Summary
גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.
Abstract
מפות גורל, שנבנו משושלת התחקות כל התאים של עובר, לחשוף אילו רקמות לרדת מכל תא של העובר. למרות שמפות גורל הן מאוד שימושיות לזיהוי המקדים של איבר והבהרת נתיב התפתחות שבאמצעותו את תאי הצאצא לאכלס איבר שבעובר הנורמלי, הם לא להמחיש את הפוטנציאל ההתפתחותי המלא של תא מבשר או לזהות את המנגנונים שבאמצעותם גורלו נקבע. כדי לבדוק את מחויבות גורל תא, אחד משווה רפרטואר הרגיל של תא של צאצאים בעובר ללא פגע (מפת הגורל) עם אלה הביעו אחרי מניפולציה ניסויית. האם גורלו של התא קבוע (מחויב) ללא תלות בסביבה התאית שמסביב, או שהוא השפיע עליו על ידי גורמים חיצוניים הניתנים על ידי שכנותיה? שימוש במפות הגורל המקיפות של עובר Xenopus, אנו מתארים כיצד לזהות, לבודד ומבשרי שלב ביקוע בודד תרבות, הנקרא blastoשכירי חרב. גישה זו מאפשרת לאדם להעריך אם התאים האלה מוקדם מחויבים לגורל שהם רוכשים בסביבת הרגילה שלהם בעובר ללא פגע, דורשים אינטראקציות עם תאי שכניהם, או יכולים להיות מושפע להביע גורלות חלופיים אם נחשפו לסוגים אחרים של אותות.
Introduction
עוברי Xenopus laevis כבר נוצל בהרחבה כדי לזהות את המנגנונים שבאמצעותם תאים עובריים לרכוש הגורלות הספציפיים שלהם, כי הביצים שלהם הן גדולות מספיק כדי לאפשר גישות מייקרו. בנוסף, הם מפתחים חיצוניים ללא צורך בתוספים תזונתיים של מדיום התרבות, מכיוון שכל תא מכיל תאי היצע עשיר של טסיות חלמון המספקות חנות אנרגיה פנימית. נכס חשוב ללימוד המנגנונים שבאמצעותם גורל תא נקבע הוא הסדרה המקיפה של מפות גורל לסטומרים שלב הביקוע (מגיל 2 - באמצעות שלבים 32-תא) 1, 2, 3, 4, 5, 6. מפות אלה נבנו על ידי microinjecting מולקולת זיהוי לblastomere אחד מזוהה וניטור בהמשך פיתוח רקמות אשר מאוכלסות על ידי הצאצאים שהכותרת. מפות גורל עקביות הן אפשריות, כי צירי היסוד של העוברים ניתן לזהות באופן אמין באמברי רבמערכת הפעלה. ראשית, בכל עוברי סוג בר אונת החיה היא פיגמנט, ואילו בחצי הכדור הצמחי הוא לא. שנית, כניסתו של הזרע בהפריה גורמת להתכווצות של פיגמנטציה אונת הבהמה לצד הגחוני העתיד; בעוברים רבים הבדל פיגמנטציה ולכן ניתן להשתמש בו כדי להיפלות בין צדדי גב וגחון. שלישית, מחשוף התלם הראשון הקרוב למטוס באמצע sagittal ברוב העוברים, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הצדדים הימניים ושמאליים של העובר. מפות הגורל מסתמכות גם על העובדה שלעתים קרובות ביצים מופרות באופן טבעי לדבוק בדפוסים קבועים שהופכים כל blastomere זיהוי פני אוכלוסייה גדולה של עוברים. אמנם יש שונות בתוך ובין ציפורניה של ביצים לגבי דפוסי פיגמנטציה ומחשוף, תוך שימוש בהליכי בחירה מתוארת כאן מאפשר לתאים עם גורל שנקבע להיות מזוהים עם כ 90% דיוק.
