Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati doi: 10.3791/4443 Published: December 22, 2012

Summary

Burada uzun süreli koku adaptasyon moleküler okuma tarif

Abstract

Sürekli stimülasyon sırasında çoğu duyusal nöronlar sinyal onların hassasiyetini azaltarak tepki adapte olacaktır. Adaptasyon yanıtı şekli dikkatini yardımcı olur ve aynı zamanda aşırı uyarılması hücreleri korur. C. koku devre içerisinde İntibak elegans ilk Colbert ve Bargmann 1,2 tarafından tanımlanmıştır. Burada, yazarlar Amphid Kanat hücreleri tip C (AWC) duyusal nöronlar tarafından algılanan uçucu kokuları uyum yeteneklerini mutantlar kusurlu yalıtmak için genetik bir ekran tasarımı için kullanılan koku adaptasyon paradigma, parametreleri tanımlanır. Zaman yabani-tip C. elegans hayvanlar da koku onların yanıt uyum 30 dakika için çekici bir AWC-algılanan koku 3 maruz kalır ve daha sonra ~ 1 saat boyunca bir kemotaksis davranış tahlilinde adapte koku göz ardı eder. Zaman yabani-tip C. elegans hayvanlar daha sonra ac adapte koku yok sayacaktır ~ 1 saat için cazip bir AWC-algılanan koku maruz~ 3 saat hemotaxis davranış testi. C. koku adaptasyon Bu iki faz elegans kısa vadeli olfaktör adaptasyon (30 dak koku maruz kaldıktan sonra tetiklenen), ve uzun vadeli olfaktör adaptasyon (60 dk koku maruziyet sonrası uyarılan) olarak tanımlanmıştır. Daha sonra L'Etoile ark. Çalışmak, 4 AWC nöronlarda kısa vadeli ve uzun vadeli olfaktör adaptasyon hem de gereklidir EGL-4 denilen bir protein kinaz G (PKG) ortaya çıkardı. EGL-4 protein uzun süreli koku uyum yanıtı ancak AWC 4 kısa vadeli olfaktör uyum yanıtı için vazgeçilebilir için gerekli olan bir nükleer lokalizasyon dizisi içerir. Yeşil floresan protein ile etiketleme EGL-4 olarak, bu uzun süreli koku pozlama sırasında AWC yılında EGL-4 lokalizasyonu görselleştirmek için mümkün oldu. Bu tamamen işlevsel kullanarak biz AWC 5 uzun süreli koku adaptasyon moleküler okuma geliştirmek mümkün olmuştur EGL-4 (GFP :: EGL-4) molekülü GFP etiketli. Bu m Kullanmaolfaktör adaptasyon olecular okuması biz AWC 6,7 olarak GFP kusurlu hücre içi lokalizasyonu desenleri :: EGL-4 sergilerler mutant hayvanlar tanımlamak için hem ileri ve geri genetik ekranlar gerçekleştirmek mümkün olmuştur. Burada tarif: GFP 1) İnşaat :: EGL-4 eksprese hayvanlar; 2) uzun süreli koku indüklenen nükleer translokasyon deneyleri için hayvan yetiştiriciliği için protokol ve uzun vadeli koku indüklenen 3) puanlama Nükleer translokasyon olay ve nükleer GFP :: EGL-4 devlet kurtarma (re-sensitizasyon).

