Summary
개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.
Abstract
배의 세포를 모두 추적 계보 (Lineage)로 구성 운명의지도는 조직이 배의 각 셀에서 내려 어떤 알 수있다. 운명의지도 기관의 전구체를 식별와 후손 세포가 정상적인 배아에서 해당 기관을 채우는 것들로부터 발달 경로를 elucidating 매우 유용하지만, 그들은 전구체 세포의 전체 발달 가능성을 설명하거나 메커니즘을 식별되지 않는로 운명이 결정됩니다. 세포 운명의 노력에 대해 테스트하려면, 하나는 실험 조작 한 후 표현들과 함께 그대로 배아 (운명의지도)에 자손의 세포의 일반적인 레퍼토리를 비교합니다. 세포의 운명은 주변 세포 환경에 관계없이 (커밋) 고정, 또는 이웃에 의해 제공 외부 요인에 의해 그 영향을 받는가? Xenopus의 배아의 종합 운명지도를 사용하여, 우리는 확인하는 방법에 대해 설명합니다, 격리 및 문화 단일 절단 단계의 전구체, blasto라고meres. 이 방법은 하나가 이러한 초기 세포가 그들의 이웃 세포와의 상호 작용이 필요 손상 배아에서 자신의 정상적인 환경에서 획득 운명에 최선을 다하고 있습니다, 또는 신호의 다른 유형에 노출하는 경우 다른 운명을 표현하는 영향을 할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.
Introduction
Xenopus laevis의 배아들은 달걀 microsurgical 접근 방식을 허용 할 수있을만큼 크기 때문에 배아 세포가 특정 운명을 취득하는하여 메커니즘을 식별 할 수 광범위하게 활용되었습니다. 각 셀은 고유 에너지 저장소를 제공 난황의 혈소판의 풍부한 세포 공급을 포함되어 있기 때문에 또한, 그들은 문화 매체의 영양 보완 필요없이 외부 개발할 수 있습니다. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - 세포의 운명이 결정되는이 메커니즘을 연구하는 중요한 자산이 (32 세포 단계를 통해 2) 절단 단계의 blastomeres의 운명지도의 종합 세트입니다. 이지도는 하나의 식별 blastomere으로 감지 분자를 microinjecting와 조직이 표시 자손에 의해 채워하는 후 개발의 모니터링에 의해 구축되었다. 배아의 추기경 축 안정적으로 많은 엠브리에서 확인 할 수 있기 때문에 일관성있는 운명의지도는 가능합니다OS. 식물 반구이 아닌 반면, 첫째, 모든 야생를 입력 배아에 동물 반구는 색소입니다. 둘째, 기름지게에서 정자의 항목은 미래 복부 편으로 동물 반구의 착색의 수축을 초래, 많은 배아에 착색 차이 따라서 등쪽과 복부 측면 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 셋째, 첫 번째 절단의 고랑 따라서 중간 시상 대부분의 배아에서 비행기, 그리고는 배의 오른쪽과 왼쪽 측면을 식별하는 데 사용할 수 있습니다 대략. 운명의지도는 자연스럽게 태아의 큰 인구에서 각 blastomere는 식별 할 일반 패턴에 알이 자주 다니엘 수정 된 사실에 의존하고 있습니다. 설명 내의 선택 절차를 사용하여 착색 및 절단 패턴에 대한 알 클러치 사이에 다양성이있는 반면 여기에서 소정의 운명과 셀이 90 %의 정확도로 식별 할 수 있습니다.
세포 운명은 방지 할 수 있습니다여러 메커니즘에 의해 embryogenesis 동안 채굴. 이러한 differentially 상속 세포질 mRNAs이나 단백질 등의 고유 요소는, 초기 패턴의 여러 측면에 기여합니다. 예를 들어, 특정 산모 mRNAs는 세포, 세균 라인에 기여 endoderm가, 또는 등쪽 몸 축 (7 검토)에 기여를 결정합니다. 태아의 신호 센터에서 더 많은 먼 이웃 셀이나이 지역에서 제공하는 외부 요인이 특정 조직 유형과 패턴 거의 모든 기관이 시스템을 유도 할 책임이 있습니다. 신호 센터의 예는 신경 외배엽 및 패턴 중배엽을 유도 gastrula의 주최자 / 노드 및 활동을 편광의 영역을 포함 사지 꽃 봉오리의 패턴 앞 - 뒤 축이. 운명의지도 다른 기관의 전구체를 확인하고 정상 배아에서 자신의 자손에 의해 촬영 발달 경로를 보여 있지만, 그들은 고유 구별 할 수 없습니다그리고 그 세포에 외부 영향을 미친다. 또한 자손 배의 복잡한 신호 환경에서 차별화 셀의 전체 발달 가능성을 공개하지 않습니다. 에 문화 다음 배아에서 세포의 제거 또는 2) 소설의 배아의 위치 1) 세포의 이식을 : 두 실험 방법은 셀의 운명은 고유 요인에 의해 결정됩니다 또는 이후 외부 요인에 의해 영향을 여부를 테스트 할 수 있습니다 외인성 신호의 부재.
세포가 수동으로 분리 될만큼 크기 때문에 두 실험 방법이 Xenopus에 가능했습니다. 예를 들어, 다수의 연구 (7 검토, 8, 9) 운명의 변화를 테스트하기 위해 호스트 배아의 소설 위치에 배아 (세포 세포 상호 작용을 변경하려면) 또는 이식 세포에서 단일 세포를 삭제했습니다. 또한, 배의 다른 지역에서 세포의 작은 번호를 explanting의 두 번째 접근법 전Xenopus의 배아의 세포가 세포 내 영양소 저장, 난황의 혈소판으로 가득하기 때문에 외인성 요인의 부재에 유도 조직 상호 작용을 명료하게하다하는 n 인물 문화이 가능합니다. 따라서, 그들은 문화 매체의 영양이나 성장 인자 보완없이 정의 된 소금 매체에서 몇 일 동안 배양 할 수 있습니다. 우리는 등쪽 동물 blastomeres가 maternally 상속 mRNAs 10, 11로 인해 신경과 등쪽 mesodermal 조직을 생성 할 수있는 자율적 인 능력을 가지고 있으며, 다른 32 셀 blastomeres의 중배엽 사양이 고유 및 외부 정보를 12 두에 의존했다 표시하려면이 방법을 사용했습니다 . explants 등의 배양 세포의 장점은 중간도 explanted 셀 12, 13, 14의 운명에 영향을 미칠 수있는 휴대 전화 통신 경로를 결정하기 위해 정의 된 신호 요소를 보완 할 수 있다는 것입니다. 또한, 하나는 blastomere 홍보를 삽입 할 수 있습니다내생 mRNAs의 번역을 방지하기 위해 오버 명시 적 유전자, 또는 안티 센스 oligonucleotides와에 mRNA와 문화 ior. 이, 이득과 손실 기능 분석은 분자가 자율적으로 표현 운명에 필요한되는 식별 할 수 있습니다. explant의 운명을 분석하려면 특정 세포 유형의 식별은 표준 유전자 발현 (예를 들어, 현장 하이브리드 화에 RT-PCR)과 immunocytochemical assays에 의해 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아 세포는 특정 조직에 개발 방법을 규제 고유 및 외부 메커니즘을 구별 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 악기, 문화 미디어와 요리 준비
- 알루미나 연마 필름을 사용하여 네 포셉을 선명하게. 팁 크기를 모니터링 할 수있는 해부 현미경으로이 작업을 수행합니다. 포셉 중 하나 쌍은 백업 경우에는 팁이 절차를 수행하는 동안 손상된 역할을합니다. 네 개의 집게를 압력솥과 멸균 용기에 보관하십시오.
- 및 필터 소독, 500 ML 0.1X와 1.0X 문화 매체의 각 (15 조리법 중 마크의 수정일 Ringers는 [MMR] 또는 수정일 바스의 식염 [MBS])가합니다. 우리는 정기적으로 MBS를 (; 1 ㎜ KCl, 0.7 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 5 밀리미터 HEPES [산도 7.8], 2.5 MM NaHCO 3 1X = 88 MM NaCl)을 사용합니다. 개월 동안 14-18 ° C에서 저장합니다.
- 문화 매체 (나사 캡 유리 병에 100 ML 1X 문화 매체에 2g 전기 등급 아가로 오스)의 2 % 아가로 오스 솔루션을 확인하십시오. 아가로 오스를 해산하기 위해 압력솥. 이것은 달 동안 4 ° C에 저장하고,이 다음에 필요할 때 아가로 오스를 녹일 수있는 microwaved 할 수 있습니다.
- 아가로 오스는 액체이지만, 멸균 24도 문화 판의 각 우물의 바닥에 약 0.5 ML를 따르다. 이 플라스틱에 고집에서 explants를 방지 할 수 있습니다.
- 아가로 오스는 액체이지만, 2-3 60mm 배양 접시의 바닥에 2-3 ML을 흘려, 그리고 소용돌이 부드럽게 바닥 적용되어 있는지 확인합니다. 이러한 분해 요리로 봉사하고 세포막이 제거되면 아가로 오스는 플라스틱으로 고집에서 배아를 방지 할 수 있습니다.
- 아가로 오스는 냉각과 경화되면 불꽃은 6 "파스퇴르 피펫의 팁은 공에 녹아 있으며, 가볍게 문화 판의 각 잘에있는 아가로 오스의 표면에 터치까지.이 얕은 우울증 만들어집니다로 explant가 배치됩니다.
- 1X 멸균 문화 매체와 문화 판의 각 우물을 입력합니다.
- 아가로 오스는 냉각과 경화되면, blastomere 분리를 촉진하기 위해 희석 문화 매체 (0.1X MMR 또는 0.1X MBS)로 분해 요리를 채 웁니다.
2. 태아의 선택
- 수정 된 알을 얻고 표준 프로토콜 15에 따라 젤리 코트를 제거합니다. 100mm 배양 접시에 0.5X 문화 매체로 전송할 수 있습니다.
- 배아는 2 셀 단계에 도달하면, 첫 번째 절단의 고랑가 별도의 그릇에 동물 반구에서 가볍게 색소 영역 (그림 1)을 양분하는 사람들을 정렬합니다. 다음은 explants의 기증자 될 것입니다. explants을 시작할 수있는 단계 형제 제어 역할을 할 수있는 절차를 통해 기증 배아 옆에 별도의 접시에 나머지 2 세포 배아세요.
3. Explants의 작성
- 분해 접시에 5-10 배아를 놓고 있지만, 한 번에 하나의 배아에서 작동합니다.
- 투명 vitelline 막을 볼 수 있도록 최초의 배아를 배치, 그것은 배의 동물 극의 표면 위에 투명한 공간 (perivitelline 공간)로 구분합니다. 날카롭게 힘을 사용사람의 subdominant 손 (하나가 바로 전달하는 경우 왼쪽)에 PS, perivitelline 공간 위의 vitelline 멤브레인을 파악. 다른 손에 날카롭게 집게를 사용하여 첫 번째 포셉 팁에 가까운 멤브레인을 파악하고, 부드럽게 거리에 막 껍질을 벗기면에 반대 방향으로 당긴다. 대상 셀이 막 제거하는 동안 손상되지 않도록, 해부하는 셀에서 거리의 초기 이해하십시오. 하나는 배아가 결합한 것 때문에 멤브레인가 제거되었음을 알 수 있습니다.
- subdominant 손에 포셉와 하나 이웃 셀을 잡아 해부 할 수있는 셀이 직접 접촉하지 않도록하는 "핸들"로 셀을 사용합니다. 다른 손에 포셉으로 부드럽게 원하는 blastomere에서 떨어져 남아있는 이웃 세포를 당긴다. 같은 운명을 공유하는 중간 선 세포, 타겟팅하는 경우, 그들은 한 쌍으로 함께 제거 할 수 있습니다. 마지막으로, "핸들"셀을 멀리 해부.
- 살균과 blastomere (또는 blastomere 쌍), 픽업, 유리 파스퇴르 피펫, 기포 및 과도한 흡입을 피. 피펫은 세포가 손상 될 수 있습니다 날카로운 모서리를 제거 할 수 화재 연마 될 수 있지만, 우리는 정기적으로이 작업을 수행하지 않습니다. explant 문화 요리의 잘의 문화 매체의 표면 아래에있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫의 팁을 놓고, 가볍게 blastomere을 배출. 이 중력에 의해 얕은 우울증으로 밀어해야합니다. 하나 이상의 배아에서 같은 blastomere은 단일 explant로 결합 할 수 있습니다.
- 분해 요리, 하나 하나에 남아있는 배아와이 절차를 반복합니다. 10 배아에 대한 후, 해부 접시는 세포 부스러기로 가득합니다. 이 문제가 발생하면, 새로운 절개 요리로 변경합니다.
- 모든 dissections 완료 후 explants가 얕은 우울증에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 부드럽게 건조 70 % 에탄올과 공기 살균 된 헤어 루프와 함께 우울증에 밀려 할 수 있습니다.
- 지난 해부 한 후 한 시간 정도, 파편 surrou를 제거살균, 유리 파스퇴르 피펫으로 치료 explants를 nding.
- 14-20의 문화 explants의 판을 ° C 형제, 컨트롤 배아를 포함하는 페트리 접시 옆에. 형제 자매 배아는 blastomere explants의 개발 단계를 나타냅니다.
4. 분석을위한 수확 Explants
- 형제 자매가 원하는 발달 단계에 도달 할 때 explants를 수확. 세포의 일부가 붕괴하는 경우에도 이러한 explants 아주 잘 남아있다. 문화의 구름 덩어리가 잘있을 경우 따라서, 건강 explant가 내 매장되어 있는지 확인 할 수있는 헤어 루프 나 집게로 탐험 해보세요.
- 유리 파스퇴르 피펫과 문화 솔루션의 작은 볼륨에서 explants를 선택하고, 부드럽게 실시 할 수있는 분석에 적합한 정착액 또는 용해 버퍼에 넣어 배출.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
정확하게 세포의 발달 잠재력을 평가하는이 분석의 능력 운명에지도 1, 2, 3, 4, 5, 6을 기반으로 올바른 blastomere을 해부에 의존하고 있습니다. 따라서 이후 그림 2에 도시, 정기적으로 절단 패턴을 준수 그림 1에 도시 된 바와 같이, 2 셀 단계에서 올바른 착색 패턴 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 하나가 필요한 절단 단계에 도달로 정렬 배아를 관찰하고 불규칙 cleavages을 보여 배아를 분리하는 경우, 정확성이 크게 향상됩니다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 일반 cleavages는 주로 배의 한쪽에 발생합니다. 기증 셀 '일반'편에서 유래하는 경우 이러한 배아는 기증자으로 사용할 수 있습니다. 당신이 해부하고자하는대로 정기적으로 절단 패턴은 많은 배아 등 5 회 정도 세포 분열 진행, 정렬 등의 적은 배아에서 발견되기 때문에. 당연히 Fertilized 알은 체외 수정 된 달걀보다 더 정기적으로 cleavages을 가지고 경향이 있습니다. 절단 패턴 계란의 단일 클러치에서 큰 거래를 다양하지만, 하나는 적어도 10~20%는 이런 종류의 조작에 유용 할 것으로 예상 할 수 있습니다.
Blastomeres은 혼자 또는 소규모 그룹에 배양 할 수 있습니다. blastomeres가 처음 (그림 3A) 해부, 잘 문화 (그림 3B, C)으로 전송됩니다 때, 부드럽고 연약한 있습니다. 우리의 경험에서, 동물과 적도 blastomeres는 식물 blastomeres (그림 3C)보다 훨씬 해부하기 쉬운 문화입니다. 그들은 작은 아마도 때문에, 그들은 이전보다 쉽게합니다. 또한 포셉으로 가면서 때 더 빨리 치유 할 것 같습니다. 식물 세포는 종종 해부하는 경우가 더 많은 "새는"하고, 더 느리게하므로 cytokinesis을 완료 자매 세포와 세포질 다리를 유지하는 것, 그들의 세포막 손상에 더 연약한하고 쉽습니다.문화의 1-2에 대한 시간 후, explanted blastomere (들) 4 회 정도 나누어 손상된 주변 세포 (그림 3D)에서 남아있는 파편의 대부분을 벗겨진 것입니다. 20 시간 후에는 세포의 작은 튼튼한 공을 (그림 3E) 형성하고 있습니다. 일부 파편에 묻혀 될 수 있지만, 종종 건강 질량 (그림 3E, 왼쪽) 찾을 수 있습니다.
explants가 작기는하지만, 그들은 나중에 유전자 발현을 모니터링 할 수 있습니다 원위치 하이브리드뿐만 아니라, 더 일반적으로 사용되는 동물 캡 explants에 대한 처리를 생존. 그림 4A에 도시 된 실험에서 두 개의 등쪽 blastomeres (D1.1) 또는 두 개의 복부 blastomeres (V1.1)은 16 세포 단계에서 해부 된 14에서 1X MBS의 양식 ° C 형제 배아는 초기 신경 판 단계에 도달 할 때까지 (st12-13, 박리 한 후 20-22에 대해 시간). 각 샘플은 접합자의 신경 판 유전자 (sox2의 표현에 대한 assayed되었다 </ em>)를 원위치 하이브리드 화에 의한 (파란색 반응 생성물). 이 분석은 신경 접시의 전구체 아르 등쪽 동물 blastomeres, 대부분이 배의 다른 지역에서 추가 신호없이, 즉, 자율적으로 sox2를 표현할 수 있다는 설명합니다. sox2을 표현하지 않는 explants가 잘못 절개시 확인되었을 수 있습니다. 반대로, 복부 표피, 익스프레스 sox2의 전구체있는 복부 동물 blastomeres, 그건. 따라서, 우리는 복부 동물 blastomeres 안 반면 등쪽 동물 blastomere는 신경 조직을 형성 할 수있는 고유 능력을 가지고 있다는 결론. 참고 그 D1.1 explants의 일부는 또한 등쪽 중배엽 형성을 나타내는 형태와 eIongated 한,이 blastomeres도 그대로 배아 3 notochord를 형성 할 운명이며, explant 문화 Express에서 notochord 표시 단백질 10. Blastomere 고유 운명은 altere 할 수 있습니다 이전 mRNAs의 microinjection (이득의 기능) 또는 안티 센스 morpholino의 oligonucleotides (; 손실 기능 수법의 살인)로 D. 그림 4B에서 maternally 표현 신경 유전자 foxD5 16, 17의 내생 수준을 변경의 효과가 테스트됩니다. FoxD5의 내생 수준 V1.1 (아래 행)의 8 셀 전구체 blastomeres에 foxD5 mRNAs를 주입 증가되었을 때, V1.1의 explants의 대부분 (ST 12-13로 배양)는 sox2을 표명했다. 반대로, FoxD5의 내생 레벨이 D1.1 (맨 위에)의 8 셀 전구체 blastomeres에 수법의 살인의 주입에 의해 감소했을 때, D1.1 몇 explants이 (ST 12-13로 배양) sox2을 (비교 표현 그림 4A 상단 행). 이 실험 foxD5의 모성 표현은 신경 운명을 취득 할 수 등쪽 blastomeres의 고유 능력에 역할을 나타냅니다.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "ALT ="그림 1 "/>
그림 1. 자연적으로 수정 된 계란에서 2 세포 배아의 착색 패턴. 첫 번째 절단의 고랑은 화살표로 표시됩니다. A) 배의 동물 반구의 불 색소 영역이 한 셀 (왼쪽)에 대부분 포함되어 있기 때문에 나중에 단계에서 blastomeres를 식별하는 데 사용할 수 없습니다 배아의 예. 첫 번째 절단의 고랑은 배의 중간 시상면을 예측할 수 있기 때문에,이 배의 불 색소 지역은 등쪽 식별하지 않습니다. B) 배아의 두 가지 예로는 해당 explant 문화에 대해 정렬해야합니다. 모두에서 동물 반구 (*)의 불 색소 지역은 첫 번째 절단의 고랑에 의해 bisected입니다. 왼쪽에있는 난자는 첫 번째 셀주기의 초기에 있으며, 가볍게 색소 영역은 세포 표면의 약 25 %에서만 볼 수 있습니다. 오른쪽에있는 배아는 첫 번째 세포주기의 끝을 근접하고 있으며, 색소 VE로 이동했습니다ntrally 그래서 두 셀의 등 절반은 라이터입니다. 결과적으로, 나중에 단계에서 가볍게 색소 동물 세포는 등쪽 (D)를 예측하고 어둡게 색소 동물 세포는 (V) 복부 예측됩니다.
그림 2. 자연적으로 수정 된 계란에서 절단 단계의 배아의 예. 모든 배아는 위로 등쪽의 독자를 직면 동물 극과 지향합니다. A) 4 세포 배아. 절단이 얕은 아르 고랑 수 있도록 왼쪽에있는 배아는 두 번째 세포주기를 입력했습니다. 절단이 깊은이며 세포가 더 둥근 표시 고랑 수 있도록 오른쪽에있는 태아는 거의 두 번째 세포주기를 완료했습니다. 블랙 화살표는 첫 번째 절단의 고랑로 연결하고, 빨간색 화살표는 두 번째 절단 패인를 가리 킵니다. B) 8 세포 배아. 왼쪽에있는 난자는 초기 세 번째 세포주기입니다 그리고 오른쪽에있는 배 가까이세 번째 세포주기의 끝. C) 16 세포 배아. C '는 피해야 할 최악의 cleavages의 예입니다. C는 "복부 측면에 일반 cleavages의 예이지만, 등쪽면에 불규칙. C '는'등쪽면에 더 많은 일반 cleavages의 예입니다,하지만 복부 옆에 있습니다. C ''이 한 예입니다 중간 선에서 일반 cleavages의,하지만 측면. D) 32 세포 배아. D '는 복부 측면에 일반 cleavages의 예이지만, 등쪽면에 불규칙. D'는 등쪽에 일반 cleavages의 예입니다 사이드 아니라 복부 쪽. D '는'오른쪽에있는 일반 cleavages의 예이지만, 왼쪽에 대한 자세한 불규칙 cleavages. E) 64 세포 배.이 단계의 개략도를 들어, 참조하시기 바랍니다 (온라인에서 찾을 수 있습니다 Nieuwkoop와 페이버 준비 시리즈, http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
그림 3. 자연적으로 수정 된 계란에서 16 세포 배아에서 Explants. 곧 절개 후 A) 복부 동물 blastomere. 화살표는 "핸들"셀의 잔해를 나타냅니다. B) A 복부 동물 blastomere 번 나누어 한 문화도로 전학 왔어. 곧 절개 후 C) A 복부 식물 blastomere. 동물 blastomeres에 비해이 더 큰, 그리고 조작이 더 어렵습니다. D) 2 복부 동물 blastomere의 explants, 절개 후 2 시간은 네 번에 나누어 있습니다. 왼쪽 explant는 blastomere의 원본, 색소 외부 표면에서 볼, 오른쪽 explant는 blastomere의 원본, unpigmented 내부 표면에서 볼 수 있습니다. E) 두 복부 동물 blastomere의 explants는 24 시간에 배양 하였다. 오른쪽 explant 어떤 암설은 무료입니다 반면 왼쪽 explant 세포 파편 (화살표)의 침대에 앉아있다. 모든 이미지는 50X magnificat에 있습니다이온.
그림 4. 자연적으로 수정 된 달걀을 분석하던 16 셀 blastomeres에서 파생 explants의 유전자 표현의 현장 하이브리드 화 분석에서이. A. 왼쪽에있는 16 셀 배에 결과를 explanted 된 등쪽 blastomere 쌍 (D1.1)를 보여줍니다 맨 위 행과 아래 행에있는 결과를 explanted 된 복부 blastomere 쌍 (V1.1). uninjected 배아에서 해부하는 blastomere 쌍은 문화 우물에서 0.1X MBS에 배치하고 20 시간을위한 14 ° C에서 incubated되었습니다. 그들은 정착액의 튜브에 수집 접합자의 신경 유전자 sox2의 표현 원위치 하이브리드 화에 의해 처리. 8 세포 단계 배아의 B.의 Blastomeres는 양자 중 주입 된 한복부 blastomeres에 내생 표현을 높이기 위해 등쪽 blastomeres, 또는 foxD5 mRNA와 내생 표현을 줄이기 위해 foxD5 수법의 살인과. 주입 배아는 16 셀 단계 (20-30 분 이상을)에 도달하면 blastomere 쌍은에서와 같이 원위치 하이브리드 화에 의해 해부 배양하고 분석 하였다. 명시 sox2이 크게 foxD5 수법의 살인 (A에서 맨 위에 비교)로 주입 된 D1.1 explants에서 감소되는 explants의 수입니다. 명시 sox2이 크게 foxD5 mRNA (A의 아래 행에 비교)로 주입 된 V1.1의 explants 증가되는 explants의 수는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
개인 blastomeres 성공적으로 배양하기위한 가장 중요한 단계는 1) 제대로 관심 blastomere 식별, 필요한 매뉴얼을 개발하고 4), 살균, 건강한 문화를 유지 2), 3) 세포주기의 정확한 부분에서 박리 세포를 해부하는 동안 손상을 방지하고 잘 문화에 전송하는 민첩성.
특정 blastomeres를 조작하려면, 그것은 추기경의 축을 식별 할 수 있도록 필수적입니다. Xenopus의 배아에서 등쪽의 측면은 세 가지 방법으로 식별 할 수 있습니다 (2) 팁의 체외 계란은 수정 된 한 쪽 18, 19를 표시 (1) 중요한 염료 18, 19로 정자 진입 지점을 표시하거나 (3) 첫 번째 절단의 고랑은 동물 반구 20, 21에 가볍게 색소 지역을 양분하는 2 세포 단계에서 배아를 선택합니다. 우리는 정확하게 자연스럽게 - fertiliz에서 blastomeres를 식별 할 수있는 세 번째 방법을 사용에드 16 셀의 경우 20, 21의 90 %가 배아. 기름지게에서, 동물 반구의 착색은 등쪽 동물 지역 배아의 과반수 (그림 1) 이하 색소가되기 위해 원인, 복부 측면에 정자 진입 점에 대한 계약을 시작합니다. 클러치에서, 심지어 Xenopus 달걀의 클러치에서이 살짝 색소 지역의 범위에 상당한 차이가 있습니다. 첫 번째 절단의 고랑은 똑같이 두 딸 세포 사이에이 라이터 지역을 양분하는 경우, 라이터 지역은 등쪽면의 지표로 사용할 수 있으며, 첫 번째 절단 패인은 중반 시상 비행기를 나타냅니다됩니다. 첫 번째 절단의 고랑 한 어두운 세포 하나 조명 셀에 딸을 분리하면 나중에 단계에 착색이 정확하게 등쪽면을 확인하지 않기 때문에, explant을 위해 사용하지 않습니다. 이전 연구는 배아 이러한 종류의 최초의 절단의 고랑은 t에 대한 마커 유지 것을 보여 주었다가볍게 색소 지역 반면에 사람이 중간 시상 비행기는 더 이상 등쪽면 20, 21를 표시하지 않습니다. 첫 번째와 두 번째는 식물 극에 고랑 때 태아도 4 셀 절단 (그림 2B의 왼쪽 배아)의 초기 부분에서 선택할 수 있습니다 여전히 구별 할 수 있습니다 첫 번째 고랑이 완료되어야하며 두 번째 고랑하지 아직 완료합니다. 그러나, 하나는 배아 (그림 2B에서 오른쪽 배아)를 선택할 수있는 4 셀 단계가 끝날 때까지 기다리는 경우, 첫 번째와 두 번째 절단은 더 이상 구별 할 수 없습니다를 고랑, 그리고 약에 가볍게 색소 세포가 등쪽들 수 있습니다 배아 20, 21의 70 %. 이 훨씬 정확한 특정 blastomeres을 대상으로 렌더링됩니다. 그것은 첫 번째 절단의 고랑은 가볍게 색소 지역을 양분하는 배아의 비율은 클러치에서 큰 거래를 다양 있다는 것을 알아야한다. 우리의 경험에서 그들은 80 <에 클러치 계란의 50 %>를 차지클러치의 달걀 %. 에 관계없이, 거의 항상 explant 실험을 지원하기 위해이 기준을 충족 건강한 달걀 클러치에서 충분히 알이 있습니다.
두 권장 문화 미디어 (MMR, MBS)은 거의 교환 할 수있다, 다른 실험실의 환경 설정은 대부분 역사적 있습니다. MMR은 년 이상 10X 솔루션으로 저장할 수 있습니다. 이 중탄산염으로 버퍼링 때문 MBS는 짧은 수명이 있습니다. 배아와 explants의 보호 젤리와 vitelline의 멤브레인없이 세균 감염에 굴복 할 수 있기 때문에, 포셉 문화 미디어 살균해야합니다. explants 잘 생존하지 않는 경우, 항생제는 문화 매체 (예를 들어, 0.1 % gentamicin)에 추가 할 수 있습니다. gentamicin은 따라서 짧은 저장 수명을 가지고 있고, 포함 된 솔루션들은 사용됩니다 당일 신선한하여야한다. 세포 잔해 보호 explants를 손상시킬 수 프로테아제가 포함되어 있으며, 박테리아 성장을 촉진합니다. 따라서 레모해야explants이 치유 할 수있는 기회를 가지고 한 후 문화 우물에서 ved.
Blastomere의 dissections은 휴대 전화의 adhesions의 강도를 줄일 수 있도록 희석 문화 매체 (0.1X MBS 또는 0.1X MMR)에 수행됩니다. Xenopus의 절단 단계 동안, 세포 접착은 주로 calcium-/magnesium-dependent cadherins에 의해 달성된다. 따라서 효소 분해를 사용할 필요가 없습니다, 그것은 운명 결정 행사에 중요 할 수 있습니다 표면 단백질을 제거하기 때문에 실제로이 방법은 피해야한다. 계란의 다른 배치의 배아 세포가 서로 다른 장점을 준수하기 때문에, 분해 매체의 희석은 특별 기준으로 조정해야 할 수 있습니다. 세포를 찢어없이 해부 너무 점착성의 경우, 0.1X에서 stepwise 분해 매체의 농도를 낮 춥니 다. 세포가 vitelline 막이 제거 될 때 무너져 매우 새는 경우 반대로, dissectio의 농도를 증가stepwise N 매체입니다. 세포가 문화 우물에 전송하기에 너무 약한이 될 수 있기 때문에 calcium-/magnesium-free 미디어를 사용하지 마십시오. 세포주기 동안 하나가 절개를 수행 할 때 blastomeres 성공적으로 분리도에 따라 달라집니다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 초기 세포주기의 절단은 고랑이 얕은하고 blastomeres은 평평하고 있습니다. 나중에주기에서 절단이 고랑은 깊게하고 세포보다 반올림합니다. 초기 세포주기에 깨진 경우 세포질 누수가 발생합니다 세포질 다리가 있습니다. 따라서 세포가 더 쉽게 세포주기의 후반 해부 있습니다. 모든 단계에서 4 세포 배아, 8 셀 배아, 그리고 식물 세포는 세포질 다리 더 이상 지속하기 때문에 해부가 어렵습니다. 하나는 적절한 샘플 크기를 복구하는 더 dissections을 수행 한 요구 사항을 의미,이 explants의 높은 사망률을 예상 할 수 있습니다. 하나는 아까 그 바 말인데을 시작하기 위해 다음 절단의 고랑의 시작 때까지 기다릴 수세포질 다리 닫았는지 확인하려면 다음과 세포의 ction. 단일 blastomeres 8에서 촬영하는 동안 - 16 - 세포 배아는 우리의 경험에 문화에 살아남을 이전 blastomeres 적은 물론 하나의 세포로 운임. 우리가이의 원인은 모르지만, 나이가 blastomere explants의 생존은 하나의 문화도 10, 13, 14에서 함께 다른 배아 및 배양 그들로부터 동일한 blastomere의 (2-6) 여러 가지를 해부하여 향상시킬 수 있습니다.
이 절차는 연습과 몇 가지 수동 손재주를 필요로합니다. cleavages 사이의 시간이 온도에 의존하기 때문에, 그것은 절단을 늦출 더 많은 시간이 dissections을 수행 할 수 있도록 14-16 ° C에서 배아를 저장하는 것이 편리합니다. 그러나 배아는 14 ° C.보다 온도가 낮은 용납하지 않습니다 이 절차의 첫 번째 과제는 vitelline 막을 제거합니다. 그것은이 첫 번째 단계는 마스터 할 때까지 blastomere 절개로 이동하지 않는 것이 좋습니다. 해부 할 때blastomere 중에 "핸들"셀 누출과 무산 가능성이 높습니다. 한 번 다른 모든 세포를 원하는 세포에서 떨어져 벗겨되어 있기 때문에이 문제가 아닙니다, "핸들"셀은 집게로 제거 할 수 있습니다. blastomere는 (그림 3B) 잘 문화에 전송 될 때 핸들 전지 유물뿐만 아니라 다른 파편은 일반적으로 거리에 나눌 수 있습니다. Blastomeres 플라스틱에 avidly 충실하고 있으므로 전송 만 유리 피펫을 사용합니다. 이 피펫의 전단 세력에서 분해 할 수 있기 때문에 세포에 최소한의 먹는 압력을 사용하십시오. 또한, 피펫의 기포를 방지하고 공기 물 인터페이스를 터치하면 세포가 폭발 할 용의가 있기 때문에 explant 퇴학 때 피펫의 끝은 아래 문화 매체의 표면이 있는지 확인하십시오.
프로토콜은 본 배양을위한 explants와 간단한 소금 미디어 기증자로 unmanipulated 배아를 사용 설명했다. 이러한 사람이 expr에 explant의 고유 능력을 테스트 할 수 있습니다특히 운명을 ESS. 이 방법은 실험적으로 두 가지 방법으로 확장 할 수 있습니다. 첫째, 문화 미디어는이 분자가 explant는 다른 운명을 표현하는 일으킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 신호 / 성장 요인으로 보충 할 수 있습니다. 둘째, 기증 배아의 유전자 발현 전에 blastomere 해부에 해당 전구체로 mRNAs (이득의 기능) 또는 안티 센스 morpholino의 oligonucleotides (손실) 함수 중 하나를 주입하여 변경할 수 있습니다. 이 문제는 1 셀 단계에서, 또는 전에 해부 1-2 세포 분열에서보다 구체적으로 타겟팅 방식으로 수행 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 하나는 특정 exogenously 제공 유전자가 다른 운명을 취득 할 수있는 blastomere을 초래하거나, 특정 내생 유전자가 (예를 들어, 그림 4B)는 자율적 인 운명을 표현할 수있는 blastomere에 필요한 있는지 여부를 여부를 테스트 할 수 있습니다. 그들은 다른 세포의 혼란 영향을 제거하고 CE를 신호하기 때문에 이러한 강력한 실험 접근 아르nters은 그대로 태아에 제시한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 모나 Herold의 지원 Paaqua를 부여하고 GWU 루터 쌀의 원정 지원 GWU 할란 휄로 십을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 MCB-1121711에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