גורל תא ניתן להרתיעממוקש במהלך התפתחות עוברת במספר מנגנונים שונים. גורמים פנימיים, כגון mRNAs או חלבוני cytoplasmic ירושה באופן דיפרנציאלי, לתרום למספר היבטים של דפוסים מוקדמים. לדוגמה, mRNAs האימהי הספציפי לקבוע אילו תאים יתרמו לשורת הניבט, הפכו האנדודרם, או לתרום לציר הגוף הגבה (סקר ב7). גורמים חיצוניים הניתנים באופן מקומי על ידי תאים סמוכים או יותר מרחק ממרכז איתות עוברית, אחראים לגרימת סוגים ספציפיים של רקמות ודפוסים כמעט בכל מערכת איברים. דוגמאות למרכזי איתות כוללות מארגן / הצומת בgastrula שגורם לאקטודרם ודפוסים העצביים מזודרם, והאזור של קיטוב פעילות שדפוסי הציר קדמי-האחורי של ניצן הגפה. למרות שמפות גורל לזהות את הסימנים המקדימים של איברים השונים ולחשוף את נתיב התפתחות נלקח על ידי צאצאיהם בעובר הנורמלי, הם לא יכולים להבחין בין מהותייםוהשפעות חיצוניות על תאים אלה. הם גם לא לחשוף את הפוטנציאל ההתפתחותי המלא של תא, שצאצאיו להבחין בסביבה המורכבת האיתות של העובר. שתי גישות ניסיוניות יכולות לבדוק אם גורלו של תא נקבע על ידי גורמים פנימיים או בהמשך מושפע מגורמים חיצוניים: 1) השתלה של התאים למיקום רומן בעובר, או 2) הסרת התא מהעובר ואחרי התרבות ב היעדר אותות חיצוניים.
שתי הגישות הניסיוניות שהיו אפשריות בXenopus כי התאים הם גדולים מספיק כדי להיות מופרד באופן ידני. לדוגמה, מחקרים רבים שמחקו תאים בודדים מעוברים (לשנות אינטראקציות תא סלולרי) או תאים מושתלים למיקומים חדשים בעוברים מארחים לבדיקת שינויי גורל (שנסקרו ב7, 8, 9). בנוסף, הגישה השנייה של explanting מספר קטן של תאים מאזורים שונים של העובר אניתרבות n כדי להבהיר אינטראקציות רקמות אינדוקטיביים בהיעדר גורמים אקסוגניים אפשרית, כי תאיו של עובר Xenopus מלאות בחנות תזונתית תאית, טסיות החלמון. לכן, הם יכולים להיות מתורבתים לכמה ימים במלח בינוני מוגדר ללא תוספת גורם תזונתית או צמיחה של מדיום התרבות. יש לנו להשתמש בגישה זו כדי להראות כי בעלי חי לסטומרים גב יש יכולת אוטונומית לייצר רקמות עצביות והגבו mesodermal בשל mRNAs ירש אימהי 10, 11, ואחרים הראו שהמפרט של מזודרם לסטומרים 32-סלולריים מסתמך על שניהם מידע פנימי וחיצוני 12 . יתרון של תאי culturing כexplants הוא שהמדיום יכול גם להשלימו עם גורמים המוגדרים איתות כדי לקבוע אילו תא לתא מסלול תקשורת עלולה להשפיע על גורלו של תא explanted 12, 13, 14. בנוסף, ניתן להזריק blastomere יחסי הציבורIOR לתרבות עם mRNA ליותר מ-Express גן, או עם oligonucleotides אנטי תחושה למנוע התרגום של mRNAs אנדוגניים. ניתוחים אלה, רווח והפסד, של הפונקציה יכולים לזהות אילו מולקולות נדרשות לגורל מתבטא בצורה אוטונומית. כדי לנתח את גורל explant, זיהוי של סוגי תאים מסוימים יכול להתבצע על ידי ביטוי גנטי סטנדרטי (למשל, כלאה באתר, RT-PCR) ומבחני immunocytochemical. פרוטוקול זה מספק, בדרך פשוטה, אך רבת עצמה כדי להבחין בין מנגנונים פנימיים וחיצוניים שקובעים איך תא עוברי מתפתח לרקמות ספציפיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מכשירים, מדיה תרבות ומנות
- חידוד 4 מלקחיים באמצעות סרט שוחק אלומינה. האם זה תחת מיקרוסקופ לנתח לפקח גודל הטיפ. זוג אחד של מלקחיים משמש כגיבוי במקרה קצה הניזוק במהלך ההליך. חיטוי כל ארבעת המלקחיים ולאחסן במכל סטרילי.
- הפוך 500 מ"ל כל אחד מתרבות בינונית ו0.1x 1.0x (בין אצבעות השינוי של מארק [MMR] או המלוח [MBS] של השינוי Barth; מתכונים ב15) והמסנן לעקר. אנו משתמשים באופן שגרתי MBS (1X = 88 המ"מ NaCl, 1 mM KCl, 0.7 המ"מ CaCl 2, 1 4 המ"מ MgSO, 5 HEPES מ"מ [pH 7.8], 2.5 המ"מ 3 NaHCO). חנות ב 14-18 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
- הפוך 2% פתרון agarose במדיום התרבות (2 גרם אלקטרופורזה agarose בכיתה בינונית 100 מ"ל 1X תרבות בבקבוק זכוכית פקק הברגה). חיטוי לפזר agarose. זה יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים, וחמם במיקרוגל לנזל agarose כאשר הוא נחוץ הבא.