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. GFP İnşaat EGL-4 İfade Hayvanlar Etiketli

  1. ODR-3 gen (doğrudan yukan başlama kodonunun kullanımı 2678 bp) promotörü altında translasyonel füzyon GFP :: EGL-4 klonlama: (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. ODR-3 promotör sürücüler amphid nöron çiftleri ifade: AWA; AWB, AWC ve zayıf AKY.
  2. (P) ofm-1: plazmid (p) ODR-3 :: GFP :: 50 yabani-tip (N2) hayvanların içine EGL-4 standart germ-line transformasyon teknikleri 8 kullanılarak ko-enjeksiyon belirteçleri ile ul ng / Inject: : GFP 9 (ul / 25 ng), ve (p) ODR-1 :: DsRed 10 (25 ng / ul). AWC ve AWB amphid nöron çiftleri ODR-1 promotör sürücüler ifade ve coelomocytes yılında ofm-1 promotör sürücüler ifade.
  3. Ultra Violet (UV) / Trimethylpsoralen (TMP) entegrasyon protokole Adım 1.2 'de ayrıntılı ekstrakromozomal diziler ifade transgenik hayvanlar koşuluyla11.
  4. Bleach hayvanlar 12 senkronize ve OP50 E. içeren Nematod Büyüme Medya (NGM) plakalar üzerine onları yetiştirmek L4 sahneye coli. OP50 E. kaldırmak için M9 tamponu ile NGM plakalar kapalı L4 hayvanlar yıkayın coli bakterisinin.
  5. M9 tampon çıkarın ve 30 mikrogram / 1,5 ml mikrosantrifüj tüp solucanı pelet üzerine ml TMP çalışma çözüm 50-100 ul ekleyin. Ortam ışığı bloke ve folyo sarılı 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 15 dakika süreyle bir rotator yavaşça karıştırma folyo 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü sarın. Büyük bir dereceye giremeyen NGM tabağa TMP / solucan çözüm solucanlar aktarın.
  6. Bir Stratalinker 2400 kullanarak UV 350 μJ (X100) NGM tabakta solucanlar Açığa. Sonra bir OP50 içeren NGM plaka solucanlar ekleyin ve 5 saat boyunca karanlıkta inkübe edin.
  7. Yaklaşık 10 numaralı seribaşı tabak (2-5 solucanlar her plaka) 50 transgenik solucanlar seçin. Transferi P0 yeni plakalar için 3 gün boyunca her 24 saat var.
  8. 250 klonal F1 Seçimnimals (plaka başına 1 hayvan). Her F1 plaka 2-4 F2 hayvanları klonlama. Ofm-1 (p) de :: diseksiyon floresan mikroskop altında GFP ifade deseni bakarak% 100 iletim hattı aramak için F3 hayvanları kontrol edin.
  9. Outcross yabani-tip N2 hayvanlar ile nihai entegre hat (lar) 5 kez. Biz pyIs500 olarak nihai entegre hattı bakın ve GFP gibi GFP etiketli EGL-4 molekülünün :: EGL-4 olacaktır.

2. Nükleer Translokasyon Tahliller için Yetiştirme ve Hayvan Bakımı

  1. 25 pyIs500 hayvanlar Yetiştirmek ° OP50 E. ile standart 10 cm NGM plakalar üzerine C (tarifi için aşağıya bakınız) tohumlu coli bakterisinin 13 (Şekil 1).
  2. 1. Günde beş ayrı 10 cm OP50 E. üzerine 25 ekili plakaları 4-5 L4 pyIs500 hayvanlar ° C almak coli 25 plaka ve inkübe seribaşı ° C (yani, plaka başına 4-5 L4 hayvanlar).
  3. 4. Günde, yetişkin p yıkayınS-Bazal tampon kullanarak büyük NGM plakalar kapalı pyIs500 hayvanların opulations (tarifi için aşağıya bakınız). Onlar plastik pipet uçları yan sopa gibi, hayvanlara aktarmak atılabilir cam pipetler kullanın.

