषण का वर्णन जौव उल्लेख करने के लिए हो सकता है 15 एलिगेंस.

यह सुनिश्चित करने के लिए कि डेटा उत्पन्न उच्चतम गुणवत्ता की है हम निम्नलिखित दिशानिर्देशों का सुझाव देते हैं:1) सभी स्कोरिंग आँख बंद करके किया जा चाहिए;) 2 खेती संदूषण (कवक या बैक्टीरिया) के किसी भी ट्रेस युक्त प्लेटों प्रयोग किया जाता जा नहीं सकते हैं, 3) कीड़े कि खेती के दौरान अनुभवी भुखमरी प्रयोग किया जाता जा कभी नहीं करना चाहिए, और 4) अनुकूलन घोला जा सकता है ताजा पर बनाया जा चाहिए प्रयोग के दिन.

सभी संवेदी प्रणाली neuronal plasticity के उदाहरण दिखा रहे हैं. संकेतों के नाभिक को प्रसारण neuronal plasticity 16 के स्थिर रूपों की एक उच्च संरक्षित सुविधा है. घ्राण plasticity के आणविक readout है कि प्रेरित न्यूरॉन्स में एक PKG के एक परमाणु स्थानान्तरण का प्रतिनिधित्व करता है विकसित करके, हम vivo मॉडल में एक के भीतर neuronal plasticity के तेजी से और विस्तृत विच्छेदन के लिए एक मंच प्रदान करते हैं. का प्रयोग हमारे घ्राण अनुकूलन के आणविक readout हम घटनाओं कि सी में घ्राण अनुकूलन आकार के कुछ का वर्णन करने के लिए शुरू कर दिया है 5,6,7 एलिगेंस. हालांकि, यह सिर्फ एक शुरुआत है, और एक के एक समारोह के रूप में इस प्रक्रिया का अध्ययन करकेजीई, सेक्स, संक्रमण या आहार हम सर्किट और सिस्टम स्तर पर neuronal plasticity के महत्वपूर्ण विषयों को उजागर कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के सावधान पढ़ने के लिए स्कॉट हैमिल्टन, और O'Halloran प्रयोगशाला के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. हम भी हमारे गुमनाम समीक्षक उत्कृष्ट सुझाव और insightful टिप्पणियों के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM plates
Sodium Chloride Fisher Chemical S671-10 NGM plates
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer and NGM plates
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer and NGM plates
Kimwipes - Small Kimberly-Clark LS2770
Ethanol 100% Gold Shield Chemical Co. 43196-115 diluting odors for chemotaxis assays
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C8106-500G NGM plates
Magnesium Sulphate MP Biomedicals 150136-500G NGM plates
Sodium Azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthetic
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose pads
Benzaldehyde Sigma-Aldrich B1334-100G AWC odor
Butanone, ACS Grade Sigma-Aldrich 360473-500ML AWC odor
Microcentrifuge Tubes - 1.5 ml Colored Denville LS8147
Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4" Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV integration
Filter Vacuum Bottle - 500 ml Nalgene 09-740-25B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, (4), 803 (1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4, (2), 179 (1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74, (3), 515 (1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
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लंबी अवधि में घ्राण अनुकूलन के एक आणविक Readout<em&gt; सी. एलिगेंस</em
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He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).More

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).

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