- בעוד agarose הוא נוזלי, יוצק על 0.5 מ"ל אל תחתיתו של כל אחד גם מצלחת התרבות 24 גם סטרילי. זה ימנע את explants יידבק לפלסטיק.
- בעוד agarose הוא נוזלי, יוצק על 2-3 מ"ל על תחתית 2-3 צלחות פטרי 60 מ"מ, ומערבולת בעדינות כדי לוודא התחתון מכוסה. אלה ישמשו ככלי נתיחה וagarose מונע עוברים יידבקו לפלסטיק פעם הקרומים שלהם יוסרו.
- כאשר agarose מתקרר ומתקשה, להבת קצה 6 "פסטר פיפטה עד שהוא נמס לכדור, ולגעת בו בקלילות על פני השטח של agarose בכל באר של צלחת התרבות. זו תיצור שקע רדוד שלתוכו explant יוצב.
- ממלא כל היטב של צלחת התרבות עם התרבות בינונית 1X סטרילי.
- כאשר agarose מתקרר ומתקשה, למלא את צלחת הנתיחה עם מדיום התרבות מדולל (0.1x MMR או 0.1x MBS) כדי להקל על הפרדת blastomere.
2. בחירה עוברת
- השג ביצים מופרות ולהסיר ריבת המעיילים פי 15 פרוטוקולים סטנדרטיים. להעבירם למדיום 0.5X התרבות בצלחת פטרי 100 מ"מימ.
- כאשר עוברים מגיעים לשלב 2-התא, למיין את אלה שבתלם המחשוף 1 חוצה את האזור קל פיגמנט בחצי כדור החיה (איור 1) לצלחת נפרדת. אלה יהיו התורמים לexplants. שמור את העוברים שנותרו 2-הסלולריים בצלחת נפרדת ליד העוברים התורמים ברחבי ההליך לשרת כפקדי אחים לביים את explants.
3. הכנת explants
- הנח עוברים 5-10 בצלחת לנתיחה, אלא רק לעבוד על עובר אחד בכל פעם.
- מקם את העובר הראשון, כך ניתן לראות את קרום vitelline השקוף; הוא מופרד ברווח ברור (מרחב perivitelline) מעל פני השטח של קוטב החיים של העובר. שימוש בכוח חדדנ.ב. ביד subdominant של אחד (יד שמאל אם נמסר מימין), לתפוס את קרום vitelline מעל שטח perivitelline. באמצעותו מלקחיים מושחזים מצד השני, לתפוס את הממברנה הקרובה לקצה המלקחיים הראשון, ומשוך בעדינות בכיוונים מנוגדים כדי לקלף את הקרום משם. הפוך אחיזה הראשונית במרחק מהתא שהוא להיות גזור, כך שתא המטרה אינו פגום במהלך ההסרה של הקרום. אחד לא יכול להגיד שהקרום הוסר בגלל העובר יהיה לשטח.
- תפוס תא שכן אחד עם מלקחיים ביד subdominant ולהשתמש כתא זה "ידית" ולכן התא שנתח לא נגע באופן ישיר. עם מלקחיים ביד השנייה, משוך בעדינות את תאי השכנים שנותרו מן blastomere הרצוי. אם תאי קו אמצע, שחולקים את אותו גורל, ממוקדים, ניתן להסירם יחד כזוג. לבסוף, תנתח את התא "הידית".
- הרם את blastomere (או זוג blastomere), עם סטרילי, זכוכית פיפטה פסטר, הימנעות בועות אוויר ויניקה מוגזמת. פיפטה יכולה להיות אש מלוטשת כדי להסיר קצוות חדים שיכול לגרום ניזק לתא, אבל לא באופן שגרתי שאנחנו עושים את זה. הנח את קצה פיפטה פסטר מתחת לפני השטח של מדיום התרבות בבאר של מנת תרבות explant, ועדינות לגרש blastomere. זה צריך להחליק לתוך השקע הרדוד על ידי כוח הכביד. אותו blastomere מעובר אחד או יותר ניתן לשלב explant אחת.
- חזור על תהליך זה עם העוברים שנותרו בצלחת לנתיחה, אחד על האחד. לאחר כ 10 עוברים, מנת הנתיחה תהיה מלאה בפסולת תאית. כאשר זה קורה, לשנות לצלחת נתיחה טריה.
- אחרי כל הניתוחים נעשים, לבדוק אם explants הם בשקעים הרדודים. אם לא, הם יכולים להיות דחף בעדינות לתוך הדיכאון עם לולאת שיער שעבר עיקור באתנול ואוויר היבש 70%.
- כשעה לאחר הנתיחה האחרונה, להסיר surrou פסולתnding את explants הגליד עם סטרילי, זכוכית פסטר פיפטה.
- תרבות צלחת explants ב14-20 מעלות צלזיוס בסמוך לצלחת פטרי המכיל אח, עוברי בקרה. עוברי אחים יציינו את שלב ההתפתחות של explants blastomere.
4. Explants קצירה לניתוח
- לקצור את explants כאשר האחים מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. explants אלה ישרוד היטב גם אם חלק מהתאים מתפורר. לכן, אם יש מסה חלקית בתרבות היטב, לחקור אותו בלולאת שיער או מלקחיים כדי לקבוע אם explant בריא הוא קבור בתוכו.
- להרים explants בנפח קטן של תמיסת התרבות עם כוס פסטר פיפטה, ולגרש אותם בעדינות לחוצץ מתאים לבדיקה שתבוצע מקבע או תמוגה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת של assay זה במדויק על מנת להעריך את הפוטנציאל ההתפתחותי של התא מסתמכת על לחתוך רקמות blastomere הנכון מבוססות על הגורל 1 מפות, 2, 3, 4, 5, 6. לכן, חשוב לבחור עוברים עם דפוס פיגמנטציה הנכונה בשלב 2-התא, כפי שמודגם באיור 1, שלאחר מכן להתאים לדפוסי ביקוע רגילים, כפי שמודגמים באיור 2. אם יקיים את העוברים הממוינים כפי שהם מגיעים לשלב המחשוף הנדרש ומפריד את העוברים מראים שסעים סדירים, דיוק הוא השתפר מאוד. כפי שמודגם באיור 2, שסעים רגילים לעתים קרובות להתרחש רק בצד אחד של העובר. עוברים אלה יכולים לשמש כתורמים אם התא התורם מקורו מהצד "הרגיל". בגלל דפוסי ביקוע רגילים נמצאים בעוברים פחות כתמורת חלוקת תא, מיון על פי חמישה עוברים רבים ככל שאתה מתכוון לנתח. באופן טבעי וביצי ertilized נוטות להיות שסעים רגילים יותר מאשר במבחנת ביציות מופרות. אמנם דפוסי ביקוע להשתנות במידה רבה בתוך מצמד בודד של ביצים, ניתן לצפות לפחות 10-20% כדי להיות שימושיים עבור סוג זה של מניפולציה.
לסטומרים יכולים להיות מתורבתים לבד או בקבוצות קטנות. כשהם גזורים לסטומרים ראשונים (איור 3 א), והועברו לתרבות היטב (איור 3 ב, ג), שהם רכים ושבירים. מניסיוננו, בעלי חיים ומשווניים לסטומרים הם הרבה יותר קלים לנתח ותרבות מלסטומרים צמחיים (האיור 3C). אולי בגלל שהם קטנים יותר, הם יותר קלים להעברה. הם גם נראים לרפא מהר יותר כשחתוכות עם המלקחיים. תאים צמחיים לעתים קרובות נראים להשלים cytokinesis לאט יותר ובכך לשמר את גשרי cytoplasmic עם תאי אחות, מה שהופך אותם ליותר "דולף" כשנתח, וקרום התא שלהם הוא שברירי יותר וקל יותר לניזק.לאחר כ 1-2 שעות בתרבות, blastomere explanted (הים) יהיה מחולק על 4 פעמים והשיל מעליה את רוב הפסולת שנותרה מתאים שכנים פגומים (האיור 3D). לאחר 20 שעות, הם יוצרים כדורים קטנים וחסונים של תאים (איור 3E). בעוד שכמה עשוי להיקבר בפסולת, לעתים קרובות המוני בריאה ניתן למצוא (איור 3E, עזב).
למרות explants הם קטנים, הם שורדים עיבוד לכלאה באתר, כמו גם את כובע explants בעלי החיים הנפוצים ביותר, המאפשר לאדם לעקוב אחרי ביטוי גנים. בניסוי שמוצג באיור 4A, שני לסטומרים גב (D1.1) או שני לסטומרים גחון (גרסה 1.1) נותחו בשלב 16-התא ותרבותי ב1X MBS ב14 מעלות צלזיוס עד שעוברי אחים הגיעו לשלבים מוקדמים צלחת עצביים (St12-13; כ 20-22 שעות לאחר ביתור). כל דגימה הייתה assayed לביטוי של גן zygotic עצבי צלחת (Sox2 </ Em>) על ידי כלאה באתר (מוצר התגובה הכחול). assay זה מדגים שרוב לסטומרים גב בעלי חיים, שהם מבשרים של הצלחת העצבית, יכול לבטא Sox2 אוטונומי, כלומר, ללא איתות נוספת מאזורים אחרים של העובר. אלה explants שלא מבטא Sox2 עשוי זוהה באופן שגוי בזמן הנתיחה. לעומת זאת, אף אחד מבעלי חי לסטומרים הגחון, שהם מבשרים של האפידרמיס הגחון, המפורש Sox2. לפיכך, אנו מסיקים כי הגביתי חית blastomere יש יכולת פנימית ליצירת רקמה עצבית, ואילו בעלי חי לסטומרים הגחון לא. שים לב שחלק מD1.1 explants גם eIongated, מורפולוגיה מעידה על היווצרות המזודרם הגבה; לסטומרים האלה גם נגזרו על טופס notochord בעובר השלם 3, ובתרבות explant מפורש חלבון סמן notochord 10. גורל פנימי Blastomere יכול להיות altere ד ידי microinjection המוקדם של mRNAs (רווח-of-פונקציה) או oligonucleotides morpholino אנטי תחושה (MOS; אובדן-of-פונקציה). באיור 4B, ההשפעה של שינוי הרמות אנדוגניים של גן הביע אימהי עצבי, foxD5 16, 17, הוא נבדק. כאשר הרמה אנדוגני של FoxD5 הוגדלה על ידי הזרקת foxD5 mRNAs לתוך לסטומרים המבשרים 8-התא של גרסה 1.1 (בשורה תחתונה), רוב explants הגרסה 1.1 (תרבית לרח 12-13) הביע Sox2. לעומת זאת, כאשר הרמה אנדוגני של FoxD5 הופחתה על ידי הזרקה של MOS לתוך לסטומרים המבשרים 8-התא של D1.1 (שורה העליונה), רק כמה D1.1 explants (תרבית לרח 12-13) הביע Sox2 (השווה ל שורה העליונה של איור 4 א). ניסויים אלה מצביעים על כך שהביטוי האימהי של foxD5 משחק תפקיד ביכולת הפנימית של לסטומרים גב לרכוש גורל עצבי.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
איור 1. דפוסי פיגמנטציה בעוברי 2-תאים מביציות מופרות באופן טבעי. מחשוף התלם הראשון מצוין על ידי חץ. א) דוגמה לעובר שלא אמור לשמש כדי לזהות לסטומרים בשלבים מאוחר יותר כי אזור קלילות פיגמנט של אונת החיה של העובר הוא הכיל בעיקר בתא אחד (מהשמאל). מאז תלם המחשוף 1 מנבא את המטוס באמצע sagittal של העובר, אזור קלילות פיגמנט של עובר כך לא יזהה את הגב. B) שתי דוגמאות של עוברים שצריכות להיות ממוינות לתרבויות explant. בשניהם, בקלילות אזור פיגמנט של אונת החיה (*) הוא חוצה את מחשוף התלם הראשון. העובר בצד השמאל הוא שלב מוקדם של מחזור התא הראשון, ובאזור בקלילות פיגמנט גלוי רק בכ 25% מהשטח של התא. העובר מהימין מתקרב לסיומו של מחזור התא הראשון, ופיגמנט עבר ventrally כך את חצאי הגב של שני התאים הם קלים יותר. כתוצאה מכך, בשלבים מאוחר יותר בתאים של בעלי החיים בקלילות פיגמנט יהיו לחזות הגבו (ד) ותאים של בעלי חי פיגמנט כהה יהיו לחזות גחון (v).
איור 2. דוגמאות לעוברי שלב ביקוע מביציות מופרות באופן טבעי. כל העוברים הם בכיוון עם מוט החיה שעומדת מול הקורא, הגבה לראש. A) בעוברים 4-סלולריים. העובר בצד השמאל נכנס רק מחזור התא השני כך מחשוף התלמים הם רדודים. העובר מהימין כמעט השלים את מחזור התא השני כך מחשוף תלמים עמוקים יותר והתאים מופיעים מעוגלים יותר. חיצים שחורים מצביעים על מחשוף התלם הראשון, וחצים אדומים מצביעים על מחשוף התלם השני. B) עוברים 8-סלולריים. העובר על השמאל מוקדם הוא מחזור התא השלישי והעובר בצד ימין הוא קרוב סופו של מחזור התא השלישי. C) עובר 16-סלולרי. ג 'היא דוגמה לשסעים סדירים להימנע. C "הוא דוגמה לשסעים קבועים בצד הגחון, אבל לא סדיר בצד הגבה. ג''' 'הוא דוגמה לשסעים רגילים יותר בצד הגב, אבל לא בצד גחון. C'''' הוא דוגמה של שסעים קבועים בקו האמצע, אבל לא לרוחב. ד) עובר 32-סלולרי. ד 'הוא דוגמה לשסעים קבועים בצד הגחון, אבל לא סדיר בצד הגבה. ד'' הוא דוגמה לשסעים רגילים על הגב צד, אבל לא בצד גחון. ד'' 'הוא דוגמה לשסעים קבועים בצד ימין, אבל שסעים סדירים יותר בצד השמאל. ה) העובר 64-תא. לייצוג סכמטי של שלבים אלה, עיינו סדרת Nieuwkoop ופייבר הזמני, שניתן למצוא באופן מקוון (http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do).
ge = "תמיד"> 
האיור 3. Explants מעובר 16-תאים מביציות מופרות באופן טבעי. ) Blastomere חית גחון זמן קצר לאחר ניתוח. חץ מציין שרידי התא "הידית". B) blastomere חית גחון הועבר לגם תרבות שמחולקת פעם אחת. ג) blastomere צמחי גחון זמן קצר לאחר ניתוח. בהשוואה לבעלי חי לסטומרים, אלה הם גדולים יותר, וקשים יותר לתמרון. ד) שני explants גחון בעלי החיים blastomere, 2 שעות לאחר נתיחה, חלק כארבע פעמים. Explant השמאל נתפס מהמשטח המקורי, פיגמנט החיצוני של blastomere; explant ימין נצפה מהמשטח המקורי, חסר הצבע הפנימי של blastomere. E) שני explants blastomere בעלי חי גחון תרבית ל24 שעות. Explant השמאל יושב במיטה של פסולת תאית (חיצים) ואילו explant הנכון הוא נקי מכל שאריות. כל התמונות הן ב50x מגניפיקטיון.
איור 4. בניתוח כלאה באתר של ביטוי גנים בexplants נגזר מלסטומרים 16-תא הגזורים מביציות מופרות באופן טבעי. א העובר 16-התא משמאל מדגים את זוג blastomere הגבה (D1.1) שexplanted לתוצאות ב בשורה העליונה, וזוג blastomere גחון (גרסה 1.1) שexplanted לתוצאות בשורה התחתונה. זוגות blastomere גזורים מעוברי uninjected הונחו בMBS 0.1x בבארות התרבות והודגרו ב 14 מעלות צלזיוס במשך כ 20 שעות. הם נאספו בצינורות של מקבע ועובדו על הכלאה באתרו לביטוי של גן עצבי zygotic, Sox2. לסטומרים B. של עוברים בשלב 8-תאים הוזרקו ילטרלי אועם foxD5 MOS, כדי להפחית את ביטוי אנדוגני בלסטומרים גב, או עם foxD5 mRNA להגדיל ביטוי אנדוגני בלסטומרים גחון. כאשר הזריקו את העוברים הגיעו לשלב 16-התא (20-30 דקות מאוחר יותר), זוגות blastomere נותחו, תרבית ונותחו על ידי כלאה באתר כמו ב. מספר explants שמביע Sox2 מצטמצם משמעותי בD1.1 explants שהוזרקו foxD5 MOS (השווה לשורה העליונה ב). מספר explants שמביע Sox2 הוא גדל באופן משמעותי בגרסת 1.1 explants שהוזרקו foxD5 mRNA (השווה לשורה תחתונה ב). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר עבור culturing המוצלח של לסטומרים בודדים הם: 1) כשזיהו את blastomere עניין: 2) שמירה על תרבות סטרילי, בריאה, 3) תאים המפרקים בחלק הנכון של מחזור התא; ו4) פיתוח המדריך לצורך זריזות כדי למנוע הניזק במהלך נתיחה ולהעביר לתרבות טובה.