3. Uzun vadeli Koku Induced Nükleer Translokasyon Tahliller

  1. PyIs500 hayvanlar bakterileri temizlemek için S-Bazal 3 kez yıkayın. Yıkamalar arasında hayvanlar santrifüj etmeyin; yerine hayvanların sabit bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içinde yerçekimi ile yerleşmek için izin. Bu tüm bakteri kaldırılır sağlamak için kritik olduğunu ve NGM pates kalan bakteriler olumsuz translokasyon testin sonucunu etkileyecek gibi kirlerden arınmış vardır. Ayrıca, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri otoklav tarafı ayrılmamak hayvanların neden olur ve bu nedenle non-otoklavlanmış 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanmak tüpün iç duvarları üzerinde bir "yapışkan" özelliği üretir olduğunu bulduk.
  2. Hayvanlar Yıkamalar arasında ödeyecekseniz ise t makyajO uyum çözüm. 100 ml'lik bir mezun silindir S-Bazal tamponu 100 ml ilave edilir. S-Bazal için koku adapte ekleyin ve Parafilm bir şerit kullanılarak silindir mühür. Butanon adaptasyon S-Bazal 100 ml 2-butaone 11 ul eklemek için benzaldehid adaptasyon, S-Bazal 100 ml benzaldehidin 7.5 ul ilave edin. Halinde icra Yavaşça (sallamayın) içeren mezun silindir S-Bazal ve koku 30 kez bir üniforma emülsiyon oluşturmak için ters.
  3. S-Bazal içinde son yıkamadan sonra, tüm hayvanlara sıvı yerleştirmek ve çıkarmak için izin verir. Etiket bir tüp "+ ve" ya da "uyum" ve diğer boru "-ve" ya da "unadapt". Daha sonra adaptasyon mikrosantrifüj tüpü (+ ve) ile uyum karışımı 1 ml ekleyin ve uyumsuzlar kontrol mikrosantrifüj tüpü (-ve) sonucu, S-Bazal 1 ml ekleyin. Her tüpte 100 ve 200 arasında hayvan sayıları tutmaya çalışın. Bazı uygulama ile, bu gözle bir pelet hayvanların yaklaşık sayısını tahmin etmek mümkündür.
  4. 1,5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı koruyucusu yerleştirinHer bir tüp (haşhaş açık kapaklarını önler) ve 80 dk için bir rotator üzerine tüpleri yerleştirmek için. Biz 60 dk ve 80 dk arasında koku pozlama benzer sonuçlar (uzun dönem uyum yanıtı hem sonucu) verdiğini bulduk. Ancak, 80 dakika maruz elimizde daha tutarlı sonuçlar sağlar. Böylece tüm uzun vadeli uyum testleri 80 dk koku pozlama (Şekil 2) kullanılarak standardize edilmiştir.
  5. 80 dakika sonra, S-Bazal hayvanlar 3 kere yıkayın. Hayvanların her yıkama arasındaki yerçekimi tarafından yerleşmek için izin verin.

4. Kısa vadeli Koku indüklenen Nükleer Translokasyon Tahliller

  1. Kısa süreli koku uyum halinde, ancak bunun yerine 80 dakika için koku adapte pyIs500 hayvanların kuluçka, 30 dakika maruz kalma kullanımı, uzun süreli başına koku indüklenen translokasyon deneyleri (Basamak 3,1-3,4) ile aynı protokol kullanabilir . Aşağıda özetlenen koku indüklenen nükleer translokasyon testlerinin ölçümü (Adım 5) Uzun vadeli ve kısa-ter için aynıdırm poz.

