Summary
個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。
Abstract
胚の細胞のすべてをトレース系統から構築運命マップは、組織は、胚の各セルから派生しているが明らかになった。運命マップは臓器の前駆体を識別するための、子孫細胞は正常な胚に、その臓器を移植それによって発達経路を解明するために非常に有用であるが、それらは、前駆細胞の完全な発達の可能性を説明したりするメカニズムを特定することはありませんその運命が決定される。細胞運命のコミットメントをテストするためには、実験的操作後に発現したものと無傷の胚（運命マップ）に子孫の細胞の正常なレパートリーを比較します。細胞の運命は、周囲の細胞環境にかかわらず、（コミット）が固定され、またはそのネイバーが提供する外部要因によって、それに影響を与えていますか？ アフリカツメガエル胚の包括的な運命マップを使用して、我々が識別する方法について説明し、隔離し、文化の単一卵割期の前駆体、blasto呼ばミアズ。このアプローチは、1つは、これらの初期の細胞は、彼らがそれらの隣接細胞との相互作用を必要とし、無傷の胚内でそれらの通常の環境で取得運命にコミットしている、または他のタイプの信号にさらされた場合、代替の運命を表現するために影響を受ける可能性があるかどうかを評価することができます。
Introduction
アフリカツメガエルの胚は、その卵が顕微鏡のアプローチを可能にするのに十分な大きさであるため、胚細胞がその特定の運命を獲得するメカニズムを識別するために広く利用されてきた。各セルには固有エネルギーストアを提供卵黄血小板の豊富な細胞内の供給が含まれているため、さらに、彼らは、培地の栄養補給を必要とすることなく、外部から開発しています。 1、2、3、4、5、6 -細胞の運命が決定されるメカニズムを研究するための重要な資産は、（32セルステージ2〜から）卵割期の割球の運命マップの包括的なセットです。これらのマップは、組織が標識された子孫が移入され、開発の後半にある単一の識別可能な割球および監視に検出可能な分子をマイクロインジェクションすることにより構築した。胚の枢機卿軸は確実に多くのエンブリーで同定することができるため、一貫性のある運命のマップが可能ですOS。植物半球ではないのに対し、第一に、すべての野生型胚において動物半球は、色素沈着です。第二に、受精時の精子のエントリは、将来の腹側に向かって動物半球の色素沈着の収縮を引き起こし、多くの胚では色素沈着の差が故に背側と腹側の側面を区別するために使用することができます。第三に、第一分裂溝は、ほとんどの胚における半ば矢状面を近似し、その結果胚の左右を識別するために使用することができます。運命マップも胚の大規模な人口全体の各割球が識別できるように規則的なパターンで自然に受精卵が頻繁に開裂するという事実に依存しています。内および色素沈着および切断パターンに関する卵のクラッチの間にばらつきがあるが、本明細書に記載の選択手順を使用すると、所定の運命を有する細胞が約90％の精度で識別することができます。
細胞の運命が決定することができますいくつかのメカニズムで胚発生時の採掘。そのような差別的継承細胞質mRNAまたはタンパク質などの本質的な要因は、早期のパターニングのいくつかの側面に貢献しています。たとえば、特定の母性mRNAは細胞は、生殖系列に寄与する内胚葉になったり、背側体軸（7日）に寄与するかを決定します。胚の情報伝達の中心から隣接セル以上の遠縁でローカルに提供外因性の要因は、ほぼすべての臓器系の特定の組織の種類とパターン形成を誘導するための責任を負うものとします。シグナリングセンターの例には、神経外胚葉と中胚葉のパターンを誘発原腸胚におけるオーガナイザー/ノード、および肢芽のパターンは前後軸という活動を偏光の帯があります。運命マップが異なる器官の前駆体を識別し、正常な胚でその子孫によって取ら発達経路を明らかにするが、それらは本質的な区別はできませんそして、それらの細胞に外因性の影響。彼らはまた、子孫胚の複雑な信号環境において分化細胞の完全な発達の可能性を明らかにしない。で培養した胚に由来する細胞の除去または2）;小説胚の場所に）1細胞の移植：2つの実験的なアプローチは、細胞の運命は、内因性の要因によって決定されたか、後に外部の要因によって影響されているかどうかをテストすることができます外因性シグナルの不在。
