Summary
Het lot van een individuele embryonale cel kan worden beïnvloed door erfelijke moleculen en / of signalen van naburige cellen. Gebruik te maken van het lot kaarten van de splitsing podium Xenopus embryo, kan enkel blastomeren worden geïdentificeerd voor cultuur in isolatie om de bijdragen van erfelijke moleculen te beoordelen ten opzichte van cel-cel interacties.
Abstract
Fate kaarten opgebouwd uit stam tracering alle cellen van een embryo, blijkt dat weefsels afstammen van elke cel van de embryo. Hoewel lot kaarten zijn zeer nuttig voor het identificeren van de voorlopers van een orgaan en voor het ophelderen van de ontwikkelingstraject waarbij de afstammeling cellen die organen bevolken de normale embryo, ze illustreren de volledige ontwikkelingspotentieel van een precursor cel of identificeren mechanismen waarmee het lot bepaald. Om te testen voor lot van de cel inzet, men vergelijkt een cel normale repertoire van nakomelingen in het intacte embryo (het lot kaart) met die uitgedrukt na een experimentele manipulatie. Is de cel het lot bepaald (vastgelegd), ongeacht de omringende cellulaire omgeving, of is het beïnvloed door externe factoren die door zijn buren? Met behulp van de uitgebreide lot kaarten van de Xenopus embryo beschrijven we hoe te identificeren, isoleren en cultuur een decollete stadium precursoren, genoemd blastovennen. Deze benadering maakt het mogelijk om te beoordelen of deze eerste cellen zijn toegewijd aan het lot zij in hun normale omgeving verwerven in het intacte embryo vereisen interacties met naburige cellen, of kan worden beïnvloed alternatieve lot drukken bij blootstelling aan andere soorten signalen.
Introduction
Xenopus laevis embryo's zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen die embryonale cellen krijgen hun specifieke lot omdat hun eieren groot genoeg om microchirurgische benaderingen mogelijk identificeren. Bovendien ontwikkelen ze buiten zonder voedingssupplementen van het kweekmedium omdat elke cel een rijke intracellulaire levering van dooier bloedplaatjes die een intrinsieke energie store. Een belangrijk voordeel voor het bestuderen van de mechanismen waarmee lot van de cel wordt bepaald is een uitgebreide reeks lot kaarten van de splitsing fase blastomeren (van 2 - tot 32-cell fasen) 1, 2, 3, 4, 5, 6. De kaarten werden geconstrueerd door microinjecting een detecteerbaar molecuul in een, identificeerbaar blastomeer en controle later in ontwikkeling die weefsels worden bevolkt door de gemerkte nageslacht. Consistent lot kaarten zijn mogelijk omdat de kardinaal assen van de embryo betrouwbaar kan worden geïdentificeerd in vele Embryos. Ten eerste, in alle wild-type embryo's het dier halfrond is gepigmenteerd, terwijl de plantaardige halfrond is het niet. Anderzijds de ingang van het sperma bij bevruchting vindt een contractie van het dier halfrond pigmentatie naar de toekomst buikzijde, in veel embryo's een pigmentatie verschil kan daarom gebruikt worden om onderscheid te maken tussen dorsale en ventrale kanten. Derde, de eerste splitsplek vore benadert het sagittale middenvlak in de meeste embryo's, en kan dus worden gebruikt om de rechter-en linkerzijde van de embryo identificeren. Het lot kaarten zijn ook afhankelijk van het feit, dat op natuurlijke wijze bevruchte eieren vaak aankleven in regelmatige patronen die elke blastomeer identificeerbare over een grote populatie van embryo's. Hoewel er variabiliteit binnen en tussen legsels van eieren ten aanzien van pigmentatie en decollete patronen, met behulp van selectieprocedures die hierin worden beschreven kunnen cellen met voorgeschreven lot te worden geïdentificeerd met ongeveer 90% nauwkeurigheid.