5. Koku bağlı Nükleer Translokasyon Olay Skorlama

  1. DH 2 0 içinde, agaroz jel elektroforezi ile çözülmesi ile 5 mM sodyum azid (NaN3) ihtiva eden% 2 agaroz pedleri edin. Bir cam mikroskop lamı üzerine NaN 3 içeren erimiş agaroz tek bir damla yerleştirin. Hemen erimiş agaroz açılan düzleştirmek için ilk slayttan başka bir cam mikroskop lamı yerleştirin. 30 saniye bekletin ve sonra yavaşça mikroskop ~ 1 mm düz agaroz pad ile bir mikroskop lamı bırakarak slaytlar dışında tease.
  2. S-Bazal finalinde yıkama sonra, solucanlar 1,5 ml mikrosantrifüj tüp yerleşmek ve tüm sıvı kaldırmak için izin verir. Sonra birkaç mikroskop lamı agaroz pabuçlarına açılan bilge hayvanlar ekleyin. Bu 50 ile 100 arasında, slayt başına hayvan sayıları tutmak için önemlidir. Slayt başına çok fazla hayvan puanlama komplike ve genellikle mavi ışık uyarma sonra bir saçılma parlaklık yaratacaktır. Aşırı sıvı olabilirKim-silin küçük kullanılarak agaroz takımından kötülük. Ped üzerine 0,5 mm cam kapak kayma yerleştirin ve hayvanların hareketsiz NaN 3 için izin vermek için 2 dakika bekletin. Not, hayvanlar puanlama sonra slaytlar kurtarılabilir. M9 Tampon bir damla içine numaralı seribaşı NGM tabağa aktarılır eğer hayvanlar ~ 1 saat sonra NaN 3 anestezi kurtarmak olacaktır.
  3. Bu noktada her deneyci slayt deneysel (+ ve) slayt ve hangi slayt (-negatif) slayt kontrolü olan izlemek için bir anahtar bulurlar ve körü körüne GFP atar başka bir kişiye slaytlar geçmek zorunludur: EGL-4 lokalizasyonu deseni. Bu, herhangi bir deneyci önyargı için kontrol edecek.
  4. , 10X 40X ve 63X büyütme hedefleri ve GFP / TTT filtreleri ile dik bir floresan mikroskop kullanılarak slayt başına 50 ile 100 hayvanlar arasındaki Puanını. Öncelikle, parlak alan aydınlatma kullanılarak 10X büyütme altında hayvanları bulun. İkincisi, brigh kapatarak AWC nöron bulunt-alan aydınlatması ve RFP filtre kullanarak. AWB ve AWC nöronlarda (p) ODR-1 :: DsRed sürücüler ifade. Şeklinde küçük ve dairesel AWB hücre gövdeleri (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında AWC nöronlar belirgin oval hücre gövdeleri var.
  5. AWC hücre gövdesi bulunur edildikten sonra, GFP filtresi geçmek ve GFP localisation kaydedin: nükleer veya sitoplazmik olarak EGL-4. Bir sayaç kullanarak deneyci slayt puanlama yaparken mercek bakarak tutmak için izin verir. Not: Adımları 5,1-5,5 istatistiksel olarak önemli verileri (Şekil 1-2) üretmek için iki ayrı günde en az 3 kez tekrarlanır.

6. Uzun vadeli Koku İntibak Kurtarma sırasında EGL-4 GFP etiketli izleme işlemi

  1. Adım 3.5 sonra zaman noktasında sıfır AWC birden alikotları ve nükleer karşı sitoplazmik GFP için skor :: EGL-4 içine pyIs500 hayvanların popülasyonlarının bölün (yani 80 dakika maruz kaldıktan sonra,) ve moklu sonraki zaman noktalarında (Şekil 3).
  2. NGM plakalar üzerine atılabilir cam pipet kullanılarak kontrol (-ve) ve deneysel (+ ve) hayvanlarda hem aktarın.
  3. Hayvanların çeşitli zaman uzunlukları için kurtarmak için bekleyin ve her zaman noktasında GFP :: EGL-4in AWC yeniden değerlendirmek yerelleştirme 5.1 5.5 Adımlar gibi.

7. Malzemeler

NGM plakalar:; 3 g Sodyum Klorür (NaCl); 2,5 g Bacto-pepton 21 g Bacto-Agar: 1 L için 1 L GKD 2 0 ekleyin. Otoklav Medya. Sıcaklık 54 ° C okur otoklav, serin agar sonra kadar , 1 ml 1 M magnezyum sülfat (MgSO4), 1 ml 1 M kalsiyum klorür (CaCl2), etanol içinde 1 ml kolesterol (5 mg / ml stok) 25 ml 1 M potasyum fosfat tamponu: aşağıdaki çözümler ekleyin.