כדי לתפעל לסטומרים ספציפיים, זה חיוני כדי שתוכל לזהות את צירי הקרדינל. בעוברי Xenopus, הצד הגבה ניתן לזהות לפי שלוש שיטות: (1) מסמן את נקודת כניסת הזרע עם צבע חיוני 18, 19, (2) מפנה במבחנת ביצים מופרות וסימון צד אחד 18, 19, או (3) בחירת עוברים בשלב 2-התא שבו תלם המחשוף 1 חוצה את האזור בקלילות פיגמנט בבעלי החיים 20 אונה, בן 21. אנו משתמשים בשיטה השלישית, שמזהה במדויק לסטומרים מחומר דשן טבעי העוברי ed 16-סלולריים בכ 90% ממקרים 20, 21. בהפריה, פיגמנטציה אונת החיה מתחילה להתכווץ לכיוון נקודת כניסת הזרע בצד הגחון, גרימת אזור החיה הגבה להיות פחות פיגמנט ברוב של עוברים (איור 1). קיימות שונות רבות בהיקף של אזור קלילות פיגמנט זה על פני ציפורניים ואפילו בתוך ציפורני ביצי Xenopus. אם תלם המחשוף 1 חוצה אזור זה קל יותר באופן שווה בין תאי הבת 2, אז שאזור מצית יכול לשמש כאינדיקציה לצד הגבה, ומחשוף התלם הראשון מצביע על המטוס באמצע sagittal. אם תלם המחשוף 1 מפריד את הבנות לתוך תא אפל אחד ותא אור אחד, לא משתמש בו לexplant בגלל הפיגמנטציה בשלבים מאוחר יותר לא לזהות במדויק את הצד הגבה. מחקרים קודמים הראו כי בסוגים אלה של עוברי תלם המחשוף 1 נשאר סמן עבור tהוא מטוס אמצע sagittal אילו אזור קלילות פיגמנט כבר לא הצביע על הצד הגבה 20, 21. עוברים גם ניתן לבחור בתחילת החלק של מחשוף 4-התא (עובר שמאל באיור 2 ב '), כאשר הראשון ושני תלמים בקוטב הצמחי עדיין יכול להיות מכובד; התלם הראשון צריך להיות שלם והתלם השני לא עדיין להשלים. אם, לעומת זאת, נהוג להמתין עד לסיום השלב 4 תאים כדי לבחור עוברים (עובר ימני באיור 2 ב '), מחשוף תלמים הראשון ושני כבר לא יכול להיות מכובד, ותאי פיגמנט קל אלה יכולים להיות רק על גב ב 70% מעוברים 20, 21. הדבר יציג את מיקוד לסטומרים ספציפיים הרבה פחות מדויק. יש לציין כי אחוז העוברים שבתלם המחשוף 1 חוצה את האזור בקלילות פיגמנט משתנה הרבה על פני מצמדים. מהניסיון שלנו שהם יכולים להסביר <50% מהביצים במצמד ל> 80% מהביצים במצמד. בלי קשר, יש כמעט תמיד מספיק ביצים בתוך מקבץ ביצים בריאות שעומדות בקריטריון זה כדי לתמוך בניסוי explant.
שני כלי תקשורת התרבות המומלצות (MMR, MBS) הם כמעט מחליפים אותה: את ההעדפות של מעבדות שונות הן בעיקר הסטוריות. MMR ניתן לאחסן כפתרון 10X לשנה או יותר. MBS יש חיי מדף קצרים יותר, כי הוא נאגר עם סודה לשתייה. בגלל עוברים וexplants יכולים להיכנע לזיהום חיידקים ללא קרומי vitelline הריבה והמגונן, מלקחיים ומדיה התרבות צריכים להיות סטרילי. אם explants לא שורד היטב, אנטיביוטיקה ניתן להוסיף לתרבות הבינונית (למשל, 0.1% גנטמיצין). פתרונות המכילים גנטמיצין יש חיי אחסון קצרים, ולכן צריכים להיות עשויים טרי ביום שיש לעשות שימוש. פסולת ניידת מכילה פרוטאזות שתהרוסנה לכם את explants לא המוגן, ומקדמת את התפתחות חיידקים. לכן, זה צריך להיות רםVED מבארות התרבות לאחר explants לו סיכוי להחלים.