Celtypes kunnen afschrikkenbepaald tijdens embryogenese door verschillende mechanismen. Intrinsieke factoren, zoals erfelijke differentieel cytoplasmatische mRNA of eiwitten, bijdragen tot verschillende aspecten van vroege patronen. Bijvoorbeeld specifieke maternale mRNA bepalen welke cellen bijdragen aan de kiemlijn, worden de endoderm, of bijdragen aan de dorsale lichaamsas (beoordeeld in 7). Extrinsieke factoren lokaal door naburige cellen of verder af van een embryonale signalering centrum verantwoordelijk voor het induceren van specifieke weefselsoorten en patroonvorming vrijwel elk orgaansysteem. Voorbeelden van signalering centra zijn ook de organisator / node in de gastrula dat de neurale ectoderm en patronen het mesoderm induceert, en de zone van polariserende activiteit die patronen van de anterior-posterior as van de ledematen. Hoewel lot maps identificeren voorlopers van de verschillende organen en onthullen de ontwikkeling weg die hun nakomelingen in normale embryo, kunnen ze geen onderscheid tussen intrinsiekeen extrinsieke invloeden op deze cellen. Ook blijkt dat er geen volledige ontwikkeling van een cel, die nakomelingen differentiëren in het complex signaleren omgeving van de embryo. Twee experimentele benaderingen kunnen testen of een cel lot bepaald door intrinsieke factoren of daarna beïnvloed door externe factoren: 1) transplantatie van de cel naar een nieuwe locatie in het embryo, of 2) verwijderen van de cellen van de embryo, gevolgd door kweek in afwezigheid van exogeen signalen.
Beide experimentele benaderingen zijn mogelijk in Xenopus omdat de cellen groot genoeg om handmatig gescheiden. Zo hebben vele studies verwijderd enkele cellen van embryo's (tot cel-cel interacties veranderen) of getransplanteerde cellen op nieuwe plaatsen in ontvangende embryo's testen lot veranderingen (beoordeeld in 7, 8, 9). Bovendien de tweede benadering van explanteren kleine aantallen cellen van verschillende gebieden van de embryo into cultuur inductieve weefsel interacties in de afwezigheid van exogene factoren verduidelijken is mogelijk omdat de cellen van het Xenopus embryo zijn gevuld met een intracellulaire voedingsstof store, de dooier bloedplaatjes. Daarom kunnen ze worden gekweekt een paar dagen in een gedefinieerd medium zonder zout nutritioneel of groeifactor aanvulling van het kweekmedium. Wij hebben deze benadering te laten zien dat dorsale dier blastomeren een autonome vermogen om neurale en dorsale mesodermale weefsels door maternaal overgeërfd mRNAs 10, 11 produceren en anderen aangetoond dat mesoderm specificatie van 32-cell blastomeren gebeurt zowel intrinsieke als extrinsieke informatie 12 . Een voordeel van het kweken van cellen als explantaten is dat het medium ook kan worden aangevuld met gedefinieerde signaalfactoren te bepalen welke cel-tot-cel communicatie pathway kan het lot van de geëxplanteerde cel 12, 13, 14 beïnvloeden. Daarnaast kan men injecteren de blastomeer prior om cultuur mRNA tot overexpressie een gen, of anti-sense oligonucleotiden de vertaling van endogene mRNA's te voorkomen. Deze, winst-en verlies-van-functie analyses kunnen bepalen welke moleculen nodig zijn voor een autonoom uitgedrukt lot. Het lot van het explantaat te analyseren, kan de identificatie van specifieke celtypen worden uitgevoerd door standaard genexpressie (bijvoorbeeld in situ hybridisatie, RT-PCR) en immunocytochemische assays. Dit protocol biedt een eenvoudige, maar krachtige, manier om onderscheid te maken tussen intrinsieke en extrinsieke mechanismen die regelen hoe een embryonale cel zich ontwikkelt tot specifieke weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Media en Gerechten
- Verscherpen vier tang met behulp van Alumina schurende film. Doe dit onder een dissectiemicroscoop aan het uiteinde formaat te controleren. Een pincet dient als back-up bij een tip wordt beschadigd tijdens de procedure. Autoclave vier forceps en bewaar in een steriele container.
- Maak 500 ml elk van 0,1 x en 1,0 x kweekmedium (ofwel Marc's gemodificeerd Ringers [MMR] of zoutoplossing Gewijzigd Barth's [MBS]; recepten in 15) en filter steriliseren. We routinematig gebruik MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO3). Bewaren bij 14-18 ° C gedurende maanden.
- Een 2% agarose oplossing in kweekmedium (2 g agarose elektroforese gehalte in 100 ml 1X kweekmedium in een schroefdop glazen fles). Autoclaaf agarose op te lossen. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maanden en magnetron de agarose vloeibaar wanneer het volgende nodig.
- Terwijl de agarose vloeibaar, giet ongeveer 0,5 ml op de bodem van elk putje van een steriele 24-putjes kweekplaat. Dit voorkomt dat de explantaten kleven aan het plastic.
- Terwijl de agarose is vloeibaar, giet ongeveer 2-3 ml op de bodem van twee tot drie 60 mm petrischalen, en schud zachtjes te zorgen dat de bodem bedekt is. Deze zullen als dissectie gerechten en de agarose voorkomt embryo kleven aan het plastic als hun membranen worden verwijderd.
- Wanneer de agarose afgekoeld en gehard, vlam het uiteinde van een 6 "Pasteur pipet tot het smelt tot een bal, en licht aanraken van het oppervlak van de agarose in elk putje van de kweekplaat. Hierdoor ontstaat een ondiepe depressie waarin het explantaat wordt geplaatst.
- Vul elk putje van de cultuur plaat met 1X steriel kweekmedium.
- Wanneer de agarose is afgekoeld en verhard, vul de dissectie schotel met verdunde kweekmedium (0,1 x 0,1 x MMR of MBS) naar blastomeer scheiding te vergemakkelijken.
2. Selectie van embryo
- Verkrijgen bevruchte eieren en verwijder de gelei lagen volgens standaardprotocollen 15. Overbrengen naar 0.5X kweekmedium in een 100 mm petrischaal.
- Als embryo's de 2-cel stadium bereiken, sorteren die waarin de eerste splitsing doorkruisen het licht gepigmenteerde gebied in het dier halfrond (figuur 1) snijdt in een aparte schaal. Dit zullen de donoren voor de explantaten. Het resterende 2-cellige embryo's in een apart schaaltje naast de donor embryo gedurende de procedure om te dienen als controles om de sibling explantaten fase.
3. Bereiding van explantaten
- Plaats 5 tot 10 embryo's in een dissectie schotel, maar alleen op een embryo te werken op een moment.
- Plaats de eerste embryo zodat het doorzichtige vitelline membraan kan worden gezien, is gescheiden door een ruimte (perivitelline space) boven het oppervlak van de animale pool van de embryo. Met een geslepen forceps in je subdominant hand (linkerhand als men recht wordt overhandigd), pakt de vitelline membraan boven de perivitelline ruimte. Met een geslepen forceps in de andere hand het membraan als de eerste forceps tip en voorzichtig in tegengestelde richtingen trekken te pellen het membraan weg. Het begin-greep op een afstand van de cel die wordt ontleed, waardoor de doelcel niet beschadigd tijdens het verwijderen van het membraan. Men kan zeggen dat het membraan is verwijderd omdat het embryo zal afvlakken.
- Pak een naburige cel met de tang in de subdominant hand en gebruik deze cel als een "handvat", zodat de cel te worden ontleed wordt niet direct geraakt. Met een pincet in de andere hand voorzichtig trek de resterende aangrenzende cellen van de gewenste blastomeer. Als middellijn cellen, die hetzelfde lot delen, gericht, kunnen ze worden verwijderd samen als een paar. Tot slot, ontleden weg het "handvat" cel.
- Ophalen blastomeer (of blastomeer pair), met een steriele, Glas Pasteur pipet, het vermijden van luchtbellen en overmatige afzuiging. De pipet kan brand-gepolijst om scherpe randen die de cel kunnen beschadigen te verwijderen, maar we weten niet routinematig doen. Plaats de punt van de pipet Pasteur onder het oppervlak van het kweekmedium in een putje van het explantaat kweekschaal en voorzichtig verdrijven de blastomeren. Het moet schuiven in de ondiepe depressie door de zwaartekracht. Dezelfde blastomeer van meerdere embryo kunnen worden gecombineerd tot een explantaat.
- Herhaal deze procedure met de overige embryo's in de dissectie schotel, een voor een. Na ongeveer 10 embryo wordt de dissectie schaal gevuld met celresten. Wanneer dit gebeurt, te wijzigen in een nieuwe dissectie schotel.
- Nadat alle dissecties worden gedaan, na te gaan of de explantaten zijn in de ondiepe depressies. Zo niet, kunnen ze voorzichtig worden geduwd in de depressie met een haar lus die is gesteriliseerd in 70% ethanol en luchtgedroogd.
- Ongeveer een uur na de laatste dissectie, verwijder vuil surrounding de genezen explantaten met een steriele glazen Pasteur pipet.
- Cultuur de plaat van explantaten bij 14-20 ° C naast de petrischaal die de sibling, controle-embryo's. Sibling embryo's geeft de fase van ontwikkeling van de blastomeer explantaten.
4. Oogsten Explantaten voor Analyse
- Oogst de explantaten als de broers en zussen het gewenste ontwikkelingsstadium. Deze explantaten overleven heel goed, zelfs als een deel van de cellen uit elkaar vallen. Daarom kan een bewolkte massa in de cultuur goed ontdekken die een haar loop of forceps te bepalen of een gezond explantaat begraven binnen.
- Ophalen explantaten in een klein volume van cultuur met glazen Pasteur pipet en voorzichtig te drijven in een fixeermiddel of lysis buffer geschikt voor de assay worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vermogen van deze assay goed te beoordelen ontwikkeling van de cel berust op de juiste ontleden blastomeer gebaseerd op het lot kaarten 1, 2, 3, 4, 5, 6. Daarom is het essentieel om embryo's te kiezen met de juiste pigmentatie patroon op de 2-cel stadium, zoals geïllustreerd in figuur 1, die vervolgens overeenstemming regelmatig splitsingspatronen, zoals geïllustreerd in figuur 2. Als men neemt de gesorteerd embryo's bij het bereiken van de vereiste decollete podium en scheidt de embryo's met onregelmatige breuklijnen, wordt de nauwkeurigheid sterk verbeterd. Zoals geïllustreerd in figuur 2, regelmatige splitsingen vaak enkel op een zijde van het embryo. Deze embryo's kunnen worden gebruikt als donors als de donor cel afkomstig van het "gewone" zijde. Omdat regelmatige decollete patronen zijn te vinden in minder embryo's als celdeling verloopt, sorteren ongeveer vijf keer zoveel embryo's als u van plan bent te ontleden. Natuurlijk fertilized eieren de neiging om meer regelmatige breuklijnen dan in vitro bevruchte eieren hebben. Hoewel splitsingspatronen variëren veel binnen een legsel, kan men verwachten ten minste 10-20% van nut is voor dit soort manipulatie.
Blastomeren kunnen worden gekweekt alleen of in kleine groepen. Wanneer blastomeren eerst worden ontleed (figuur 3A), en naar het kweekputje (Figuur 3B, C), zij zacht en fragiel. In onze ervaring, dier en equatoriale blastomeren zijn veel gemakkelijker te ontleden en cultuur dan plantaardige blastomeren (Figuur 3C). Misschien omdat ze kleiner zijn ze gemakkelijker te dragen. Ze lijken ook sneller genezen als gejat met de tang. Plantaardige cellen lijken soms cytokinesis voltooien langzamer en dus cytoplasmatische bruggen houden met zuster cellen, waardoor ze meer "leaky" wanneer ontleed en hun celmembraan is kwetsbaar en sneller beschadigd.Na ongeveer 1-2 uur in cultuur, de geëxplanteerde blastomeer (s) zijn verdeeld over 4 keer en afgeworpen meeste vuil resterende van beschadigde naburige cellen (Figuur 3D). Na 20 uur, vormen ze kleine, stevige bolletjes cellen (figuur 3E). Terwijl sommige kunnen worden begraven in puin, vaak een gezonde massa kan worden gevonden (figuur 3E, links).
Hoewel de explantaten zijn klein en overleven verwerkt voor in situ hybridisatie en het meer gebruikelijke dierlijke cap explantaten, waarmee men later volgen genexpressie. In het experiment weergegeven in Figuur 4A, werden twee dorsale blastomeren (D1.1) of twee ventrale blastomeren (V1.1) ontleed op de 16-cel stadium en gekweekt in 1X MBS bij 14 ° C totdat sibling embryo bereikt vroege neurale plaat stadia (ST12-13; ongeveer 20-22 uur na ontleden). Elk monster werd getest op de expressie van een gen zygotische neurale plaat (SOX2 </ Em>) door in situ hybridisatie (de blauwe reactieproduct). Dit onderzoek toont dat de meeste dierlijke dorsale blastomeren, die voorlopers zijn van de neurale plaat kan SOX2 autonoom uitdrukken, dat wil zeggen zonder extra signalering vanuit andere gebieden van de embryo. Deze explantaten die niet tot expressie SOX2 niet goed is vastgesteld ten tijde van dissectie. Daarentegen geen van de ventrale dier blastomeren van precursoren van de ventrale epidermis, express SOX2. Zo concluderen we dat dorsale dier blastomeer een intrinsieke vermogen om zenuwweefsel te vormen, terwijl de ventrale dier blastomeren niet. Merk op dat sommige van de D1.1 explantaten ook eIongated, een morfologie indicatief dorsale mesoderm vorming, deze blastomeren ook aarde het notochord vormen in het intacte embryo 3, met explantaatkweek express a notochorda merkereiwit 10. Blastomeer intrinsieke lot kan Altere d vooraf microinjectie van mRNA (gain-of-function) of anti-sense oligonucleotiden morfolino (Mos loss-of-function). In Figuur 4B wordt het effect van het veranderen van de endogene niveaus van maternaal expressie neurale gen foxD5 16, 17, getest. Wanneer het endogene niveau van FoxD5 verhoogd door het injecteren foxD5 mRNAs in de 8-cell precursor blastomeren van V1.1 (onderste rij), de meerderheid van de explantaten V1.1 (gekweekt tot st 12-13) uitgedrukt SOX2. Omgekeerd, wanneer de endogene niveau van FoxD5 werd verminderd door injectie van MO in de 8-cell precursor blastomeren van D1.1 (bovenste rij), enkele D1.1 explantaten (gekweekt tot st 12-13) uitgedrukt SOX2 (vergelijk bovenste rij van figuur 4A). Deze experimenten geven aan dat de expressie van maternale foxD5 een rol speelt in het intrinsieke vermogen van dorsale blastomeren een neuraal lot verwerven.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Pigmentatie patronen in 2-cellige embryo's van natuurlijk bevruchte eieren. De eerste splitsplek voor wordt aangegeven door een pijl. A) Een voorbeeld van een embryo dat niet moet worden gebruikt om te identificeren blastomeren in latere stadia omdat het licht gepigmenteerde van het dier halfrond van de embryo wordt meestal in een cel (links). Aangezien de eerste splitsplek vore voorspelt het sagittale middenvlak van het embryo, de licht gepigmenteerde gebied van deze embryo niet identificeren rug. B) Twee voorbeelden van embryo's die moeten worden gesorteerd voor explantatie culturen. In beide, wordt het licht gepigmenteerd van het dier halfrond (*) doorsneden door de eerste splitsplek groef. De embryo links is vroeg in de eerste celcyclus en de licht gepigmenteerde regio is alleen zichtbaar in ongeveer 25% van het celoppervlak. De embryo rechts nadert het einde van de eerste celcyclus en het pigment is verplaatst ventrally zodat de dorsale helften van de twee cellen lichter. Dientengevolge, in een later stadium het licht gepigmenteerde dierlijke cellen voorspelt dorsale (d) en donker gepigmenteerde dierlijke cellen voorspelt ventrale (v).
Figuur 2. Voorbeelden van splitsing embryo's van natuurlijk bevruchte eieren. Alle embryo's zijn georiënteerd met de animale pool naar de lezer, dorsaal van de top. A) 4-cellige embryo's. Het embryo aan de linkerzijde heeft zojuist de tweede cel cyclus, zodat de splitsing voren oppervlakkig zijn. Het embryo aan de rechterkant is bijna voltooide de tweede cel cyclus, zodat de splitsing voren zijn dieper en de cellen lijken afgerond. Zwarte pijlen wijzen naar de eerste splitsing voor, en rode pijlen wijzen naar de tweede splitsplek groef. B) 8-cellige embryo's. De embryo links is begin is de derde celcyclus en de embryo rechts is dichtbijhet einde van de derde celcyclus. C) 16-cellige embryo's. C 'is een voorbeeld van onregelmatige splitsingen te vermijden. C "is een voorbeeld van regelmatige splitsingen aan de buikzijde, maar onregelmatig op de rugzijde. C'' 'is een voorbeeld van regelmatiger splitsingen aan de rugzijde, maar niet op buikzijde.'''' C is een voorbeeld regelmatige splitsingen bij de middellijn, maar niet zijdelings. D) 32-cellige embryo's. D 'is een voorbeeld van regelmatige splitsingen aan de buikzijde, maar onregelmatig op de rugzijde.'' D is een voorbeeld van regelmatige splitsingen op de dorsale side, maar niet op buikzijde. D'' 'is een voorbeeld van regelmatige splitsingen aan de rechterkant, maar onregelmatige breuklijnen aan de linkerkant. E) 64-cellige embryo. Voor een schematische weergave van deze fasen zie de Nieuwkoop en Faber enscenering serie, die kan worden gevonden on-line ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Figuur 3. Explantaten van 16-cellige embryo's van natuurlijk bevruchte eieren. A) Een ventrale dier blastomeer kort na dissectie. Pijl vertegenwoordigt overblijfselen van de "handle" cel. B) Een ventrale dier blastomeer overgebracht naar een cultuur goed dat eenmaal heeft verdeeld. C) Een ventrale vegetale blastomeer kort na dissectie. Vergeleken met dier blastomeren zijn groter en moeilijk te manipuleren. D) Twee ventrale dier blastomeer explantaten, 2 uur na sectie hebben verdeeld over vier keer. De linker explantaat vanuit de oorspronkelijke, gepigmenteerde buitenoppervlak van de blastomeer, recht explantaat vanuit de oorspronkelijke, ongepigmenteerde binnenoppervlak van de blastomeren. E) Twee ventrale dier blastomeer explantaten gekweekt gedurende 24 uur. De linker explantaat zit in een bed van cellulaire puin (pijlen) overwegende dat het recht explantatie is vrij van afval. Alle afbeeldingen zijn op 50X magnification.
Figuur 4. In situ hybridisatie-analyse van genexpressie in explantaten uit 16-cell blastomeren geprepareerd uit natuurlijk bevruchte eieren. A. De 16-cellige embryo links illustreert de dorsale blastomeer paar (D1.1) dat de resultaten in geëxplanteerd de bovenste rij, en de ventrale blastomeer paar (V1.1) dat werd geëxplanteerd voor de resultaten in de onderste rij. Ontleed blastomeer paren van niet-geïnjecteerde embryo's werden in 0,1 X MBS in kweekputjes en geïncubeerd bij 14 ° C gedurende 20 uur. Ze werden verzameld in buisjes fixeermiddel en verwerkt door in situ hybridisatie voor expressie van een zygote neurale gen SOX2. B. Blastomeren van 8-cellig stadium embryo's werden bilateraal hetzij geïnjecteerdmet foxD5 MO's, aan endogene expressie te verminderen in dorsale blastomeren, of met foxD5 mRNA aan endogene expressie te verhogen in ventrale blastomeren. Wanneer de geïnjecteerde embryo's de 16-cellig stadium (20-30 min later) bereikten, werden blastomeer pairs ontleed, gekweekt en geanalyseerd door in situ hybridisatie, zoals in A. Het aantal explantaten die uitdrukking SOX2 aanzienlijk wordt verminderd in D1.1 explantaten die werden geïnjecteerd met foxD5 MO's (te vergelijken met bovenste rij in A). Het aantal explantaten die uitdrukking SOX2 aanzienlijk wordt verhoogd in V1.1 explantaten die werden geïnjecteerd met foxD5 mRNA (te vergelijken met onderste rij in A). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste stappen voor een succesvolle kweken van afzonderlijke blastomeren zijn: 1) het identificeren van de juiste plaats blastomeer, 2) het behoud van een steriele, gezonde cultuur 3) ontleden cellen op het juiste deel van de celcyclus en 4) de noodzakelijke handmatige behendigheid om beschadiging tijdens dissectie en goed te dragen aan de cultuur.
Te manipuleren specifieke blastomeren is essentieel om de assen kardinaal identificeren. In Xenopus embryo kan de rugzijde worden geïdentificeerd volgens drie methoden: (1) het sperma gemerkt toegangspunt met een vitale kleurstof 18, 19, (2) kantelen in vitro bevruchte eieren en markeren een zijde 18, 19, of (3) selecteren van embryo's in het 2-cel stadium waarin de eerste splitsplek vore snijdt de licht gekleurde gebied in het dier halfrond 20, 21. We de derde methode, die nauwkeurig identificeert blastomeren van natuurlijk fertilized 16-cellige embryo's in ongeveer 90% van de gevallen 20, 21. Bij bemesting het dier halfrond pigmentatie begint contract aan het sperma ingang aan de ventrale zijde, waardoor de dorsale regio dier minder gepigmenteerd in een meerderheid van de embryo (figuur 1). Er zijn aanzienlijke verschillen in de omvang van dit licht gepigmenteerd gebied aan de overkant van koppelingen en zelfs binnen klauwen van Xenopus eieren. Als de eerste splitsing vore snijdt deze lichtere gedeelte gelijkelijk over de twee dochtercellen, dan lichtere gedeelte kan worden gebruikt als indicator van de rugzijde en de eerste splitsplek vore de sagittale middenvlak geven. Als de eerste klieving groef scheidt de dochters in een donkere cel en een lichtcel, gebruik het dan niet voor de explantatie omdat de pigmentatie in een later stadium zal niet nauwkeurig identificeren van de dorsale zijde. Eerdere studies toonden aan dat in dit soort van embryo's de eerste klieving groef bleef een marker voor thij sagittale middenvlak terwijl het licht gepigmenteerd regio niet meer gewezen op de dorsale zijde 20, 21. Embryo's kunnen ook worden geselecteerd op het begin van de 4-cell splitsing (links embryo in figuur 2B), wanneer de eerste en tweede groeven op de vegetatieve pool nog te onderscheiden, de eerste voor volledig moet zijn en de tweede groef niet nog niet compleet. Indien echter een wacht tot het einde van de 4-cellig stadium embryo's (embryo rechts in figuur 2B) selecteert, de eerste en tweede splitsplekken groeven niet meer te onderscheiden, en de licht gepigmenteerde cellen kunnen dorsale die in slechts 70% van de embryo's 20, 21. Dit maakt gericht op specifieke blastomeren veel minder nauwkeurig. Opgemerkt dat het percentage van embryo's waarin de eerste splitsing vore doorsnijdt het licht gepigmenteerde gebied veel over koppelingen varieert. In onze ervaring kunnen vertegenwoordigen <50% van de eieren in een koppeling tot> 80% Van de eieren in een koppeling. Hoe dan ook, er bijna altijd genoeg eieren in een koppeling van gezonde eieren dat dit criterium te voldoen aan een explant experiment te ondersteunen.
De twee aanbevolen kweekmedia (MMR, MBS) zijn vrijwel uitwisselbaar, de voorkeuren van de verschillende labo's zijn meestal historische. MMR kan worden opgeslagen als een 10X oplossing gedurende een jaar of meer. MBS heeft een kortere houdbaarheid omdat het gebufferd met bicarbonaat. Omdat embryo's en explantaten kan een bacteriële infectie bezwijken zonder de beschermende gelei en vitelline membranen, moeten pincet en cultuurmedia steriel zijn. Als explantaten niet goed overleven, kunnen antibiotica worden toegevoegd aan het kweekmedium (bijvoorbeeld 0,1% gentamycine). Oplossingen die gentamicine hebben een korte houdbaarheid, en dus moet worden vers op de dag worden gebruikt. Cellulaire puin bevat proteasen die schade zal toebrengen aan de onbeschermde explantaten, en bevordert de groei van bacteriën. Daarom moet het removed van de cultuur putten nadat de explantaten een kans hebben gehad om te genezen.
Blastomeer dissecties uitgevoerd in verdunde kweekmedium (0,1 x 0,1 x MBS of MMR) om de sterkte van cel-cel adhesie te verminderen. In Xenopus splitsing stadia wordt celadhesie meestal gedaan door calcium-/magnesium-dependent cadherinen. Daarom is het niet nodig om enzymatische dissociatie gebruiken, in feite moet worden vermeden omdat het verwijdert oppervlakte-eiwitten die van belang zijn lot bepalen events. Omdat embryonale cellen van verschillende partijen van eieren houden met verschillende sterktes, kan de verdunning van de dissectie medium moeten worden aangepast op een ad hoc basis. Als de cellen te adherent te ontleden zonder scheuren ze verlagen de concentratie van de dissectie medium stapsgewijs uit 0,1 x. Omgekeerd, als de cellen uit elkaar vallen wanneer de vitelline membraan verwijderd en zeer lekkende, de concentratie van de dissection medium stapsgewijs. Echter, geen gebruik maken van calcium-/magnesium-free media, omdat de cellen te kwetsbaar om over te dragen aan de cultuur putten. Succesvolle scheiding van blastomeren hangt ook wanneer tijdens de celcyclus een voert de dissectie. Zoals getoond in figuur 2, vroeg in de celcyclus de splitsing groeven zijn ondiep en de blastomeren worden afgevlakt. Later in de cyclus de splitsing groeven dieper en de cellen zijn afgerond. Vroeg in de celcyclus, er cytoplasmatische bruggen cytoplasmatische lekkage veroorzaken als gebroken. Daarom worden cellen gemakkelijker ontleed laat in de celcyclus. 4-cellige embryo's, 8-cellige embryo's en plantaardige cellen in alle stadia moeilijker te ontleden omdat de cytoplasmatische bruggen bestaan langer. Men kan anticiperen op een hoog sterftecijfer voor deze explantaten, wat betekent dat men moet meer dissecties van een redelijke steekproef terug te voeren. Men kan wachten tot het begin van de volgende splitsing groef aan de Disse beginnenctie van deze cellen dat de cytoplasmatische bruggen gesloten. Terwijl enkele blastomeren uit 8 - en 16-cellige embryo's overleven goed in cultuur, in onze ervaring ouder blastomeren tarief minder goed als enkele cellen. Hoewel we niet weten de oorzaak hiervan kan overleving van oudere blastomeer explantaten worden verbeterd door het ontleden verscheidene (2-6) van hetzelfde blastomeer uit verschillende embryo's en kweken ze samen in een kweekputje 10, 13, 14.
Deze procedure vereist oefening en een aantal handvaardigheid. Omdat de tijd tussen breuklijnen temperatuurafhankelijk is, is het handig om embryo bewaren bij 14-16 ° C te vertragen splitsing en meer tijd om dissecties uitvoeren kunnen. Echter, embryo's niet tolereren temperaturen lager dan 14 ° C. De eerste uitdaging in deze procedure is het verwijderen van de vitelline-membraan. Het is het beste niet om over te gaan naar blastomeer dissectie tot deze eerste stap wordt beheerst. Bij het ontleden vande blastomeer, het "handvat" cel is de kans op lekkage en uiteen te vallen. Dit is geen probleem omdat als alle andere cellen worden afgepeld van de gewenste cel, kan het "handvat" cel worden verwijderd met een pincet. De handgreep cel overblijfselen en ander materiaal gewoonlijk wegvallen wanneer de blastomeer overgebracht naar het kweekputje (Figuur 3B). Blastomeren houden gretig om plastic, dus gebruik alleen glazen pipetten over te dragen. Gebruik minimale zuigen druk op de cel omdat het kan uiteenvallen door de afschuifkrachten in de pipet. Vermijd ook luchtbellen in de pipet en zorg ervoor dat de punt van de pipet is onder het oppervlak van het kweekmedium als de explantatie is verdreven, omdat cellen zullen exploderen als ze aanraken van een lucht-water grensvlak.
Het protocol hier beschreven gebruikt ongemanipuleerde embryo's als donor voor de explantaten en eenvoudige zout media voor het kweken. Deze doen vrezen intrinsieke vermogen van het explantaat testen express bijzonder lot. Deze methode kan experimenteel worden uitgebreid op twee manieren. Ten eerste kan het kweekmedium aangevuld met signalering / groeifactoren te testen of deze moleculen kan de explant alternatieve lot drukken. Ten tweede kan de genexpressie van de donor embryo worden veranderd door het injecteren ofwel mRNA (gain-of-function) of anti-sense oligonucleotiden morfolino (loss-of-function) in specifieke precursors voor blastomeer dissectie. Dit kan op de 1-cel stadium of in gerichter bij 1-2 celdelingen vóór dissectie. Met deze aanpak kan men testen of een bepaalde exogeen geleverd gen een blastomeer een alternatieve lot verkrijgen veroorzaakt, of een bepaalde endogene gen is noodzakelijk voor de blastomeer zijn autonome lot drukken (bijvoorbeeld Figuur 4B). Dit zijn krachtige experimentele benaderingen, omdat ze elimineren de verstorende invloed van de andere cellen en signalering centers aanwezig in het intacte embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de GWU Harlan Fellowship erkennen voor de ondersteuning van Paaqua Grant en de GWU Luther Rice Fellowship voor ondersteuning van Mona Herold. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation subsidie MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