1 M Dibazik K 2 HPO 4 174.2 g / mol: 500 ml için: 400 ml GKD 2 O olarak çözülür 87.1 g Dibasic K 2 HPO 4. GKD 2 O. ile 500 L seviyesini ayarlama 500 ml Steril Filtre Ünitesi kullanılarak sterilize filtreleyin.

1 M mono KH 2 PO 4 136,1 g / mol: 1 L için: 800 ml GKD 2 O olarak, 136.1 g mono KH 2 PO 4 çözülür. GKD 2 O. ile 1 L seviyesini ayarlama 500 ml Steril Filtre Ünitesi kullanılarak sterilize filtreleyin.

1 M Potasyum Fosfat (K 3 PO 4) Tampon pH 6.0: 1 L için: 1 L Steril Filtre Ünitesi, 1 M mono KH 2 PO 4 868 ml ekleyin. Birim süzülmeye bırakın ve daha sonra 1 M Dibazik K 2 HPO 4 132 ml ekleyin. Ünitesi tüm sıvı filtre için izin verin. Filtre ünitesini çıkarın ve 6.0 pH ayarı. Oda sıcaklığında saklayın.

S-Bazal: 1 L için: 50 ml 1M K 3 PO 4 Tampon eklemek, pH ~ 6.0; ve 20 ml 5M NaCl aq. 1 L doldurunGKD 2 O. Çözüm otoklavlayınız.

M9: 3 g KH 2 PO 4, 6 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2 O.: 1 L için GKD 2 0 1 L doldurun. Otoklavda sterilize edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AWC önce ve uzun süreli koku maruz kaldıktan sonra GFP :: EGL-4 inç lokalizasyonu model bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Uzun süreli koku pozlama, GFP :: EGL-4 öncesinde AWC (Şekil 2B) sitoplazmada lokalize edilir ve 80 dakika koku maruz GFP sonra :: EGL-4 AWC (Şekil 2B) çekirdeğinde lokalize edilmektedir. Davranışsal düzeyde, sitozolik GFP :: EGL-4 AWC içinde olan hayvanların koku nokta kaynak (- kemotaksis endeksi 3 1'e yakın olduğunu unutmayınız Şekil 2C uyumsuzlar hayvanların kemotaksis testlerden temsilcisi sonuçlar graphs) çekti. AWC nükleer GFP :: EGL-4 sergileyen Hayvanlar adapte koku (- kemotaksis endeks sıfıra yakın olduğunu unutmayınız adapte hayvanların kemotaksis testlerden Şekil 2E grafikler temsilcisi sonuçlar) bir nokta kaynak için çekici değildir. Koku indüklenen nükleer translokasyon testleri arasında istatistiksel olarak anlamlı veri üretebilmek için,Deneylerin en az 3 defa ve ayrı günde çalıştırılması gerekir. Kemotaksis assay ayrıntılı bir açıklaması için bu makalenin 2490 14 Jove başvurmak yararlı olabilir.

EGL-4 olarak devam AWC fizyolojisi istikrarlı ve uzun süreli değişikliklere neden AWC nöronların çekirdeğine girer kez bile EGL-4 çekirdeği (Şekil 3) artık. 80 dk koku maruz hayvanların sonra adapte koku (Şekil 3 üst panelinde, soldaki ışık bar), ve bu uyum bile kurtarma, 120 dk (Şekil 3 üst panelinde, sağ ışık bar) sonra devam edecek bir nokta kaynak yok sayacaktır. Koku maruz GFP 80 dk sonra: EGL-4 AWC çekirdeğinde (Şekil 3 alt panelinde, soldaki ışık bar) gözlenmektedir. Bu nükleer girdisinin gerekli ve AWC 5 uzun süreli adaptasyon ikna etmek için yeterli hem de. 120 dakika kurtarma sonra, bu hayvanların artık nükleer GFP :: E sergilerlerGL-4 (Şekil 3 alt panelde, sağ ışık bar) henüz hala davranışsal düzeyde adapte koku benzaldehit bir nokta kaynak yok sayacaktır.

