Summary
单个胚胎细胞的命运可以继承的分子和/或通过来自相邻小区的信号的影响。利用爪蟾胚胎的卵裂阶段的命运地图，单个卵裂球可确定为文化隔离的贡献进行评估的遗传分子与细胞间的相互作用。
Abstract
命运的地图，所有的胚胎细胞谱系追踪构造，揭示下降，从每一个细胞的胚胎的组织。虽然命运地图是非常有用的，确定的前体器官移植和澄清的后裔细胞的发展路径填充该机构在正常的胚胎，他们没有说明发展潜力的前体细胞，或识别机制它的命运是确定的。为了测试细胞命运的承诺，一个细胞的正常剧目的后裔比较完整的胚胎的命运（图）实验操作后，所表达的。固定的细胞的命运（提交），无论周围的细胞环境，或者是其邻国所提供的外部因素的影响？非洲爪蟾胚胎使用全面命运的地图，我们将介绍如何识别，分离和培养单个卵裂阶段的前体，称为囊胚meres。这种方法允许1评估这些早期的细胞是否致力于获得的命运在完整的胚胎在其正常的环境中，需要与它们相邻的细胞的相互作用，或者可以影响表达如果暴露于其它类型的信号的备用命运。
Introduction
非洲爪蟾胚胎已被广泛利用，以确定胚胎干细胞的机制，获得其特定的命运，因为他们的鸡蛋是大到足以允许显微外科方法。此外，它们的培养基中的营养补充品，而不需要为外部发展，因为每个小区包含一个提供了内在的能量存储的蛋黄血小板丰富的细胞内供给。研究细胞命运决定的机制，一个重要的资产，是一套全面的命运地图的卵裂阶段的卵裂球（2 -通过32细胞阶段）1，2，3，4，5，6。这些地图，构建了一个检测的分子显微注射到一个单一的，可识别的卵裂球，在发展监察组织填充标记的后代。一致的地图是可能的，因为命运的大是大非轴的胚胎可以可靠地识别在许多安莉芳操作系统。首先，在所有的野生型胚胎的动物半球色素，，而植物性半球是不。其次，该条目的精子受精导致朝向未来腹侧的动物半球色素沉着的收缩，在许多胚胎色素沉着的差异，因此，可以用来区分背侧和腹侧的两侧。第三，第一卵裂沟接近大多数胚胎中期矢状面，并因此可以被用来识别的左，右两侧的胚胎。的的命运地图也依赖于一个事实，即自然受精的卵子经常切割的规律，使每个识别在一个人口众多的胚胎的卵裂球。虽然有变异本文内和之间的描述有关的色素沉着和裂解模式，使用选择的程序的鸡蛋离合器允许细胞要确定与约90％的准确度与规定的命运。
可以阻止细胞的命运开采胚胎发育过程中，由几个机制。内在因素，如差异继承细胞质的mRNA或蛋白质，有助于早期图案的几个方面。例如，特定的母亲的基因，确定哪些单元格将有助于生殖系，成为内胚层，或有助于背的身体轴（7检讨）。相邻小区或更远的胚胎信号中心提供本地的外在因素，是诱导特定的组织类型和的图案几乎每一个器官系统。信号中心的实例包括组织者/节点的原肠胚诱导的神经外胚层和图案中胚层，和偏振活性区域的模式的前后轴的肢芽。虽然命运地图的前体的不同器官和他们的后裔在正常的胚胎，揭示了发展的道路，他们无法区分内在和外在影响这些细胞的。他们也无法揭示的充分发展潜力的一个细胞，其后代分化的胚胎在复杂的信号环境。两个实验的方法可以测试是否一个细胞的命运是确定的内在因素或者是后来影响的外部因素：1）移植的细胞在胚胎中一个新的位置，或2）去除细胞从胚胎随后由文化在外源信号的情况下。
这两个实验的方法是可行的，因为细胞是在非洲爪蟾大到足以被人工分离。例如，许多研究已删除单到新的地点在宿主胚胎细胞的胚胎（改变细胞间的相互作用）或移植的细胞命运的变化（审查，7，8，9）测试。另外，第二种方法的小数量的细胞的胚胎来自不同区域的explanting我置身于文化，以澄清感性的组织在没有外源性因素的相互作用可能是因为非洲爪蟾胚胎的细胞都充满了细胞内的营养物质店，蛋黄血小板。因此，它们可以被培养在一个定义的盐介质中无营养或生长因子的培养基中补充了几天。我们用这种方法来背动物卵裂球的的自主能力产生神经和背中胚层组织，以母系遗传的基因10，11，和其他人表明，32 -细胞卵裂球中胚层规范依赖于内在和外在的信息12 。作为外植体的培养细胞的一个优点是，该介质还可以补充有定义信令因素，以便确定哪个可能影响细胞-细胞间的通信路径的取出的单元12，13，14的命运。此外，可以注入卵裂球公关的ior文化与mRNA过度表达的基因，或与反义寡核苷酸，以防止内源性的mRNA的翻译。这些收益和损失的功能分析，可以识别的分子所需要的自主表达的命运。要分析外植体的命运，识别特定的细胞类型可以通过标准的基因表达（ 例如，原位杂交，RT-PCR）和免疫组化检测。该协议提供了一个简单，但功能强大的方法来区分之间内在的和外在的机制，调节胚胎细胞发育成特定的组织。
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Protocol
1。仪器仪表，文化传媒和菜肴的制备
- 锐化钳使用氧化铝研磨胶片。在解剖显微镜下，监视针尖大小。作为一对钳子的背面的前端的情况下在操作过程中被损坏。高压灭菌所有四个钳子和存储在无菌容器中。
- 500毫升的0.1倍和1.0倍的培养基（马克的改良林格[MMR]或修改巴特的盐水[MBS];的食谱中15），和过滤消毒。我们经常使用MBS（1X = 88毫米氯化钠，氯化钾1毫米，0.7毫米氯化钙 ， 硫酸镁 1毫米，5毫米HEPES pH值7.8， 碳酸氢钠 2.5毫米）。在14-18°C的存储数月。
- 在培养基中（2克电泳级琼脂糖1X在100毫升的培养基中的螺旋盖的玻璃瓶中）在2％琼脂糖溶液。高压釜中，溶解琼脂糖。这可以在4℃下储存几个月，和微波液化琼脂糖接下来需要时。
- 虽然琼脂糖是液体，倒入约0.5毫升到无菌的24孔培养板的各孔中的底部上。这将防止外植体附着的塑料。
- 虽然琼脂糖是液体，倒入约2-3毫升两至三个60毫米培养皿的底部上，并轻轻摇动以确保覆盖底部。这些将作为夹层菜肴和琼脂糖防止粘到塑料胚胎一旦它们的膜中除去。
- 当琼脂糖已冷却并硬化，火焰6“巴斯德吸管的前端，直到它融化成球，并轻轻触摸它的表面上的培养板的各孔中的琼脂糖，这将创建一个浅凹陷处到其中外植体将被放置。
- 填充各孔的培养板中的与1X无菌培养介质。
- 当琼脂糖冷却和硬化，填补了解剖菜用稀释的培养液（0.1％MMR或0.1％MBS），以促进卵裂球分离。
2。胚胎选择
- 获取受精卵和删除果冻外套根据标准协议15。将它们传输到0.5X 100毫米的陪替氏培养皿中的培养基中。
- 当胚胎达到2 -细胞阶段，排序那些其中第一卵裂平分轻色素在动物半球的面积（ 图1）到一个单独的盘。这将是捐助者为外植体。保留剩余的2 - 细胞胚胎在一个单独的盘下整个过程，作为兄弟控制阶段外植体的囊胚。
3。外植体的制备
- 在一个夹层皿放置5-10胚胎，但在一个时间只能工作在一个胚胎。
- 第一胚胎定位，以便在透明的卵黄膜中可以看出，它由明确的空间（围卵腔）的表面上方的动物极的胚胎分离。使用锋利的力量PS中的亚优势手（左手，如果其中一个是右撇子），掌握母细胞的卵黄膜上面。使用尖锐的镊子在另一方面，掌握接近的第1钳子小费膜，并轻轻地在相反的方向拉剥膜路程。使初始把握被解剖，使靶细胞除去膜期间不被损坏的电池，它是在距离。可以告诉大家，在膜已被删除，因为胚胎扁平化。
- 带着一个相邻小区与下属音在一方面的钳子，并使用此单元格以被解剖的细胞作为一个“句柄”，所以还没有直接接触。在另一方面，随着钳子，轻轻将剩余的相邻小区距离所需的卵裂球。如果中线细胞，它们共享同样的命运，是有针对性的，他们可以将其作为对一起除去。最后，剖析了细胞的“手柄”。
- 拿起卵裂球（或卵裂球的一对），用无菌巴斯德吸管，玻璃，避免气泡和过度抽吸。吸管可以火抛光，除去锐边，可以破坏细胞，但我们不经常这样做。放置的巴斯德吸移管的前端的表面下的培养介质中的孔中的外植体的培养皿中，并轻轻驱逐卵裂球。应该到浅的凹陷的重力滑动。相同卵裂球从一个以上的胚胎可以结合成一个单一的外植体。
- 重复此过程，在解剖盘，一个接一个，其余的胚胎。经过约10个胚胎，解剖盘将充满细胞碎片。当这种情况发生时，改变到一个新的解剖菜。
- 毕竟解剖完成后，检查是否将外植体在浅水洼地。如果没有问题，他们可以轻轻推入凹陷用吹风循环，已经在70％乙醇和空气干燥灭菌。
- 大约一个小时后，最后清扫，清除杂物surrounding愈合的外植体，用无菌玻璃巴斯德吸管。
- 培养板的外植体在14-20°C下的兄弟姐妹，控制胚胎的培养皿中。兄弟姐妹的胚胎将显示卵裂球外植体的发展阶段。
4。收获外植体分析
- 收获的兄弟姐妹时，外植体达到预期的发展阶段。这些外植体生存相当不错，即使一些细胞瓦解。因此，如果有大量的文化是个阴天，探索它用吹风循环或镊子，以确定是否是埋在一个健康的外植体。
- 拿起外植体在小体积的培养液用玻璃巴斯德吸管，并轻轻驱逐他们到一种固定剂或适当的裂解缓冲液中进行测定。
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Representative Results
在此测定法来准确地评估细胞的发育潜能的能力依赖于解剖出正确的卵裂球的基础上的命运地图1，2，3，4，5，6。因此，关键是选择正确的色素沉着在2 -细胞阶段模式中，作为示出在图1中 ，随后与符合正常卵裂模式，如在图2中示出的胚胎。如果一个人观察的排序的胚胎，因为他们达到所需的卵裂阶段和分离出来呈现出不规则的分裂的胚胎，精度大大提高。正如在图2中示出，定期裂解往往只在一侧的胚胎发生。这些胚胎可以作为供体，如果使用的供体细胞来源于“常规”侧。由于经常切割模式被发现在约5倍，许多胚胎的胚胎细胞分裂的收益，排序，你打算解剖。当然fertilized鸡蛋往往更经常的体外受精卵分裂。虽然乳沟模式有很大差异，在一个单一的离合器的鸡蛋，谁也无法预料这样的操作至少有10％至20％是有用的。
卵裂球是可以培养的，单独或小团体。当卵裂球解剖（ 图3A），并转移到文化（ 图3B，C），他们是软的，脆弱的。根据我们的经验，动物和赤道卵裂球更容易进行解剖，文化比植物卵裂球（ 图3C）。也许是因为他们更小，更容易转移。他们似乎也更迅速地愈合，当缺口的镊子。植物细胞往往显得更慢，从而完成细胞分裂保留与姐姐细胞的胞质桥，使他们更“漏”解剖时，他们的细胞膜相对比较脆弱，容易损坏。约1-2小时后，在文化，取出的卵裂球（S）划分的4倍左右，脱落的大部分剩余的碎片从损坏的相邻细胞（ 图3D）。 20小时后，它们就形成小的，坚固的细胞球（ 图3E）。虽然有些人可能被埋在废墟中，往往是一个健康的质量可以被发现（ 图3E，左 ）。
虽然外植体是小的，它们生存的处理原位杂交，以及更常用的动物帽的外植体，它允许一个监测购买基因表达。两个背卵裂球（D1.1）或两个腹侧卵裂球（V1.1）在图4A中所示的实验中，在小区16的阶段进行解剖，并培养在1X的MBS，在14°C，直到同级胚胎达到神经板早期阶段（ST12-13，约20-22小时后，解剖）。测定每个样品的表达的合子的的神经板基因（SOX2 </ em>的） 通过原位杂交（蓝色的反应产物）。此实验表明，大多数背动物卵裂球，这是神经板的前体，可以表达SOX2自主，即，不从其他区域的附加 的信令的胚胎。可能已被错误地识别这些外植体，不表达SOX2在解剖的时候。相反，没有腹动物卵裂球，这是前体的腹部表皮，快速SOX2。因此，我们的结论是背动物胚胎细胞有一个内在的能力，形成神经组织，，而腹侧动物卵裂球做不。需要注意的是一些的D1.1植，也eIongated，背中胚层形成的形态指示;这些卵裂球也注定要形成完整的胚胎脊索在3，外植体培养快递脊索标记蛋白10。胚胎卵裂球的内在的命运可以altere的 D的mRNA注射前（增益功能）或反义吗啉代寡核苷酸（MOS损失的功能）。在图4B中，一个母系表达的神经基因，foxD5 16，17，改变的内源性水平的效果进行测试。当内源性水平FoxD5的增加注入foxD5 mRNA的V1.1（底行）到8 -细胞前体卵裂球，V1.1外植体的大部分（培养12-13到st）SOX2表示。相反，当内源性水平FoxD5减少注射的MO D1.1（顶行）到8 -细胞前体卵裂球，只有少数D1.1外植体（培养到st 12-13）表达SOX2（比较顶行的图4A）。这些试验表明，产妇foxD5的表达起到了重要作用，在背卵裂球获得的内在能力的神经命运。
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图1。在自然受精鸡蛋的2 -细胞胚胎的色素沉着模式。第一卵裂沟是由箭头表示。 A）的一个例子，不应该被用来识别在稍后阶段，因为轻色素区域大多包含在一个单元格（在左侧）的动物半球的胚胎卵裂球的胚胎。因为第一次卵裂沟预测中矢状面的胚胎，这种胚胎将无法识别轻度色素沉着区域的背侧。 B）两个例子的胚胎应分类为外植体的文化。在这两种，轻度色素沉着区的动物半球（*）的第一次卵裂沟平分。在左边的胚胎是早在第一小区中的周期，和轻度着色的区域是唯一可见的在约25％的细胞表面。在右边的胚胎即将结束的第一个细胞周期中，和已移动的颜料已经ntrally所以背半部的两个细胞更轻。其结果是，在后面的阶段中，轻色素的动物细胞将预测背侧（四）和深色的动物细胞将预测腹侧（ⅴ）。
图2。自然受精卵卵裂期胚胎的例子。所有的胚胎是与动物极面对读者，背顶端定向。 A）4 - 细胞胚胎。在左侧的胚胎刚刚进入第二个细胞周期，所以卵裂沟浅。在右边的胚胎已经接近完成了第二次卵裂沟的细胞周期，所以更深层次的细胞似乎更加圆润。黑色箭头指向第一次卵裂沟，红色箭头指向第二次卵裂沟。 B）8 - 细胞胚胎。的，左边是早期胚胎的的第三细胞周期和胚胎，右侧则是近第三细胞周期的结尾。 C）16 - 细胞胚胎。 C'是要避免不规则分裂的一个例子。 C“是定期裂解腹侧的一个例子，但不规则的背侧上，C'''是一个例子的更经常的分裂的背侧上，但不包括在腹侧，C''''是一个例子在中线定期裂解，但不能横向，D）32 - 细胞胚胎。定期裂解腹侧D'是一个例子，但不规则的背侧上。D“是一个例子的定期裂解背侧侧，但不包括在腹侧。D'''定期裂解的右侧是一个例子，但更不规则的分裂的左侧。E），64 - 细胞胚胎。对于这些阶段的示意性表示，请参阅的Nieuwkoop和Faber分期系列的，上可以发现行（ http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ）。
图3：16 -细胞胚胎植体的自然受精卵。 A）腹后不久，解剖动物卵裂球。箭头表示的“手柄”细胞的残余。 B）腹动物胚胎细胞转移到文化以及分一次。 C）卵裂球后不久，解剖腹植物。相比动物卵裂球，这些更大，更难以操纵。 D）两个腹侧动物卵裂球外植体，2小时后，解剖，划分四倍左右。从原来的，着色的外表面的卵裂球的左外植体被认为合适的外植体是从原来的，未着色的卵裂球的内表面观察。 E）腹动物卵裂球外植体培养24小时。左外植体坐在床上的细胞碎片（箭头），而右边的外植体是无任何碎屑。所有图像都在50X尊离子。
图4，在16从自然受精卵细胞卵裂球解剖来源于外植体中的基因表达的原位杂交分析。A.在左边示出了16 -细胞胚胎背卵裂球对（D1.1），其结果，在被取出的最上面一排，和腹卵裂球对（V1.1），这是外植在底行的结果。解剖未注射胚胎的卵裂球对被安置在0.1X MBS培养板，在14℃培养约20小时。他们收集管固色剂，由一个合子的神经，SOX2基因表达的原位杂交技术在处理B. 8 -细胞期胚胎的卵裂球注射双边或者foxD5 MOS管，减少内源性表达在背卵裂球，或与foxD5增加内源性表达的基因中脑腹侧卵裂球。当注射的胚胎达到16个细胞阶段（20〜30分钟后），卵裂球对进行解剖，培养和分析原位杂交技术在 A。表达SOX2显着减少注射foxD5 MOS（在一个比较顶行）在的D1.1植，外植体的数目。外植体的数量表达SOX2显着增加在V1.1植注射foxD5 mRNA的表达（比较A 中上下行）。 点击此处查看大图 。
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Discussion
成功培养的单个卵裂球的最关键的步骤是：1）正确识别的卵裂球的兴趣; 2）保持无菌，健康的文化; 3）解剖细胞在细胞周期中正确的部分; 4）制定必要的手册灵巧，以防止损坏在解剖和转让过程中的文化。
操作特定的卵裂球，关键的是要能够识别的大是大非轴。在爪蟾胚胎中，被识别的背侧可以通过三种方法：（1）标志着精子入口点，与一个重要的染料18，19，（2）倾翻在体外受精卵和标记的一侧18，19，或（3）选择期间，其中第一卵裂平分轻度着色的区域在动物半球20，21的 2 -细胞阶段的胚胎。我们使用第三种方法，准确地识别卵裂球从自然，施肥ED 16-细胞的胚胎，约90％的情况下，20日，21。施肥，合同朝向腹侧精子的入口点上的动物半球色素沉着的开始，导致背动物区域成为较少色素在大多数胚胎（ 图1）。有轻度色素沉着区域的跨离合器，甚至在非洲爪蟾卵离合器的程度，这在相当大的变化。如果第一卵裂平分这同样之间的两个子细胞中的较亮的区域，然后，较亮的区域可以使用作为指示器的背侧，第一卵裂将指示中期矢状面。如果第一次卵裂沟的女儿分离到一个阴暗的牢房里，一个光电池，不使用色素沉着在稍后阶段为外植体，因为不能准确地识别背侧。以往的研究表明，在这些种胚卵裂仍然是一个标记为T他轻度色素沉着的区域中矢状面，而不再表示背侧20，21。胚，也可以选择4细胞裂解（左胚胎在图2B），在早期的一部分，当所述第一和第二沟在植物极仍然可以分辨;第一沟应该是完整的和所述第二沟不尚未完成。然而，如果一个等待，直到结束的4 -细胞阶段选择胚胎（右胚胎在图2B中），第一和第二裂解沟可以不再加以区分，和轻度色素的细胞可以是背的只有约胚胎的20，21的 70％。这将使得针对特定的卵裂球不准确的。应当指出，胚胎的百分比，其中第一卵裂沟平分轻色素区域横跨离合器有很大不同。在我们的经验中，他们可以占到50％的卵在离合器> 80在离合器的鸡蛋％。无论如何，几乎总是有足够的鸡蛋在离合器健康的卵子，符合此标准的支持外植体实验。
这两种建议的培养基（MMR，MBS）几乎是可以互换的，大多是历史的喜好，不同的实验室。 MMR可存储10倍的解决方案，为一年或一年以上。 MBS有一个较短的保质期，因为它是与碳酸氢盐缓冲。由于胚胎和外植体可以屈从于细菌感染无保护的果冻和卵黄膜，镊子和文化传媒应是无菌的。如果外植体也同样无法生存，抗生素，可以添加到培养基中（ 例如 ，0.1％庆大霉素）。解决方案含有庆大霉素有一个简短的贮存寿命，从而取得了新的一天，他们要使用。细胞碎片会损坏未受保护的外植体，含有蛋白水解酶，并促进细菌的生长。因此，它应该是雷莫从文化井的ved外植体后，有机会治愈。
卵裂球夹层中进行稀释的培养基中（0.1％的MBS或0.1X MMR），以减轻细胞 - 细胞间的粘连强度。在爪蟾卵裂阶段主要是通过calcium-/magnesium-dependent钙粘素，细胞粘附。因此，没有必要使用酶消化，其实这应该是可以避免的，因为它消除表面的蛋白质，可能是重要的命运决定的事件。由于坚持从不同批次的鸡蛋胚胎干细胞具有不同的优势，稀释的解剖介质的需要临时安排的基础上进行调整。如果细胞是太粘附解剖而不将其撕破，降低0.1X逐步地从解剖介质的浓度。相反，如果细胞崩溃当卵黄膜除去时，是非常漏，增加的dissectio浓度逐步Ň介质。然而，不使用calcium-/magnesium-free的媒体，因为的细胞变得过于脆弱转移到文化的井。成功分离卵裂球也依赖于细胞周期时进行解剖。正如在图2中所示，在细胞周期中的早期卵裂沟浅层和卵裂球被压扁。在周期的后期，卵裂沟更深层次和的细胞更加圆润。在细胞周期中的早期，有胞质桥如果断裂将引起细胞质泄漏。因此，细胞可以更容易地解剖在细胞周期的后期。 4 - 细胞胚胎，8细胞胚胎，并在各个阶段的植物细胞胞质桥解剖，因为持续时间较长。可以预见这些外植体死亡率高，这意味着我们需要进行更多的解剖恢复一个合理的样本量。我们可以等待，直到开始下一个卵裂开始狄氏ction这些细胞确保胞质桥已经关闭。虽然单个卵裂球8 - 和16 - 细胞胚胎生存的文化，在我们的经验中，年龄较大的卵裂球车费以及单细胞。虽然我们不知道的原因，生存期较旧的卵裂球外植体可提高通过解剖几个（2-6）从不同的胚胎的卵裂球和培养他们一起在一个单一的文化以及10，13，14，。
这个过程需要一些做法和手的灵巧。由于分裂之间的时间是依赖于温度，这是方便的存储在14-16℃下的胚胎减慢裂解，并允许更多的时间来执行的解剖。然而，胚胎不会容忍的温度低于14°C。在此过程中的第一个挑战是消除卵黄膜。这是最好不要动到卵裂球的解剖，直到掌握这第一步。当解剖出卵裂球，“手柄”细胞是可能的泄漏和崩溃。这是不是一个问题，因为一旦所有其他细胞的剥离，从所希望的小区，则“把手”小区可以除去用钳子。手柄电池残余以及其他杂物时，通常都会消失。卵裂球被转移到文化（ 图3B）。卵裂球贪婪地坚持以塑料，因而只能使用玻璃吸管将他们转移。使用最小的吸入压力对细胞的剪切力的吸管，因为它可以瓦解。另外，应避免在移液管的空气的气泡，并确保的前端下面的移液管的表面时的培养基中的外植体被排出，因为细胞会爆炸如果他们接触的空气 - 水界面。
本文所描述的协议，使用未经处理的捐助者为外植体，简单的盐介质中培养的胚胎。这些允许一个测试外植体的内在能力，为exprESS特殊的命运。此方法可以通过实验扩展两种方式。首先，可以在培养基中补充有信令/生长因子，来测试是否这些分子可以引起外植体来表达替代的命运。第二，无论是基因（增益功能）或反义吗啉代寡核苷酸（损失函数）注入特定前体卵裂球的解剖前的囊胚可以改变基因的表达。这是可以做到的1 - 细胞期，或更有针对性地在解剖前的1-2个细胞分裂。通过这些方法，可以测试是否提供一个特定的外源基因会导致胚胎细胞，获得一个备用的命运，或特定内源基因是否是必要的卵裂球，以表示其自主的命运（ 例如 ， 图4B）。这是强大的实验方法，因为它们消除的干扰影响其他细胞的信号CE完整的胚胎nters目前。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢GWU哈伦为支持蒙娜丽莎埃罗尔德的支持格兰特Paaqua和GWU·路德·赖斯奖学金的奖学金。这项工作是由美国国家科学基金会的资助MCB-1121711。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
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