נתיחות Blastomere מבוצעות במדיום התרבות מדולל (0.1x MBS או MMR 0.1x) כדי להפחית את כוחו של הידבקויות תא לתא. במהלך שלבי ביקוע Xenopus, הידבקות תא מושגת בעיקר על ידי cadherins calcium-/magnesium-dependent. לכן, אין זה הכרחי להשתמש בדיסוציאציה האנזימטית; בעובדה זו יש להימנע משום שהוא מסיר חלבוני שטח שעשויה להיות חשובים בקביעת גורל אירועים. מכיוון שתאים עובריים מקבוצות שונות של ביצים לדבוק בעוצמות שונות, הדילול של מדיום הנתיחה ייתכן שיצטרך להיות מותאם על בסיס אד הוק. אם התאים הם חסיד מדי לנתח מבלי לקרוע אותם, להוריד את הריכוז של מדיום נתיחת השלבים מ0.1x. לעומת זאת, אם את התאים מתפרקים כאשר קרום vitelline מוסר ומאוד דולפים, להגדיל את הריכוז של dissectioמדיום שלבי n. עם זאת, אין להשתמש באמצעי תקשורת calcium-/magnesium-free כי התאים הופכים שבירים מדי להעביר לבארות התרבות. הפרדה מוצלחת של לסטומרים גם תלוי מתי במהלך מחזור התא אחד מבצעת את הנתיחה. כפי שמוצג באיור 2, בשלב המוקדם של מחזור תא מחשוף התלמים הם רדודים ולסטומרים הם שטוחים. מאוחר יותר במחזור מחשוף התלמים עמוקים יותר והתאים יותר מעוגלים. בשלב מוקדם של מחזור התא, יש גשרי cytoplasmic שיגרמו לדליפת cytoplasmic אם נשבר. לכן, תאים גזורים בקלות רבה יותר מאוחר במחזור התא. עוברים 4-סלולריים, עוברים 8-תא, ותאים צמחיים בכל השלבים קשים יותר לנתח כי גשרי cytoplasmic נמשכים זמן רב יותר. אפשר לצפות לשיעור תמותה גבוהה explants האלה, כלומר אחד צריכים לבצע יותר ניתוחים לשחזור גודל מדגם סביר. אפשר לחכות עד לתחילת תלם המחשוף הבא כדי להתחיל dissection של תאים אלה כדי להבטיח שגשרי cytoplasmic נסגרו. בעוד לסטומרים בודדים שנלקחו מ8 - ועוברי 16-תאים לשרוד גם בתרבות, בניסיון שלנו לסטומרים מבוגרים מסתדרים פחות טובים כתאים בודדים. למרות שאנחנו לא יודעים את הסיבה לכך, להישרדות של explants blastomere המבוגר ניתן לשפר על ידי ביתור כמה (2-6) של אותו blastomere מעוברים וculturing שונים יחד בתרבות אחת גם 10, 13, 14.
הליך זה דורש תרגול וקצת מיומנות ידנית. בגלל הזמן בין שסעים הוא טמפרטורה תלוי, זה נוח לאחסון בעוברים 14-16 מעלות צלזיוס להאט מחשוף ולאפשר יותר זמן כדי לבצע את הניתוחים. עם זאת, עוברים לא יסבלו טמפרטורות נמוכות מ 14 ° C. האתגר הראשון בהליך זה הוא להסיר את קרום vitelline. עדיף לא לעבור לנתיחת blastomere עד השלב ראשון זה נעשה במיומנות. כאשר מנתחיםאת blastomere, התא "הידית" עשוי לדלוף ולהתפרק. זה לא בגלל דאגה כאשר כל התאים האחרים התקלפו מהתא הרצוי, התא "הידית" ניתן להסיר עם מלקחיים. שרידי תא הידית כמו גם פסולת אחרות בדרך כלל נופלים כשblastomere מועבר לתרבות היטב (איור 3 ב '). לסטומרים לדבוק בשקיקה לפלסטיק, ולכן משתמש רק pipettes זכוכית כדי להעביר אותם. השתמש בלחץ יניקה מינימאלי על התא, כי זה יכול להתפרק מכוחות הגזירה בפיפטה. כמו כן, להימנע מבועות אוויר בפיפטה ולוודא את קצה פיפטה הוא מתחת לפני השטח של התרבות הבינונית כאשר explant הוא גורש משום שתאים יתפוצצו אם הם נוגעים מפגש של אוויר ומים.
הפרוטוקול מתואר כאן משתמש בעוברי unmanipulated כתורמים לexplants ומדיה מלח פשוטה לculturing. אלה מאפשרים אחד כדי לבחון את היכולת הפנימית של explant לexprESS גורל מסוים. שיטה זו ניתן להרחיב באופן ניסיוני בשתי דרכים. ראשית, תקשורת התרבות ניתן להשלים עם גורמי איתות / צמיחה לבחון האם מולקולות אלה יכולות לגרום explant להביע גורלות אלטרנטיביים. שנית, ביטוי הגנים של העוברים התורמים ניתן לשנות על ידי הזרקה או mRNAs (רווח-of-פונקציה) או oligonucleotides morpholino אנטי תחושה (פסד-of-פונקציה) למבשרים ספציפיים לפני נתיחת blastomere. ניתן לעשות זאת בשלב 1-התא, או באופן ממוקד יותר ב1-2 חלוקות לפני הנתיחה. עם גישות אלה, ניתן לבדוק האם גן ספק exogenously מסוים גורם blastomere לרכוש גורל חלופי, או האם גן אנדוגני מסוים הוא הכרחי לblastomere להביע הגורל האוטונומי שלו (לדוגמה, איור 4 ב). אלה הם גישות ניסיוניות חזקות כי הם לחסל את ההשפעה המבלבלת של התאים האחרים ואיתות centers קיים בעובר ללא פגע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות GWU הרלן המלגה לתמיכה של Paaqua גרנט וGWU לותר רייס המלגה לתמיכה של המונה הרולד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המדע הלאומי MCB-1121711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