Şekil 1
Şekil 1. Uzun vadeli koku indüklenen nükleer translokasyon deneyleri için protokol genel bakış. İlk olarak, GFP ifade eden hayvanlar :: EGL-4 (pyIs500 hayvan) OP50 E. ile tohumlanan NGM plakalar üzerinde 25 ° C'de yetiştirilir coli. İkincisi, hayvanların bir koku adaptasyon karışımı (deney grubu) veya S-Bazal tamponu (kontrol grubu) maruz kalmaktadır. Üçüncü olarak, hayvan ve AWC AWC sitoplazmik GFP :: EGL-4 gösteren hayvan sayısı, nükleer GFP gösteren hayvan sayısı :: EGL-4 sayma ile kör puanlandırılır.

Şekil 2,
Şekil 2. ark izni ile değiştirilir. 6 Şekil 2B. Önce uzun süreli koku pozlama, GFP :: EGL-4 AWC ve sitoplazmada lokalize edilmektedir. Şekil 2C için. Davranışsal düzeyde, hayvanlar sitozolik GFP ile AWC bölgesindeki :: EGL-4 ekşi bir noktaya çektikoku ce. Bu grafik uyumsuzlar hayvanların kemotaksis testlerden temsilcisi sonuçlar elde edilmiştir. Kemotaksisi endeksi 1'e yakın olduğunu. Şekil 2B unutmayın. 80 dk koku maruz GFP sonra :: EGL-4 AWC çekirdeğinde lokalize edilmektedir. Şekil 2E. AWC nükleer GFP :: EGL-4 sergileyen Hayvanlar çekici değil adapte kokusu bir nokta kaynak için. Bu grafik adapte hayvanların kemotaksis testlerden temsilcisi sonuçlar elde edilmiştir. Kemotaksisi endeks sıfıra yakın olduğunu unutmayın.

Şekil 3
Şekil 3. EGL-4 kere devam AWC fizyolojisi istikrarlı ve uzun süreli değişikliklere neden AWC nöronların çekirdeğine girer EGL-4 çekirdeği artık bile. Koku (80 dk) maruz Hayvanlar uzun süreli koku maruz kurtarmak için izin ve için puanlanır sitoplazmik karşı nükleerGFP lokalizasyonu :: EGL-4. (Üst panel), 120 dk çıktıktan sonra, 80 dakika için koku maruz kalan hayvanlar yine davranışsal seviyede uyarlanmıştır. (Alt panel) 80 dk için koku maruz bırakıldı 120 dakika sonra, hayvanlar iyileşme artık nükleer GFP :: EGL-4 sergilerler. Böylece, nükleer EGL-4 EGL-4 sonra devam AWC fizyolojisi stabil uzun ömürlü değişiklikleri çağırır çekirdeği artık. Şekil Lee ve ark. 5 izni ile değiştirilir. Şekil 3 üst paneli. 80 dk koku maruz hayvanların sonra adapte kokusu bir nokta kaynak görmezden gelir ve bu uyum bile kurtarma, 120 dk sonrasında devam edecek. Şekil 3 alt paneli. Koku maruz GFP 80 dk :: EGL-4 AWC çekirdeğinde tespit edildikten sonra. Bu nükleer girdisinin gerekli ve AWC uzun süreli adaptasyon ikna etmek için yeterli hem de. 120 dakika kurtarma sonra, bu hayvanların artık nükleer GFP sergileyen :: EGL-4 henüz hala bir noktaya sou göz ardı ederdavranışsal düzeyde uyum koku benzaldehidin RCE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir GFP etiketli EGL-4 molekülünün koku indüklenen nükleer girdisinin burada açıklanan C. olfaktör uyum sağlam bir moleküler okunmasını sağlar elegans. Koku indüklenen nükleer translokasyon testleri basittir ve hazırlık süresi sadece birkaç gün gerektirir. Bu deneyleri için yapılmış olduğu pyIs500 hayvan, AWC nöron hem de GFP-etiketli EGL-4 proteini ifade aydınlatan bir işaretleyici ifade eder. Böylece, nöron bu sınıf ile çalışan hiçbir deneyimi az olan bir deneyci çok hızlı (belki de bir kaç düzine hayvan inceledikten sonra) nükleer karşı sitoplazmik EGL-4 için doğru hücre ve puanlama tespit rahat hissetmeye başlarsınız hissediyorum. Okuyucu C. GFP analizini açıklar makale 835 Jove başvurmak için bu yararlı olabilir elegans 15.

