Summary
El destino de una célula embrionaria individual puede ser influenciada por las moléculas hereditarias y / o por las señales de las células vecinas. Utilizando los mapas de destino de la etapa de escisión de embriones de Xenopus, blastómeras individuales pueden ser identificados por la cultura de forma aislada para evaluar las contribuciones de moléculas hereditarias frente a las interacciones célula-célula.
Abstract
Mapas de Destino, construidas a partir de linaje rastreo de todas las células de un embrión, revelan que los tejidos descienden de cada célula del embrión. Aunque los mapas destino son muy útiles para la identificación de los precursores de un órgano y para elucidar la vía de desarrollo por el que las células descendientes rellenar ese órgano en el embrión normal, no ilustran el potencial de desarrollo de una célula precursora o identificar los mecanismos por los cuales su destino está determinado. Para poner a prueba el compromiso del destino celular, se compara repertorio normal de una célula de descendientes en el embrión intacto (el mapa de destino) con los que se expresan después de una manipulación experimental. Es el destino de la célula fija (comprometido), independientemente del entorno celular, o es influenciado por factores externos facilitados por sus vecinos? Usando los mapas completos destino del embrión de Xenopus, se describe cómo identificar, aislar y única cultura precursores estadio de división, llamado blastomeres. Este enfoque permite evaluar si estas células tempranas están comprometidos con el destino que adquieren en su entorno normal en el embrión intacto, requieren interacciones con sus células vecinas, o puede ser influenciada para expresar destinos alternativos, si expuesto a otros tipos de señales.
Introduction
Xenopus laevis embriones se han utilizado ampliamente para identificar los mecanismos por los cuales las células embrionarias adquieren sus destinos específicos debido a que sus huevos son lo suficientemente grandes para permitir que los enfoques de microcirugía. Además, se desarrollan de forma externa sin la necesidad de suplementación nutricional del medio de cultivo debido a que cada célula contiene un rico suministro intracelular de las plaquetas de yema de que proporcionan una reserva de energía intrínseca. Un activo importante para el estudio de los mecanismos por los cuales se determina el destino celular es el conjunto completo de mapas de destino de los blastómeros estadio de división (de 2 - a través de las etapas de 32 células) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Estos mapas fueron construidos por microinyección de una molécula detectable en un blastómeras, identificables y seguimiento posterior en el desarrollo de los tejidos que están pobladas por los descendientes etiquetados. Mapas consistentes destino son posibles porque los ejes cardinales de los embriones pueden ser identificadas con toda fiabilidad en muchos embryos. En primer lugar, en todos los embriones de tipo salvaje del hemisferio animal es pigmentada, mientras que el hemisferio vegetal no lo es. En segundo lugar, la entrada del esperma en la fertilización produce una contracción de la pigmentación hemisferio animal hacia el lado ventral futuro; en muchos embriones una diferencia pigmentación por lo tanto se puede utilizar para discriminar entre los lados dorsal y ventral. En tercer lugar, el surco de división primera aproxima el plano sagital medio en la mayoría de los embriones, y por lo tanto se puede utilizar para identificar los lados derecho e izquierdo del embrión. Los mapas de destino también se basan en el hecho de que, naturalmente, los huevos fertilizados con frecuencia se unirá en patrones regulares que hacen que cada blastómero identificable a través de una gran población de embriones. Si bien existe variabilidad dentro y entre las puestas de huevos respecto a los patrones de pigmentación y de escisión, utilizando procedimientos de selección descritos en este documento permite que las células con destino prescritos a ser identificado con una precisión del 90% aproximadamente.
Destinos celulares pueden disuadirextraído durante la embriogénesis por varios mecanismos. Los factores intrínsecos, tales como diferencialmente heredados mRNAs citoplasmáticas o proteínas, contribuyen a varios aspectos del patrón temprano. Por ejemplo, específicos de mRNAs materna determinar qué células contribuirán a la línea germinal, se convierten en el endodermo, o contribuir al eje del cuerpo dorsal (revisado en 7). Los factores extrínsecos proporcionados localmente por células vecinas o más alejadas de un centro embrionario de señalización, son responsables de la inducción de tipos específicos de tejidos y patrones casi todos los sistemas de órganos. Ejemplos de centros de señalización incluyen la organizador / nodo en la gástrula que induce el ectodermo neural y los patrones del mesodermo, y la zona de actividad polarizante que los patrones del eje anterior-posterior del primordio de la extremidad. Aunque los mapas destino identificar los precursores de los diferentes órganos y revelar la vía de desarrollo adoptadas por sus descendientes en el embrión normal, que no pueden distinguir entre intrínsecay influencias extrínsecas en esas células. También no revelan el potencial de desarrollo de una célula, cuyos descendientes diferenciar en el complejo entorno de señalización del embrión. Dos enfoques experimentales pueden probar si el destino de una célula está determinada por factores intrínsecos o sea posteriormente influida por factores externos: 1) el trasplante de la célula a una ubicación nueva en el embrión, o 2) la eliminación de la célula del embrión seguido por cultivo en la ausencia de señales exógenas.
Ambos enfoques experimentales han sido factible en Xenopus porque las células son suficientemente grandes para separar manualmente. Por ejemplo, numerosos estudios han eliminado las células individuales a partir de embriones (para cambiar interacciones célula-célula) o células trasplantadas a lugares nuevos en los embriones de acogida para probar los cambios de destino (revisado en 7, 8, 9). Además, el segundo enfoque de la explantación pequeño número de células de diferentes regiones del embrión icultura ONT para dilucidar las interacciones inductivas de tejido en ausencia de factores exógenos es posible debido a que las células del embrión de Xenopus se llenan con un almacén intracelular de nutrientes, las plaquetas de yema. Por lo tanto, se pueden cultivar durante unos días en un medio definido sin sal suplementación nutricional o factor de crecimiento del medio de cultivo. Hemos usado este enfoque para demostrar que los blastómeros animales dorsales tienen una capacidad autónoma para producir tejidos mesodérmicos neuronales y dorsal debido a la herencia materna mRNAs 10, 11, y otros mostraron que mesodermo especificación de 32-celulares blastómeros se basa tanto en la información intrínseca y extrínseca 12 . Una ventaja de cultivar células como explantes es que el medio también se puede complementar con factores de señalización definidos para determinar que la célula-a-célula vía de comunicación podrían influir en el destino de la célula explantado 12, 13, 14. Además, se puede inyectar el pr blastómeroior a la cultura con ARNm para sobre-expresar un gen, o con oligonucleótidos anti-sentido para evitar la traducción de los ARNm endógenos. Estos, ganancia y pérdida de función de análisis puede identificar moléculas que se requieren para un destino autónoma expresado. Para analizar el destino del explante, la identificación de tipos específicos de células puede llevarse a cabo por la expresión de genes estándar (por ejemplo, hibridación in situ, RT-PCR) y ensayos inmunocitoquímicos. Este protocolo proporciona un simple, pero poderoso, forma de distinguir entre los mecanismos intrínsecos y extrínsecos que regulan el funcionamiento de una célula embrionaria se desarrolla en tejidos específicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de los medios de comunicación, Cultura Instrumentos y platos
- Enfocar cuatro pinzas con película abrasivo de alúmina. Haga esto bajo un microscopio de disección para controlar el tamaño de la punta. Un par de pinzas sirve como una copia de seguridad en caso de que una punta se daña durante el procedimiento. Autoclave las cuatro pinzas y almacenar en un recipiente estéril.
- Hacer cada 500 ml de medio de cultivo 0,1 X 1,0 X y (ya sea modificado de Marc Ringers [MMR] o salinos Modificado Barth [MBS]; recetas en 15) y el filtro de esterilización. Habitualmente usamos MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3). Almacenar a 14-18 ° C durante meses.
- Haga una solución de agarosa al 2% en medio de cultivo (2 g electroforesis en agarosa al grado en 100 ml de medio de cultivo 1X en una botella de vidrio tornillo de la tapa). Esterilizar en autoclave para disolver la agarosa. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante meses, y calentados para licuar la agarosa cuando se necesitaba siguiente.
- Mientras que la agarosa es líquido, se vierte sobre 0,5 ml en el fondo de cada pocillo de una placa de cultivo estéril 24-así. Esto evitará que los explantes se pegue al plástico.
- Mientras que la agarosa es líquido, se vierte sobre 2-3 ml en el fondo de dos a tres 60 mm placas de Petri, y agitar suavemente para asegurarse de que el fondo está cubierto. Estos servirán como platos de disección y la agarosa impide embriones se pegue al plástico una vez que sus membranas se retiran.
- Cuando la agarosa se ha enfriado y endurecido, la llama de la punta de una pipeta 6 "Pasteur hasta que se funde en una bola, y ligeramente toque en la superficie de la agarosa en cada pocillo de la placa de cultivo. Esto creará una depresión poco profunda en la que el explante se coloca.
- Llenar cada pocillo de la placa de cultivo con medio de cultivo estéril 1X.
- Cuando la agarosa se haya enfriado y endurecido, llenar el plato de disección con medio de cultivo diluido (0,1 X MMR o MBS 0.1x) para facilitar la separación de blastómeros.
2. Selección de embriones
- Obtención de huevos fertilizados y eliminar capas de la jalea de acuerdo con protocolos estándar de 15. Transferirlos a un medio de cultivo en una placa de 0,5 X 100 mm Petri.
- Cuando los embriones llegar a la etapa 2-células, ordenar aquellos en los que el surco de división divide la primera área ligeramente pigmentado en el hemisferio animal (Figura 1) en un plato separado. Estos serán los donantes de los explantes. Mantenga las restantes celdas de 2 embriones en un plato aparte junto a los embriones de donantes de todo el procedimiento para servir como controles de hermanos para organizar los explantes.
3. Preparación de explantes
- Coloque 5-10 embriones en un plato de disección, pero sólo funcionan en un embrión en un momento.
- Coloque el embrión por lo que la primera transparente membrana vitelina se puede ver, que está separada por un espacio libre (espacio perivitelino) por encima de la superficie del polo animal del embrión. Uso de una fuerza de afiladops en la mano subdominante (mano izquierda si es diestro), sujete la membrana vitelina por encima del espacio perivitelino. Usando unas pinzas afiladas en la otra mano, sujete la membrana cerca de la punta de unas pinzas en primer lugar, y tire suavemente en dirección opuesta a la cáscara de la membrana de distancia. Hacer el alcance inicial a una distancia desde la célula que va a ser disecado, de modo que la célula diana no está dañado durante la extracción de la membrana. Uno puede decir que la membrana se ha eliminado debido a que el embrión se aplanan.
- Agarre una célula vecina con las pinzas en la mano subdominante y utilizar esta celda como un "mango" así que la célula a ser disecado no se toca directamente. Con las pinzas en la otra mano, tire suavemente las células vecinas restantes lejos de la blastómero deseado. Si las células de la línea media, que comparten el mismo destino, se contemplan, se pueden eliminar juntos como una pareja. Por último, diseccionar la "manija" célula.
- Levante el blastómeros (o par de blastómeros), con una estéril, Pipeta Pasteur de vidrio, evitando burbujas de aire y de aspiración excesiva. La pipeta puede ser pulida al fuego para eliminar los bordes afilados que pueden dañar las células, pero no suelen hacerlo. Colocar la punta de la pipeta Pasteur bajo la superficie del medio de cultivo en un pocillo de la placa de cultivo de explante, y expulsar suavemente el blastómero. Debe caer en la depresión baja por gravedad. El blastómero mismo de más de un embrión se pueden combinar en un solo explante.
- Repita este procedimiento con los embriones restantes en el plato de disección, uno por uno. Después de aproximadamente 10 embriones, el plato de disección se llena de restos celulares. Cuando esto ocurre, cambiar a un plato fresco disección.
- Después de todas las disecciones terminado, comprobar si los explantes se encuentran en las depresiones poco profundas. Si no, pueden colocarse suavemente en la depresión con un bucle de pelo que ha sido esterilizado en 70% de etanol y se secó al aire.
- Alrededor de una hora después de la disección último, retirar escombros surrouhallando los explantes curadas con una pipeta estéril, vidrio Pasteur.
- Cultura de la placa de los explantes a 14-20 ° C al lado de la placa de Petri que contiene el hermano, los embriones de control. Embriones de hermanos indicará la etapa de desarrollo de los explantes blastómero.
4. Los explantes de cosecha para el Análisis de
- Cosechar los explantes cuando los hermanos llegan a la etapa de desarrollo deseado. Estos explantes sobreviven muy bien, incluso si algunas de las células se desintegran. Por lo tanto, si hay una masa nublado en el pocillo de cultivo, que explorar con un bucle de pelo o fórceps para determinar si un explante sano está enterrado dentro.
- Recoger explantes en un pequeño volumen de solución de cultivo con una pipeta Pasteur de vidrio, y suavemente expulsarlos en un tampón de lisis adecuado o fijador para que el ensayo se llevó a cabo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión el potencial de desarrollo de la célula se basa en la disección de la blastómero correcto basado en el destino mapas 1, 2, 3, 4, 5, 6. Por lo tanto, es fundamental para elegir embriones con el patrón de pigmentación correcta en la etapa 2-células, como se ilustra en la Figura 1, que posteriormente se ajustan a los patrones de escisión regulares, como se ilustra en la Figura 2. Si se observa según los embriones a medida que alcanzan la etapa de escisión requerida y separa los embriones que muestran divisiones irregulares, la precisión se mejora enormemente. Como se ilustra en la Figura 2, las divisiones regulares menudo se producen sólo en un lado del embrión. Estos embriones pueden ser utilizados como donantes de si la célula donante se origina a partir de la "regular" lado. Dado que los patrones regulares de escisión se encuentran en un menor número de embriones a medida que avanza la división celular, ordenar unas cinco veces más embriones como usted pretende diseccionar. Naturalmente fhuevos ertilized tienden a tener divisiones más regular que en los huevos fertilizados in vitro. Aunque los patrones de escisión varían mucho dentro de una sola puesta de los huevos, uno puede esperar al menos un 10-20% para ser útil para este tipo de manipulación.
Blastómeros pueden ser cultivadas solas o en pequeños grupos. Cuando se blastómeras primero diseccionado (Figura 3A) y se transfirió al cultivo bien (Figura 3B, C), son blandos y frágiles. En nuestra experiencia, blastómeras animales y ecuatoriales son más fáciles de diseccionar y cultura que blastómeras vegetales (Figura 3C). Tal vez porque son más pequeños, son más fáciles de transferir. También parecen sanar más rápidamente cuando mellado con las pinzas. Células vegetales a menudo parecen completar la citocinesis más lentamente y por lo tanto retener puentes citoplasmáticos con células hijas, haciéndolos más "permeable" cuando diseccionado, y su membrana celular es más frágil y más fácil de daños.Después de aproximadamente 1-2 horas en la cultura, la blastómero explantado (s) se han repartido cerca de 4 veces y deshizo de la mayor parte de los restos que queda de las células dañadas vecinos (Figura 3D). Después de 20 h, se forman pequeñas bolas sólidas de las células (Figura 3E). Mientras que algunos pueden ser enterrados en los escombros, a menudo una masa saludable se puede encontrar (Figura 3E, izquierda).
Aunque los explantes son pequeñas, sobreviven el procesamiento para la hibridación in situ, así como los explantes animales más comúnmente utilizados casquillo, que permite monitorizar más tarde la expresión génica. En el experimento mostrado en la figura 4A, dos blastómeros dorsales (D1.1) o dos blastómeros ventrales (V1.1) fueron disecados en la etapa 16-célula y se cultivaron en MBS 1X a 14 ° C hasta que alcanzaron las etapas de embriones de hermanos placa neural temprano (ST12-13; aproximadamente 20-22 horas después de la disección). Cada muestra se ensayó para la expresión de un gen cigóticos placa neural (Sox2 </ Em>) mediante hibridación in situ (el producto de reacción azul). Este ensayo demuestra que la mayoría de los blastómeros animales dorsales, que son precursores de la placa neural, puede expresar Sox2 autónoma, es decir, sin señalización adicionales de otras regiones del embrión. Esos explantes que no expresan Sox2 puede haber sido incorrectamente identificado en el momento de la disección. En contraste, ninguno de los blastómeros animales ventrales, que son precursores de la epidermis ventral, expresa Sox2. Por lo tanto, se concluye que blastómeras dorsal animales tienen una capacidad intrínseca para formar tejido neural, mientras que los animales blastómeras ventrales no. Tenga en cuenta que algunos de los explantes D1.1 también han eIongated, una morfología indicativa de la formación de mesodermo dorsal; estos blastómeras también están destinados a formar la notocorda en el embrión intacto 3, y en cultivo de explantes expresa una proteína marcadora 10 notocorda. Blastómeras destinos intrínsecas puede ser Ältere d por microinyección de ARNm antes (con ganancia de función) o anti-sentido oligonucleótidos de morfolino (MOs; pérdida de función). En la Figura 4B, el efecto de la alteración de los niveles endógenos de un gen expresado maternalmente neural, foxD5 16, 17, se prueba. Cuando el nivel endógeno de FoxD5 se aumentó mediante la inyección de foxD5 mRNAs en los blastómeros precursores de células de 8-V1.1 (fila inferior), la mayoría de los explantes V1.1 (cultivado a st 12-13) expresado Sox2. A la inversa, cuando el nivel endógeno de FoxD5 se redujo por inyección de MOS en los blastómeros precursoras 8-celulares de D1.1 (fila superior), sólo unos pocos D1.1 cultivaron explantes (a st 12-13) expresado Sox2 (a comparar fila superior de la Figura 4A). Estos experimentos indican que la expresión materna de foxD5 juega un papel en la capacidad intrínseca de blastómeros dorsal para adquirir un destino neural.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/>
Figura 1. Patrones de pigmentación en embriones de 2 células a partir de huevos fertilizados naturalmente. El surco de segmentación primero se indica mediante una flecha. A) Un ejemplo de un embrión que no se debe utilizar para identificar blastómeras en etapas posteriores ya que la región ligeramente pigmentada del hemisferio animal del embrión está contenido principalmente en una célula (a la izquierda). Puesto que el surco de división primera predice el plano medio sagital del embrión, la región ligeramente pigmentada de este embrión no identificará dorsal. B) Dos ejemplos de embriones que deben ser ordenados para cultivos de explantes. En tanto, la región ligeramente pigmentada del hemisferio animal (*) es atravesada por la división surco primero. El embrión de la izquierda es temprano en el primer ciclo celular, y la región ligeramente pigmentada es sólo visible en aproximadamente 25% de la superficie de la célula. El embrión de la derecha se está acercando al final del primer ciclo celular, y el pigmento se ha movido hentrally así las mitades dorsales de las dos células son más ligeros. Como resultado de ello, en las etapas posteriores de las células animales ligeramente pigmentados predecir dorsal (d) y células animales con pigmentación oscura será predecir ventral (v).
Figura 2. Ejemplos de embriones en fase de escisión a partir de huevos fecundados naturalmente. Todos los embriones están orientados con el polo animal frente al lector, dorsal en la parte superior. A) 4-células de embriones. El embrión de la izquierda acaba de entrar en el segundo ciclo de la célula por lo que el escote son poco profundos surcos. El embrión de la derecha casi se ha completado el ciclo celular por lo que la segunda división surcos son más profundos y las células aparecen más redondeados. Las flechas negras indican el surco de división primera, y las flechas rojas apuntan a la división surco segundos. B) 8-células de embriones. El embrión de la izquierda es temprano es la tercera del ciclo celular y el embrión de la derecha está cercael final del ciclo celular tercero. C) 16-células de embriones. C 'es un ejemplo de las divisiones irregulares que deben evitarse. C "es un ejemplo de las divisiones regulares sobre el lado ventral, pero irregular en el lado dorsal. C'' 'es un ejemplo de más divisiones regulares en el lado dorsal, pero no en el lado ventral. C'''' es un ejemplo de las divisiones regulares en la línea media, pero no lateralmente. D) de 32 células de embriones. D 'es un ejemplo de las divisiones regulares en la parte ventral, pero irregulares en el lado dorsal. D'' es un ejemplo de las divisiones regulares en el dorsal lado, pero no en el lado ventral. D'' 'es un ejemplo de divisiones regulares en el lado derecho, pero divisiones más irregulares en el lado izquierdo. E) 64-célula del embrión. Para una representación esquemática de estas etapas, consulte la serie de ensayo Nieuwkoop y Faber, que se puede encontrar en línea ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Figura 3. Explantes de 16-células de embriones de huevos fecundados naturalmente. A) Una blastómeras animales ventral poco después de la disección. Arrow denota restos de la "manija" célula. B) A los animales blastómeras ventral trasladado a un bien cultural que ha dividido a la vez. C) Un blastómeras ventral vegetal poco después de la disección. En comparación con los blastómeros animales, éstos son más grandes, y más difícil de manipular. D) Dos explantes ventrales blastomere animales, 2 horas después de la disección, se han dividido cuatro veces. El explante izquierda se ve desde la superficie original, pigmentada externa del blastómero; el explante derecha se ve desde la superficie original, sin pigmentar interior del blastómero. E) Dos explantes ventrales blastomere animales cultivaron durante 24 hr. El explante izquierda está sentado en una cama de restos celulares (flechas), mientras que el explante derecho es libre de detritus. Todas las imágenes son a 50X magnification.
Figura 4. En el análisis de hibridación in situ de la expresión génica en explantes derivados de blastómeros 16-celulares disecados a partir de huevos fertilizados naturalmente. A. El embrión 16-célula de la izquierda ilustra el par de blastómeros dorsal (D1.1) que se explantó para los resultados en la fila superior, y el par de blastómeros ventral (V1.1) que se explantó para los resultados en la fila inferior. Disecados pares blastomere de embriones no inyectados se colocaron en 0,1 X. MBS en pocillos de cultivo y se incubaron a 14 ° C durante aproximadamente 20 h. Ellos fueron recogidas en tubos de fijación y procesadas por hibridación in situ para la expresión de un gen cigóticos neural, Sox2. Blastómeros de embriones en la etapa B. 8-células se inyectaron bilateralmente ya seacon foxD5 MOS, para reducir la expresión endógena en blastómeros dorsal, o con foxD5 ARNm para aumentar la expresión endógena en blastómeros ventrales. Cuando los embriones inyectados alcanzado la etapa 16-cell (20-30 min más tarde), los pares de blastomere se disecaron, se cultivaron y se analizaron por hibridación in situ como en A. El número de explantes que expresan Sox2 se reduce significativamente en D1.1 explantes que fueron inyectados con foxD5 MOs (comparar con la fila superior en A). El número de explantes que expresan Sox2 es significativamente mayor en explantes V1.1 que fueron inyectados con mRNA foxD5 (comparar con la fila inferior en A). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los pasos más críticos para el cultivo con éxito de blastómeros individuales son: 1) identificar correctamente el blastómero de interés, 2) el mantenimiento de un cultivo estéril, saludable y 3) células de disección en la parte correcta del ciclo celular, y 4) la elaboración del manual necesario destreza para evitar daños durante la disección y transferir a la cultura también.
Para manipular blastómeras específicas, es esencial para ser capaz de identificar los ejes cardinales. En embriones de Xenopus, el lado dorsal se pueden identificar por tres métodos: (1) marcando el punto de entrada de los espermatozoides con un colorante vital 18, 19, (2) de inflexión fecundados in vitro huevos y de marcado uno de los lados 18, 19, o (3) selección de embriones en la etapa de 2-células en las que el surco de división divide la primera región ligeramente pigmentado en el hemisferio animal 20, 21. Usamos el tercer método, que identifica con precisión blastómeras de forma natural fertilizantesed 16-células de embriones en aproximadamente el 90% de los casos 20, 21. En la fecundación, la pigmentación hemisferio animal comienza a contraerse hacia el punto de entrada del esperma en el lado ventral, haciendo que la región dorsal de animales a ser menos pigmentada en la mayoría de embriones (Figura 1). Hay una variación considerable en el alcance de esta región ligeramente pigmentados a través de embragues e incluso dentro de puestas de huevos de Xenopus. Si el surco de división primera biseca este área más clara en partes iguales entre las células hijas dos, entonces el encendedor área se puede utilizar como indicador de la parte dorsal, y el surco de división primero indicará el plano sagital medio. Si la primera división surco separa las hijas en una celda oscura y una celda de la luz, no lo uso para el explante debido a que la pigmentación en las etapas posteriores no identifique fielmente el lado dorsal. Estudios anteriores demostraron que en este tipo de embriones el surco de división primero siendo un marcador de tél sagital medio plano mientras que la región ligeramente pigmentada ya no se indica el lado dorsal 20, 21. Los embriones también se puede seleccionar en la primera parte de la escisión de 4-células (embrión izquierda en la Figura 2B), cuando la primera y segunda de los surcos en el polo vegetal todavía puede ser distinguido; el primer surco debe ser completa y no el segundo surco aún completarse. Si, sin embargo, se espera hasta el final de la etapa de 4 células para seleccionar embriones (embriones derecha en la Figura 2B), la escisión primero y segundo surcos ya no pueden ser distinguidos, y las células ligeramente pigmentados pueden ser las dorsales en sólo alrededor 70% de los embriones 20, 21. Esto hará que la orientación blastómeras específicas mucho menos precisa. Cabe señalar que el porcentaje de embriones en los que el surco de división divide la primera región ligeramente pigmentados varía mucho a través de embragues. En nuestra experiencia, pueden dar cuenta de <50% de los huevos en un embrague a> 80% De los huevos en un embrague. De todos modos, hay casi siempre son suficientes huevos en una nidada de huevos sanos que cumplen este criterio para apoyar un experimento explante.
Los dos medios de cultivo recomendados (MMR, MBS) son prácticamente intercambiables, las preferencias de los diferentes laboratorios son en su mayoría histórica. MMR puede ser almacenado como una solución 10 veces durante un año o más. MBS tiene una vida útil más corta debido a que está tamponada con bicarbonato. Debido a que los embriones y los explantes pueden sucumbir a la infección bacteriana sin el protector jalea y las membranas vitelina, pinzas y medios de cultivo deben ser estériles. Si explantes no sobreviven bien, los antibióticos se pueden añadir al medio de cultivo (por ejemplo, gentamicina 0,1%). Las soluciones que contienen gentamicina tienen una vida de almacenamiento corto, y por lo tanto debe ser fresca en el día en que se van a utilizar. Los restos celulares contiene proteasas que puedan dañar los explantes sin protección, y promueve el crecimiento de bacterias. Por lo tanto, debe ser removed a los pocillos de cultivo después de los explantes han tenido la oportunidad de sanar.
Disecciones de blastómeros se llevan a cabo en medio de cultivo diluido (0,1 X. MBS o MMR 0,1 X) con el fin de disminuir la fuerza de las adhesiones célula a célula. Durante las etapas de escisión de Xenopus, la adhesión celular se realiza sobre todo por cadherinas calcium-/magnesium-dependent. Por lo tanto, no es necesario el uso de la disociación enzimática, de hecho esto debe evitarse, ya que elimina las proteínas de superficie que pueden ser importantes en la determinación del destino eventos. Dado que las células procedentes de diferentes lotes de huevos se adhieren con diferentes puntos fuertes, la dilución del medio de disección puede ser necesario ajustar sobre una base ad hoc. Si las células son demasiado adherente para diseccionar sin romperlas, disminuir la concentración del medio de disección por etapas de 0,1 X. A la inversa, si las células se deshacen cuando la membrana vitelina se retira y son muy permeable, aumentar la concentración de la dissection paso a paso medio. Sin embargo, no utilice los medios de comunicación calcium-/magnesium-free porque las células se vuelven demasiado frágil para transferir a los pocillos de cultivo. Separación exitosa de blastómeras también depende de cuándo durante el ciclo celular uno realiza la disección. Como se muestra en la Figura 2, al principio del ciclo celular la escisión surcos son poco profundas y los blastómeros se aplanada. Más tarde en el ciclo de la escisión surcos son más profundas y las células son más redondeados. Al comienzo del ciclo celular, hay puentes citoplásmicos que provocarán fugas citoplásmica caso de rotura. Por lo tanto, las células son más fácilmente disecado tarde en el ciclo celular. 4 células de embriones, embriones de 8 células, y las células vegetales en todas las etapas son más difíciles de analizar debido a que los puentes citoplasmáticos persistir por más tiempo. Se puede anticipar una alta tasa de mortalidad para estos explantes, lo que significa que se necesita para realizar disecciones más para recuperar una muestra de tamaño razonable. Uno puede esperar hasta el comienzo de la división surco siguiente para comenzar la dissección de estas células para asegurar que los puentes citoplasmáticos han cerrado. Mientras que blastómeras individuales tomados de 8 - y 16-células de embriones sobreviven bien en la cultura, en nuestra experiencia blastómeras mayores les va tan bien como células individuales. Aunque no se sabe la causa de esto, la supervivencia de los adultos mayores explantes blastomere se puede mejorar mediante la disección de varios (2-6) de la misma blastómeras de embriones diferentes y cultivar juntos en una sola cultura bien 10, 13, 14.
Este procedimiento requiere práctica y un poco de destreza manual. Debido a que el tiempo entre las divisiones es dependiente de la temperatura, es conveniente para almacenar los embriones a 14-16 ° C para reducir la velocidad de escisión y de más tiempo para realizar las disecciones. Sin embargo, los embriones no tolera temperaturas inferiores a 14 ° C. El primer reto en este procedimiento es la eliminación de la membrana vitelina. Es mejor no seguir adelante con la disección hasta que blastómeras este primer paso se domina. Cuando la disecciónel blastómeros, el "mango" célula pueda derramarse y desmoronarse. Esta no es una preocupación porque una vez que todas las otras células se despega de la célula deseada, el "mango" célula se puede quitar con una pinza. Los restos celulares de manejar, así como otros desechos generalmente desaparecen cuando la blastómeros se transfiere a la cultura también (Figura 3B). Blastómeros pegarse con avidez a plástico, a fin de utilizar sólo pipetas de vidrio para transferirlas. Use una presión de succión mínima en la célula ya que puede desintegrarse a partir de las fuerzas de cizallamiento en la pipeta. También, evitar burbujas de aire en la pipeta y asegúrese de que la punta de la pipeta está por debajo de la superficie del medio de cultivo cuando el explante es expulsado porque las células pueden explotar si se tocan una interfase aire-agua.
El protocolo se describe en la presente memoria utiliza embriones manipulados como donantes para los explantes y los medios simples de sal para el cultivo. Estos permiten poner a prueba la capacidad intrínseca del explante a express destino particular. Este método puede ser experimentalmente expandido de dos maneras. En primer lugar, los medios de cultivo se puede complementar con factores de señalización / crecimiento para probar si estas moléculas pueden causar el explante para expresar destinos alternativos. En segundo lugar, la expresión génica de los embriones de donantes se puede cambiar ya sea mediante la inyección de ARNm (con ganancia de función) o anti-sentido oligonucleótidos de morfolino (pérdida de función) en los precursores específicos antes de la disección de blastómeros. Esto puede hacerse en la etapa 1-célula, o de una manera más específica en 1-2 divisiones celulares antes de la disección. Con estos planteamientos, se puede probar si un determinado gen exógenamente suministrado provoca un blastómero para adquirir un destino alternativo, o si un gen endógeno particular es necesario para el blastómero para expresar su destino autónomo (por ejemplo, la figura 4B). Estos son potentes enfoques experimentales debido a que eliminan la influencia de confusión de las otras células y la señalización centers presentes en el embrión intacto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer la GWU Harlan Becas para el apoyo de Paaqua Grant y la GWU Luther Rice Becas para el apoyo de la Mona Herold. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation de subvención MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