細胞が手動で分離するのに十分な大きさであるため、両方の実験的なアプローチは、 アフリカツメガエルで実現可能となっている。たとえば、多くの研究は、運命の変更（7日、8、9）をテストするために宿主胚における新規の場所に胚（細胞間相互作用を変更する場合）または移植された細胞からの単一細胞を削除しました。さらに、胚の異なる領域から細胞の数が少ないexplantingの第二のアプローチIアフリカツメガエル胚の細胞は、細胞内の栄養素ストア、卵黄血小板で埋められるため、外因性因子の非存在下で誘導組織の相互作用を解明するNTOの培養が可能です。したがって、彼らは、培地の栄養や成長因子の補充なしで定義された塩培地で数日間培養することができる。私たちは、その背の動物の球が母性遺伝mRNAが10、11に起因する神経と背側中胚葉組織を生成するために自律的能力を持っており、他は32細胞割球と中胚葉の仕様では、内因性及び外因性情報12の両方に依存して認められた表示するには、このアプローチを使用していた。外植体として、細胞を培養することの利点は、媒体は、外植セル12、13、14の運命に影響を及ぼす可能性のある細胞間の通信経路を決定するために定義されたシグナル伝達因子を補充することができることである。また、1割球はPRを注入することができます内因性mRNAの翻訳を防止するために過剰発現するmRNAの遺伝子を持つ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた文化にIOR。これらは、ゲインとロス·オブ·機能解析は、自律的に発現して運命のために必要とされる分子を識別することができます。外植片の運命を分析するには、特定の細胞種の同定は標準の遺伝子発現（ 例えば、in situハイブリダイゼーション 、RT-PCR）と免疫細胞化学的ア ッセイにより行うことができる。このプロトコルは、胚細胞が特定の組織に発展する方法を制御内因性および外因性のメカニズムを区別するための簡単かつ強力な方法を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。器具、培地や料理の準備
- アルミナ研磨フィルムを使用して4鉗子を強めています。チップサイズを監視するために解剖顕微鏡下でこれを行います。先端が処置中に損傷している場合には鉗子1組のバックアップとして機能します。すべての4つの鉗子をオートクレーブ滅菌した容器に保管してください。
- （; 15のレシピどちらMarcの修正リンガー[MMR]または改変バルトの生理食塩水[MBS]）とフィルター滅菌500ミリリットル0.1Xと1.0X培地のそれぞれを確認します。我々は日常的にMBSを（; 1のKCl、0.7 mMのCaCl 2、1mMののMgSO 4、5mMのHEPES [pHが7.8]、2.5 mMのNaHCO 3を 1X = 88 mMのNaCl）を使用します。ヶ月間の14から18℃で保存する。
- 培養液中の2％アガロース溶液（スクリューキャップのガラスボトルで100ミリリットル1X培地で2グラム電気泳動グレードアガロース）を作る。アガロースを溶解するためにオートクレーブ。これは、月間4℃で保存し、それが次の必要なときにアガロースを液化するために電子レンジにすることができます。
- アガロースは液体ですが、滅菌24穴培養プレートの各ウェルの底に約0.5ミリリットルを注ぐ。これはプラスチックに付着する外植片を防ぐことができます。
- アガロースは液体ですが、二から三60ミリメートルペトリ皿の底に約2-3ミリリットルを注ぎ、そして渦巻きは優しく底が覆われていることを確認する。これらは、解剖皿となるとその膜が除去された後、アガロースは、プラスチックに付着胚を防ぎます。
- アガロースを冷却し、硬化、火炎6 "パスツールピペットの先端を、それがボールに溶けるまで、軽く培養プレートの各ウェルにおけるアガロースの表面に接触させてください。これは、先の浅いうつ病が作成されたとき植が配置されます。
- 1X無菌培養培地で培養プレートの各ウェルを埋める。
- アガロースが冷却し、硬化したときに、割球分離を容易にするために希釈された培養液（0.1X MMRまたは0.1X MBS）と解剖皿を埋める。
2。胚の選択
- 受精卵を取得し、標準的なプロトコル15に従ってゼリーコートを除去する。 100ミリメートルペトリ皿に0.5X培地に移す。
- 胚は2細胞期に達すると、最初の分裂溝が別の皿に動物半球（ 図1）で軽く色素沈着面積を二等分したものをソートする。これらは、外植片のドナーになります。外植片を上演する兄弟コントロールとして機能するための手順を通してドナー胚の隣に別の皿に残りの2細胞期胚を保管してください。
3。外植片の作製
- 解剖皿に5月10日胚を置くのではなく、一度に1つの胚に取り組んでいます。
- 透明卵黄膜が見られるように、最初の胚を置き、それは、胚の動物極の表面上に透明な空間（腔）で区切られています。尖った力を利用して1のサブドミナントの手（1が右利きされている場合は左手）のps、腔上記の卵黄膜を把握する。一方で削った鉗子を使用して、最初の鉗子先端に近い膜を持ち、静か膜剥がれ反対方向に引っ張る。標的細胞は、膜の除去の際に破損していないので、解剖するセルからの距離で初期把握を行います。一つは、胚が平らになるため、膜が除去されたことを伝えることができます。
- サブドミナント手にピンセットで1隣接セルをつかんで、解剖すべきセルが直接触れないように "ハンドル"としてこのセルを使用しています。一方で鉗子で、優しく希望の割球から離れて残りの隣接セルを引っ張る。同じ運命を共有して正中線細胞は、標的にされている場合は、それらがペアとして一緒に削除することができます。最後に、 "ハンドル"のセルを離れて解剖する。
- 滅菌済みの割球（または割球ペア）、拾う、ガラスパスツールピペット、気泡や過度の吸引を避ける。ピペットは、細胞に損傷を与えることができますが、我々が日常的にこれをしないシャープなエッジを除去するために火を研磨することができる。外植片培養皿のウェル中の培地の表面の下にパスツールピペットの先端を置き、静かに割球を追放。それは、重力によって浅いくぼみにスライドしなければなりません。複数の胚から割球は、同じ単植に結合することができます。
- 一つずつ、解剖皿の残りの胚では、この手順を繰り返します。約10胚の後、解剖皿細胞の残骸で満たされるでしょう。この現象が発生した場合、新鮮な解剖皿に変更します。
- すべての解剖が行われた後、外植片が浅いくぼみにあるかどうかを確認。しない場合、それらは静かに乾燥させ、70％エタノールと空気中で滅菌された毛のループを使ってうつ病に押し込むことができます。
- 最後の郭清後の約一時間、デブリsurrouを削除滅菌、ガラスパスツールピペットで癒さ植片をnding。
- 兄弟、制御の胚を含むペトリ皿に14から20°Cの隣での培養外植片の板を。兄弟の胚は、割球の外植片の発展段階を示すでしょう。
4。分析のための収穫植
- 兄弟姉妹が希望発達段階に到達したときに外植片を回収します。細胞の一部が崩壊した場合でも、これらの外植片はかなりうまく生き残る。文化の中で曇りの質量が十分に存在する場合、したがって、健康な植が内に埋設されているかどうかを判断するために毛のループまたは鉗子でそれを探る。
- ガラスパスツールピペットを用いて培養液を少量の外植片を拾うと、優しく行われるアッセイのための適切な固定剤または溶解バッファにそれらを追放する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
正確に細胞の発生能を評価するために、このアッセイの能力は運命マップ1、2、3、4、5、6に基づいて、適切な割球を解離に依存している。したがって、それは続いて、 図2に示すように、定期的な切断パターンに準拠し、 図1に示すように、2細胞期に正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択することが重要です。一つは、彼らが必要な切断段階に達するようにソート胚を観察し、不規則な開裂を示す胚を分離した場合、精度が大幅に向上します。 図2に示すように、定期的な開裂はしばしば唯一胚の片側に起こります。ドナー細胞は、 "通常"側から発信された場合、これらの胚は、ドナーとして使用することができます。あなたが解剖するつもりのようなので定期的な切断パターンは、多くの胚を5倍程度の細胞分裂が進行し、ソートのような少数の胚で発見されています。当然Fertilized卵は体外受精卵よりも定期的な開裂を持っている傾向がある。切断パターンは、卵のシングルクラッチ内でかなり変化しますが、1は、操作のこの種のために有用であることが少なくとも10〜20％を期待することができます。
割球は、単独で、または少人数のグループで培養することができる。割球が最初に（ 図3A）解剖し、ウェル培養（ 図3B、C）に転送されると、彼らは柔らかく、壊れやすいです。我々の経験では、動物と赤道割は植物球（ 図3C）よりもはるかに細かく分析しやすいと文化です。彼らは小さいので、おそらく、彼らは転送が容易になります。彼らはまた、鉗子で切れ目の入ったときに、より迅速に治癒するように見える。植物細胞は、しばしば解剖したときに、それらをより "漏れ"を作ること、もっとゆっくり、したがって細胞質分裂を完了姉妹細胞と細胞質の橋を維持するように見えるし、その細胞膜は、損傷に対してより脆弱で簡単です。文化の中で約1〜2時間後、外植割球（s）は約4倍で割った、損傷した隣接セル（ 図3D）からの残りの破片のほとんど剥がれ落ちているでしょう。 20時間後、彼らは細胞（ 図3E）の小さな、頑丈なボールを形成している。一部は瓦礫の中に埋もれているかもしれない間、しばしば健康な質量が（ 図3E、左 ）を発見することができます。
外植体は小さいですが、彼 らは1つが後の遺伝子発現を監視することができますin situハイブリダイゼーション法だけでなく、より一般的に使用されるアニマルキャップの外植片にするための処理を生き残る。 図4Aに示す実験では、2つの背割（D1.1）または2つの腹側割球（V1.1）は16細胞期で解剖し、14で1X MBSで培養℃の兄弟胚が初期の神経板の段階に到達するまで（ST12-13、解剖後に20から22時間程度）。各サンプルは、神経板接合体遺伝子（Sox2の発現についてアッセイした</ em>）をin situハイブリダイゼーションにより（青色反応生成物）。このアッセイは、神経板の前駆体である背動物球、、の大部分は胚の他の地域からの追加の合図なし、つまり、自律的にSox2のを表現できることを示しています。 Sox2のを発現していないそれらの外植片を誤って解剖の時に確認されている可能性があります。対照的に、腹側表皮、急行Sox2の前駆体である腹動物球、のどれも。従って、我々は腹動物割球はそうではない背動物割球は、神経組織を形成する固有の能力を持っていると結論付けている。これらの球も無傷胚3、片培養急行で脊索のマーカータンパク質10に脊索を形成するように運命づけされています。D1.1外植片のいくつかはまた、背側中胚葉形成を示す形態をeIongatedていることに注意してください。割球本質的な運命はaltereすることができます前mRNAのマイクロインジェクション（機能獲得型）またはアンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド（;の機能喪失型MOS）によるd。 図4Bに、母性発現する神経系遺伝子、foxD5 16、17、内在性レベルを変更することの効果がテストされます。 FoxD5の内因性レベルはV1.1の8細胞前駆体の割球（下の行）にfoxD5 mRNAを注入することにより増加した場合、V1.1の外植（ST 12から13になるまで培養）の大半は、Sox2のを表明した 。逆に、FoxD5の内因性レベルはD1.1（一番上の行）の8細胞前駆体の割にMOの注入によって減少したときに、D1.1わずか外植片は、（ST 12から13になるまで培養）Sox2のを （と比較して発現して図4Aの一番上の行）。これらの実験は、foxD5の母性発現が神経運命を獲得する背側割球の固有の能力で役割を果たしていることを示している。
ftp_upload/4458/4458fig1.jpgの "alt ="図1 "/>
図1：自然に受精卵から2細胞期胚における色 素沈着のパターン。第一分裂溝が矢印で示されます。 A）は、胚の動物半球の軽く色素沈着領域が1つのセル（左側）で主に含まれているため、後の段階で割球を識別するために使用すべきではない胚の一例を示している。第一分裂溝が胚の中央矢状面を予測するので、この胚の軽く着色された領域は、背特定するものではありません。 B）が植培養にソートされている必要がある胚の2つの例が。両方では、動物半球（*）の軽く着色された領域は、第一分裂溝によって二分されています。左の胚は最初のセルサイクルの早い段階で、軽く色素沈着領域が細胞表面の約25％にのみ表示されます。右側の胚は、最初の細胞周期の終わりに近づいており、顔料VEは移転しましたntrallyので、2つの細胞の背側半分は軽いです。その結果、後の段階で軽く色素沈着動物細胞は、背側（d）を予測すると暗く色素沈着動物細胞（v）は腹が予測されます。
図2：自然に受精卵から卵割期胚の例。すべての胚がトップに背、リーダーが直面している動物極と向いている。 4）細胞胚。裂が浅い畝ので左の胚はちょうど2番目の細胞周期に入っている。切断が深い、細胞がより丸みを帯びたように見えるしわ右側胚は、ほぼ第二細胞周期を完了しました。黒い矢印は、最初の分裂溝の順にポイントし、赤い矢印は第二分裂溝を指す。 B）8細胞期胚。左の胚は早い第三細胞周期され、右側には胚が近くにある第三細胞周期の終わり。 C）は16細胞期胚。 C 'は避けるべき不規則な開裂の一例です。 Cは "正規腹側の開裂が、背側に凹凸の例です。C'' '背側ではなく、腹側より定期的開裂の一例です。C''''例です。正中線での定期的な開裂のではなく、横方向に。D）は32細胞期胚。D 'は腹側の定期的な開裂の例ですが、背側に不規則。D''は、背側で定期的開裂の一例です側ではなく、腹側、D'' '右側のレギュラー裂の例ですが、左側により不規則な切断。E）は64細胞期胚。これらの段階の概略については、以下をご参照ください（オンラインで見つけることができNieuwkoopとフェーバーステージングシリーズ、 http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ）。
図3自然に受精卵から16細胞期胚からの外植片。まもなく郭清後のA）が腹動物割球。矢印は "ハンドル"は、細胞の残骸を示します。 B）は腹動物割球は、一度割った培養ウェルに移し。まもなく郭清後のC）の腹側割球植物。動物の割球に比べて、これらは大きく、操作が難しくなります。 D）の二腹動物割球の外植片、郭清後の2時間は、4回くらい分けている。左の外植片は、割球の元、着色外面から見て、右側の外植片は、割球の元、無着色の内面から見たものです。 E）の二腹動物割球の外植片は、24時間培養した。右の外植片は、任意の残骸の自由であるのに対し、左側の外植片は、細胞の残骸（矢印）のベッドに座っている。すべての画像は50Xマニフィカトにあるイオン。
（4）自然に受精卵から解剖16細胞割球由来の外植片における遺伝子発現のin situハイブリダイゼーション解析では図。A.左に16細胞胚での結果の外植した背割·ペア（D1.1）を示している一番上の行、下の行の結果のために外植した腹側割球のペア（V1.1）。 uninjected胚から割球解剖ペアは培養ウェルに0.1X MBSの中に入れ、約20時間14℃でインキュベートした。彼らは、固定液のチューブに回収し、接合子ニューラル遺伝子、Sox2の発現のためのin situハイブリダイゼーションによって処理されます。8細胞期胚の割球は、Bの両側のいずれかに注射したたfoxD5 MOSで、腹側割球における内因性発現を増加させるために背側割球、またはfoxD5 mRNAと内因性発現を減少させる。注入された胚は16細胞期（20〜30分後）に達したときに、割球のペアは、のように、in situハイブリダイゼーションにより、解剖培養し、分析した。急行Sox2のが大幅foxD5 MOS（一番上の行と比較）を注射したD1.1植片に低減されていることを外植片の数。急行Sox2のが大幅foxD5のmRNA（の一番下の行と比較）を注射したV1.1の外植片に増加していることを外植片の数は。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ほとんどの個々の割球の培養に成功するための重要なステップは次のとおりである：1）正常に関心の割球を識別する、2）滅菌した、健全な文化を維持すること、3）細胞周期の正しい部分の解剖細胞、4）必要なマニュアルを開発解剖や文化への転送だけでなく時の損傷を防止するための器用さ。
特定の割球を操作するには、カーディナルの軸を識別できることが不可欠です。 アフリカツメガエル胚では、背側には、3つの方法によって同定することができます：（1）生体色素18,19と精子のエントリポイントをマーキングし、（2）in vitroでの転倒が卵を受精し、片側18、19をマーク、または（3）第一分裂溝が動物半球20,21で軽く着色された地域を二分した2細胞期胚の間を選択する。我々は正確に自然にfertilizから割球を識別する第3の方法を使用します例20、21の約90％のED 16細胞期胚。受精時、動物半球の色素沈着は、背動物領域が胚の大部分（ 図1）より少ない色素沈着になることを引き起こして、腹側の精子のエントリー·ポイントに向かって契約を開始します。クラッチにわたっており、 アフリカツメガエルの卵のクラッチ内のこの軽く着色された領域の範囲にはかなりのばらつきがあります。第一分裂溝が均等に2つの娘細胞の間で、この明るい領域を二分する場合は、明るい領域は、背側の指標として用いることができ、第一分裂溝は半ば矢状面を示しているという。後の段階で色素沈着が正確に背側を特定するものではありませんので、最初の分裂溝が1暗いセルと1光セルに娘を分離している場合、外植片には使用しないでください。これまでの研究では、胚のこれらの種類の最初の分裂溝がtのためのマーカー残っていることを示した軽く着色された地域に対し、彼は半ば矢状面は、もはや背側20、21を示さなかった。第一畝間が完了しなければならず、第二畝間ない;胚はまた、第1および第2の植物極に畝がまだ区別できる4セル裂（ 図2Bで左胚）の初めの部分で選択することができますまだ完了してください。しかし、識別することができなくなった、と軽く色素沈着細胞がわずか約の背側のものを使用することができるものは、胚（ 図2Bの右胚）を選択するには、4細胞期の終了まで待機第一及び第二の切断は畝場合胚20、21の70％。これは、はるかに少ない正確な特定の割球をターゲットにレンダリングされます。これは、最初の分裂溝に軽く着色された地域を二分した胚の割合は全体でクラッチを大いに変化することに注意すべきである。我々の経験では、彼らは80 <にクラッチで卵の50％>を占めることクラッチの卵の％。それにもかかわらず、ほとんど常に植実験をサポートするために、この基準を満たす健康な卵のクラッチ内に十分な卵があります。
2つの推奨培地（MMR、MBSは）事実上互換性があり、異なるラボの環境設定は、主に歴史的なものです。 MMRは、年以上の10Xソリューションとして保存することができます。それは重炭酸塩で緩衝されているため、MBSは短い貯蔵寿命を持っています。胚および外植片は保護ゼリーと卵黄膜せずに細菌感染に屈する可能性があるため、鉗子と培地は無菌でなければならない。外植片がうまく生きていけない場合には、抗生物質は、培養培地（ 例えば 、0.1％ゲンタマイシン）に追加することができます。ゲンタマイシンを含む溶液は、短い貯蔵寿命を有するので、それらが使用される日に新鮮なされるべきである。細胞残骸は、保護されていない外植片を損傷するプロテアーゼが含まれており、細菌の増殖を促進します。したがって、それはサンレモでなければなりません外植体が治癒する機会があった後に培養ウェルからVED。
割球解離は細胞から細胞への癒着の強さを軽減するために、希釈した培養培地（0.1Xまたは0.1X MBS MMR）で実行されます。 アフリカツメガエル卵割段階で、細胞接着は主calcium-/magnesium-dependentカドヘリンすることによって達成される。したがって、酵素的解離を使用する必要はありません、それは運命決定のイベントで重要であるかもしれない表面タンパク質を除去するため、実際にはこれは避けるべきである。卵の異なるバッチからの胚細胞はさまざまな長所と準拠しているため、解剖培地の希釈は、場当たり的に調整する必要があります。細胞はそれを引き裂くことなく解剖するには余りにも付着している場合、0.1Xから段階的に切開媒体の濃度を下げてください。逆に、細胞が卵黄膜が除去されたときにバラバラになると非常に漏れている場合、dissectioの濃度を増加させる段階的にnの媒質。細胞が培養ウェルに移すにはあまりに脆くなるので、calcium-/magnesium-freeメディアを使用しないでください。割球の分離成功はまた、細胞周期の間に1が解剖を行い、時期によって異なります。 図2に示すように、初期の細胞周期における開裂が溝は浅く、割球は平坦化されています。後のサイクルで開裂が溝が深くあり、細胞がより丸みを帯びています。細胞周期の早い段階で、壊れた場合に細胞質の漏れの原因となり、細胞質の橋があります。したがって、細胞がより容易に細胞周期の後半に解剖されています。すべての段階で4細胞期胚は8細胞期胚、及び植物細胞は細胞質の橋が長く存続するため解剖するのが困難なものです。一つは、合理的なサンプルサイズを取り戻すため、さらに解剖を行うために1つのニーズを意味し、これらの外植片のために高い死亡率を予測することができます。一つはdisseを開始する次の分裂溝の初めまで待つことができます細胞質の橋が閉じていることを保証するために、これらの細胞のction。単一割球が8から取られているが - 、16細胞期胚は、私たちの経験では、文化の中でうまく生き残る古い割には、あまり単一細胞として運賃。我々はこの原因がわからないが、古い割球植片の生存率は、単一の培養ウェル10、13、14で一緒に別の胚と培養することから同一の割球の（2-6）は、いくつかを解剖することによって改善することができる。
この手順では、練習といくつかの手先の器用さを必要とします。開裂の間の時間は温度に依存するので、切断を遅くして、より多くの時間が解剖を実行できるようにするために14から16℃で胚を登録しておくと便利です。しかし、胚は、14℃より温度が低い許容しないでしょうこの手順の最初の課題は、卵黄膜を除去しています。それは、この最初のステップが習得されるまで割球解離に移動するのが最善ではありません。解剖時割球アウト、 "ハンドル"細胞が漏れてバラバラになる可能性がある。これは、一度、他のすべての細胞が所望の細胞から剥離しているため、 "ハンドル"セルが鉗子で除去することができる問題ではありません。割球をウェル培養（ 図3B）に転送されるときに、ハンドルのセルの残党だけでなく、他の破片は通常落ちる。割球は、プラスチックに貪欲に固執するので、それらを転送するだけでガラスピペットを使用しています。それはピペットでせん断力から崩壊する可能性があるため、細胞を最小限に抑え、吸引圧力を使用しています。また、ピペット内の気泡を避け、彼らは空気 - 水界面に触れると細胞が爆発的に増えるので、外植片は、追放されたとき、ピペットの先端が培地の表面の下にあることを確認してください。
本明細書中で説明されたプロトコルは培養するための外植体とシンプルな塩のメディアのためのドナーとしてunmanipulated胚を使用しています。これらは、1つのexprに外植片の固有の能力をテストすることができ特定の運命をESS。この方法は、実験的に2つの方法で拡張することができます。まず、培養培地は、これらの分子が外植片は、代替の運命を表現するために引き起こすことができるかどうかテストするためにシグナリング/成長因子を補充することができます。第二に、ドナー胚の遺伝子発現は、割球解離前に特定のmRNA前駆体に（機能獲得型）またはアンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド（機能喪失）のいずれかを注入することによって変更することができます。これは、1セルの段階で、または事前解剖1-2細胞分裂で、よりターゲットを絞った形で行うことができます。これらのアプローチでは、1は、特定の外因的に供給遺伝子が代替運命を獲得する割球が発生し、または特定の内在性遺伝子（ 例えば 、 図4B）、その自律型運命を表現する割球のために必要であるかどうかどうかをテストできます。彼らは他の細胞とシグナル伝達CEの交絡影響を排除するため、これらは強力な実験的なアプローチであるntersは、無傷の胚に存在する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者はモナヘロルドのサポートのためのPaaquaグラントとGWUルーサーライスフェローシップのサポートのためGWUハーラン·フェローシップを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団助成MCB-1121711によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