Üretilen verilerin en yüksek kalitede olmasını sağlamak için biz aşağıdaki yönergeleri öneririz:1) Tüm puanlama körlemesine yapılmalıdır; 2) kontaminasyon (fungal veya bakteriyel) HERHANGİ eser içeren ekimi plakaları kullanılamaz; 3) ekimi sırasında deneyimli açlıktan asla kullanılmamalıdır, solucanların ve 4) uyum karışımları taze yapılmalıdır deney günü.

Tüm duyu sistemleri nöronal plastisite örneklerini sergilerler. Çekirdeğine sinyallerin iletimi nöronal plastisite 16, kararlı formları yüksek oranda korunmuş bir özelliktir. Uyarılan nöron bir PKG bir nükleer translokasyonu temsil olfaktör plastisite moleküler okuma geliştirerek vivo modelde bir mesafede nöronal plastisite hızlı ve ayrıntılı diseksiyon için bir platform sağlar. Olfaktör adaptasyon bizim moleküler okuması kullanarak biz C. koku adaptasyon şekillendiren olayların bazı açıklamak başladı elegans 5,6,7. Bununla birlikte, bu sadece bir başlangıç ​​ve bir fonksiyonu olarak bu işlem inceleyerekge, cinsiyet, enfeksiyon veya diyet biz devre ve sistemler düzeyinde nöronal plastisite önemli temaları ortaya koyuyor olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz bu yazıda dikkatli okumak için Scott Hamilton ve O'Halloran laboratuar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Biz de mükemmel öneriler ve anlayışlı yorum için anonim yorumcusu ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 NGM plates
Sodium Chloride Fisher Chemical S671-10 NGM plates
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Chemical S375-500 S-Basal buffer and NGM plates
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Chemical P285-500 S-Basal buffer and NGM plates
Kimwipes - Small Kimberly-Clark LS2770
Ethanol 100% Gold Shield Chemical Co. 43196-115 diluting odors for chemotaxis assays
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C8106-500G NGM plates
Magnesium Sulphate MP Biomedicals 150136-500G NGM plates
Sodium Azide 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthetic
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Agarose pads
Benzaldehyde Sigma-Aldrich B1334-100G AWC odor
Butanone, ACS Grade Sigma-Aldrich 360473-500ML AWC odor
Microcentrifuge Tubes - 1.5 ml Colored Denville LS8147
Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4" Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 UV integration
Filter Vacuum Bottle - 500 ml Nalgene 09-740-25B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, (4), 803 (1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4, (2), 179 (1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74, (3), 515 (1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107, (13), 6016 (2010).
  6. O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5, (12), e1000761 (2009).
  7. O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, (2), e31614 (2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
  10. L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25, (3), 575 (2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71 (1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, (1432), 757 (2003).
Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).More

He, C., Lee, J. I., L'Etoile, N., O'Halloran, D. A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans. J. Vis. Exp. (70), e4443, doi:10.3791/4443 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter